Summary
שיטה מתוארת כדי ליצור אורגנואידים באמצעות קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) עבור הקרנת במבחנה, וכתוצאה מכך זוגות תואמים של מודלים in vivo / in vitro. גידולי PDX נקצרו/ עובדו לחתיכות קטנות באופן מכני או אנזימטי, ואחריו השיטה של החכמים לגדל אורגנואידים גידולים שהיו מעבר, cryopreserved ומאופיין נגד PDX המקורי.
Abstract
קסנוגרפטים של גידולים שמקורם בחולה (PDXs) נחשבים למודלים הפרה-קוליניים החזויים ביותר, שהאמינו כי הם מונעים על ידי תאי גזע סרטניים (CSC) להערכת תרופות לסרטן קונבנציונליות. ספרייה גדולה של PDXs משקפת את המגוון של אוכלוסיות המטופלים ובכך מאפשרת ניסויים פרה-קליניים מבוססי אוכלוסייה ("ניסויים קליניים בעכבר דמוי שלב II"); עם זאת, PDX יש מגבלות מעשיות של תפוקה נמוכה, עלויות גבוהות ומשך זמן ארוך. אורגנואידים גידול, גם להיות חולה נגזר CSC מונחה מודלים, יכול להיחשב המקבילה במבחנה של PDX, להתגבר על מגבלות PDX מסוימות להתמודדות עם ספריות גדולות של אורגנואידים או תרכובות. מחקר זה מתאר שיטה ליצירת אורגנואידים שמקורם ב- PDX (PDXO), וכתוצאה מכך מודלים מזווגים למחקר במבחנה ובפרמקולוגיה של vivo. גידולים PDX-CR2110 מושתלים תת עורית נאספו מעכברים נושאי גידול כאשר הגידולים הגיעו 200-800 מ"מ 3 , לכלהליךנתיחה מאושר, ואחריו הסרת הרקמות הלא גידול הסמוך וניתוק לתוך שברי גידול קטנים. שברי הגידול הקטנים נשטפו והועברו דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי להסיר את ההריסות. אשכולות תאים נאספו והושעו בתמצית קרום מרתף (BME) וציפוי בצלחת 6 בארות כמו טיפה מוצקה עם מדיה נוזלית שמסביב לצמיחה באינקובטור CO2. צמיחת האורגנואידים נוטרה פעמיים בשבוע תחת מיקרוסקופיה קלה ותועדה על ידי צילום, ואחריו שינוי בינוני נוזלי 2 או 3 פעמים בשבוע. האורגנואידים הגדלים הועברו עוד יותר (7 ימים לאחר מכן) ביחס של 1:2 על ידי שיבוש האורגנואידים המוטבעים של BME באמצעות גזירה מכנית, בסיוע תוספת של טריפסין ותוספת של 10 מיקרומטר Y-27632. אורגנואידים היו cryopreserved בצינורות קריו לאחסון לטווח ארוך, לאחר שחרור מ BME על ידי צנטריפוגה, וגם נדגמו (למשל, DNA, RNA ו בלוק FFPE) עבור אפיון נוסף.
Introduction
סרטן הם אוסף של הפרעות גנטיות ואימונולוגיות מגוונות. פיתוח מוצלח של טיפולים יעילים תלוי מאוד במודלים ניסיוניים המנבאים ביעילות תוצאות קליניות. ספריות גדולות של קסנוגרפטים מאופיינים היטב שמקורם בחולה (PDX) כבר זמן רב נתפסו כתרגום במערכת vivo של בחירה לבדוק טיפולים כימותרפיים ו / או ממוקדים בשל יכולתם לשחזר את מאפייני הגידול בחולה, הטרוגניות ותגובת תרופת המטופל1, ובכך לאפשר ניסויים קליניים עכבר דמוי שלב II כדי לשפר את ההצלחה הקלינית2,3. PDXs נחשבים בדרך כלל מחלות תאי גזע סרטן, שמציעות יציבות גנטית, בניגוד קו התא נגזר xenografts2. במהלך העשורים האחרונים, אוספים גדולים של PDXs נוצרו ברחבי העולם, להיות סוס העבודה של פיתוח תרופות לסרטן היום. למרות בשימוש נרחב עם ערך תרגום גדול, מודלים אלה בעלי חיים הם יקרים במהותם, זמן רב ותפוקה נמוכה, ולכן לא מספיק עבור הקרנה בקנה מידה גדול. PDX הם גם לא רצויים עבור בדיקות אימונו-אונקולוגיה (IO) בשל אופי חיסוני נפגע4. לכן זה לא מעשי לנצל את מלוא היתרונות של הספרייה הגדולה הזמינה של PDXs.
תגליות אחרונות, חלוץ המעבדה של הנס חכם 5 , הובילו להקמתתרבויותבמבחנה של אורגנואידים שנוצרו מתאי גזע בוגרים ברוב האיברים האנושיים ממוצא אפיתל5. פרוטוקולים אלה כבר מעודן עוד יותר כדי לאפשר את הצמיחה של אורגנואידים מן CSCs הניח קרצינומות אנושיות של אינדיקציות שונות6,7. אורגנואידים אלה שמקורם בחולה (PDOs) הם genomically-יציב8,9 הוכחו להיות חיזוי מאוד של תוצאות הטיפול הקליני10,11,12. בנוסף, האופי במבחנה של PDOs מאפשר סינון תפוקה גבוהה (HTS)13, ובכך פוטנציאל מציע יתרון על דגמי vivo ומינוף ספריות אורגנואידים גדולות כפונדקאי של אוכלוסיית המטופלים. PDOs צפויים להפוך לפלטפורמת גילוי ותרגום חשובה, להתגבר על המגבלות הרבות של PDXs המתוארות לעיל.
הן PDO והן PDX הם מודלים שמקורם בחולה ומונעים על ידי CSC, עם היכולת להעריך טיפולים בהקשר של טיפול מותאם אישית או פורמט ניסוי קליני. ספריות גדולות קיימות של PDXs, כמו האוסף הקנייני של >3000 PDXs14,15,16,17, ולכן מתאימים לייצור מהיר של ספריות של אורגנואידים הגידול (אורגנואידים נגזר PDX, או PDXO), וכתוצאה מכך ספרייה תואמת של דגמי PDX ו- PDXO מזווגים. דו"ח זה מתאר את ההליך כדי ליצור ולאפיין סרטן המעי הגס PDXO-CR2110 ביחס PDX-CR2110 ההורי שלה מודל16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים והתיקונים או ההליכים הכרוכים בטיפול ושימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לפני ביצוע המחקרים. הטיפול והשימוש בבעלי חיים נערך בהתאם להנחיות הבינלאומיות של AAALAC (האגודה להערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה) כפי שדווח במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מועצת המחקר הלאומית (2011). כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים היו בתנאים סטריליים במתקני SPF (ספציפיים ללא פתוגן) ובוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ממוסדות ממשלתיים שונים (למשל, המכונים הלאומיים לבריאות). הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים במוסד המתקן (למשל, ועדת IACUC מוסדית).
1. הכנה להשתלת גידולים
-
דיור לבעלי חיים
- בית Balb / c עכברים עירומים (n = 5) בכלובים מאווררים בודדים, ב 20-26 מעלות צלזיוס, 30-70% לחות, ומחזור תאורה של 12 שעות אור / 12 שעות כהה, עם מצעים קלח תירס השתנה מדי שבוע, ומזון גרנול יבש מעוקר הקרנה בתוספת ליביטום מודעת מי שתייה סטריליים.
-
הכנת שבר גידול תורם
- עקוב מקרוב אחר עכברים תורמים הנושאים גידולים עבור משקל הגוף (BW, באמצעות איזון שקילה), ונפח הגידול (טלוויזיה, על ידי מדידת caliper).
- כאשר הטלוויזיה מגיעה 800-1000 מ"מ3, המתת חסד את בעלי החיים נושאי הגידול במכסה המנוע biohazard.
- מניחים עכברים בתא המתת חסד עם מכסה המספק גז CO2 לתוך התא. פליטת גז לתוך התא בקצב זרימה שמייצר חוסר הכרה מהיר עם מצוקה מינימלית לבעל החיים. קצב הזרימה האופטימלי של CO2 הוא בסביבות 2-2.5 לדקה.
- להבטיח המתת חסד על ידי התבוננות כי בעלי החיים אינם חוזרים להכרה.
- לאחר מוות קליני לכאורה, לשמור על זרימת הגז במשך >1 דקות כדי למזער את האפשרות כי בעל חיים עשוי להתאושש.
- לעקר את העור סביב הגידול באמצעות ספוגיות יודפור. לאסוף גידולים על ידי הסרת רקמות סמוכות שאינן גידול הצבת צלחת פטרי המכיל 20 מ"ל של PBS, מראש מצונן (4 מעלות צלזיוס) לפני המתת חסד.
- לשטוף את הגידולים עם PBS בצלחת פטרי אחרת כדי להסיר את מרכיבי הדם ואחריו חיתוך לחצי והסרת כל עור נוסף, כלי דם, הסתיידות ו / או נמק.
- מניחים רק חתיכות גידול שלמות לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל צנטריפוגה עם 20 מ"ל של PBS, לפני הובלה לחדר בעלי חיים נפרד להשתלה.
2. גידול תת עורי
-
חיסון תת עורי של חתיכת הגידול לעכברים immunocompromised
- חותכים את הגידול PDX לחתיכות 2 מ"מ עם אזמל, ומניחים כל אחד לתוך trocars להשתלה תת עורית (SC).
- יש למרדים את בעלי החיים המקבלים עם 5% isoflurane (מתוחזק על ידי חרוט אף ב-1%). בעלי החיים נרגעים, מאבדים את הרפלקס הימני שלהם ובסופו של דבר הופכים ללא תנועה, עד שהם לא מגיבים לכאב. לתקן את העכברים מורדמים על לוח ניסוי במצב לרוחב הנכון לעקר עם ספוגיות יוד, במיוחד באזורים המקיפים את האתר של חיסון הגידול.
- על העור האגף השמאלי רק גולגולתי לירך, לעשות חתך 0.5 ס"מ עם אזמל וליצור מנהרה מתחת לעור לכיוון forelimb, 2-3 ס"מ, באמצעות מלקחיים קהים.
- מעבירים באופן לא נכון קוביה אחת של שבר גידול לכל אתר חיסון מהמדיום ומניחים עמוק בתוך המנהרה התת עורית. אישור חזותי של המיקום של הרסיס לפני סגירת הפצע עם קליפים פצע.
- לפקח על העכברים המושתלים הגידול (5) עד שהם הופכים מודעים לשמור על כבידה קשה, ולאחר מכן להחזיר אותם לכלוב שלהם רק לאחר החלמתם המלאה מהרדמה.
-
ניטור בריאות עכברים נושאי גידולים
- בדוק את צריכת המים והמזון מדי יום ותקליט את משקל הגוף מדי שבוע.
- בדוק את העכברים במהלך ניטור שגרתי. רשום השפעות כלשהן על ניידות, נשימה, טיפוח ומראה כללי, צריכת מזון ומים, רווח/אובדן BW, מיימת וכו '.
- למדוד טלוויזיה פעמיים בשבוע באמצעות calipers ולהביע מ"מ3 לכל: טלוויזיה = 0.5 × b2, שבו a ו- b הם אורך ורוחב הגידול, בהתאמה.
- להקריב בעלי חיים כדי לאסוף דגימות כאשר כל אחד מהסימנים הבאים מופיעים: אובדן BW >20%; ניידות לקויה (לא מסוגל לאכול או לשתות); לא מסוגל לזוז בדרך כלל בשל מיימת משמעותית או בטן מוגדלת; מאמץ בנשימה; מוות.
3. נקרופסיה וקציר גידולים
- כאשר נפח הגידול הגיע 200-800 מ"מ3, המתת חסד עכברים לכל פרוטוקולים שאושרו (ראה שלב 1.2.2).
- לאסוף רקמות הגידול על ידי הסרת רקמות סמוכות שאינן גידול, ואחריו הצבת הרקמה בצינור פלסטיק 50 מ"ל עם AD +++ (על קרח) לפני ניתוק.
4. הכנה לתרבות האורגנואידים הנגזרת מ- PDX
הערה: כל השלבים הבאים בוצעו בתוך ארון biosafety לכל הנחיות סטנדרטיות של תרבית רקמות. שמרו על מלאי מחומם מראש של צלחות 96, 24 ו-6 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- הכנות ריאגנטיות
- הכן תמצית קרום מרתף (BME) פתרון (גורם גדילה מופחת, פנול אדום חינם). יש לשמור 10 מ"ל של BME במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הפשרה, מערבולת בקבוק BME כדי להבטיח פיזור.
- הכן מדיה בסיסית/מאגר כביסה AD+++. הוסף 5 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין, 1 M HEPES ועט / סטרפטוקוקוס למדיה מתקדמת DMEM / F12 על ידי pipetting עם פיפטה 5 מ"ל.
- הכן מדיום אורגנואיד המעי הגס כמתואר על ידי סאטו ואח '.18 באמצעות הוספת מדיה בסיסית עם N-Ac (1 מ"מ), A83-01 (500 ננומטר), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), נוגין (100 ng/mL), ניקוטינאמיד (10 מ"מ), SD2021 90 (10 ננומטר), R-spondin (500 ng/mL), L-גלוטמין (2 מ"מ), HEPES (10 מיקרומטר), פניצילין-סטרפטומיצין (1x) ו- Y-27623 (10 מיקרומטר)19.
- הכן AD +++עיכול בינוני: 10 מ"ל של 1x אורגנואידים תרבות מדיה עם 500 μL של קולגנאז סוג II (20 מ"ג / מ"ל) ו 10 μL של RhoKI Y-27632 (10 מ"מ).
- דיסוציאציה של גידול20
- מעבירים את הגידול בצינור פלסטיק 50 מ"ל לצלחת פטרי 10 ס"מ. צלם תמונה מקרוסקופית לצד סרגל והקלט תיאור של תנאיו (כלומר, גודל, רקמות שומן, כלי דם, נמק וכו ').
- הסר עודף AD +++ על ידי שאיפה, לחתוך את רקמת הגידול לחתיכות קטנות על ידי מספריים ואחריו העברה של 1-2 חתיכות לתוך microtube 2 מ"ל עבור הצמד מקפיא על קרח יבש. יש לאחסן ב-80°C ליצירת פרופיל גנומי. טחון את החלקים הנותרים לחתיכות עדינות יותר על ידי מספריים לפני העברת צינור פלסטיק 50 מ"ל באמצעות AD + + + .
- לשטוף רקמה טחונה 2-3 פעמים על ידי 35 מ"ל של AD +++, ואחריו תוספת של 10 מ"ל של מדיום עיכול (ראה שלב 4.1.4) ומיקום על שייקר מסלולית ב 4 x גרם עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
- הומוגניזציה של הרקמה המתעכלת על ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילי 5 מ"ל, ואחריו תוספת של 20 מ"ל של AD +++ וסינון על ידי מסננת תאים μm 100.
- לשטוף את המעבר פעמיים עם AD +++ (ספין ב 450 x g במשך 5 דקות), ואחריו ההשעיה ב- BME (להוסיף נפח 4x של BME לכדור להשעיה) ולשמור על קרח19.
- הכנת תרבות האורגנואידים
- הוסף את המתלה תא BME לתוך צלחת 6-באר בטיפות מרובות לסך של 200 μL לבאר.
- מעבירים את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, טיפות הג'ל מחזקות.
- הוסף 2 מ"ל של מדיה אורגנואידית לכל באר, עם טיפות נציג נרשם על ידי צילום מיקרוסקופי לפני המעבר לאינקובטור (37 °C (37 °C (5% CO2).
- שמור על תרבויות האורגנואידים עם שינוי בינוני כל 3-4 ימים, ומעבר ביחס של 1:2 כל 7 ימים או בהתאם לצמיחה ולצפיפות שלהם.
5. היסטופתולוגיה וניתוח רצף הדור הבא (NGS)
- היסטופתולוגיה
- לאסוף אורגנואידים מהבאר עם המדיום הקיים באמצעות פיפטה P1000, ואחריו צנטריפוגה (ספין ב 450 x g במשך 5 דקות), כביסה עם PBS וקיבעון ב 10% פורמלין עבור 1 שעות.
- מניחים את האורגנואידים הקבועים ב 100% ג'לטין בחלק התחתון של צינור חרוט 50 מ"ל, ואחריו עיבוד רקמות שגרתי והטבעה.
- בצע כתמי המטוקסילין-אאוסין (H&E) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים על מקטעי פרפין 4 מ"מ.
- RNAseq רצף exome שלם
- לאסוף אורגנואידים מהבאר עם מדיום התרבות הקיים באמצעות פיפטה P1000, ואחריו צנטריפוגה באמצעות microcentrifuge במהירות המרבית (12,000 xg ) במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
- לאסוף את גלולה על ידי הסרת supernatant בינוני כדי להבטיח לא BME גלוי היה נוכח, ואחריו הצמד מקפיא microtube (קרח יבש) ולאחר מכן להעביר למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
- לחלץ RNA או DNA באמצעות הליך סטנדרטי מיצרנים ולבצע ניתוח NGS הן עבור RNAseq ו רצף exome שלם (WES).
6. IC50 מבחנים20
- זריעת אורגנואידים בצלחת 384 באר לבדיקתIC 50
- ניתוק אורגנואידים בטיפות BME מכל באר (עיכול BME) על ידי הוספת 20 μL של פתרון פירוק 100x לכל באר (צלחת 6 באר), שהכילה 2 מ"ל של מדיום אורגנואידי, ואחריו 10 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.
- פיפט עיכל אורגנואידים מכל בארות דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל כדי לאסוף את האורגנואידים.
- לספור את האורגנואידים תחת מיקרוסקופיה לקביעת ריכוז אורגנואידים. להשעות את האורגנואידים באמצעות מדיום תרבות, לפני הוספת BME כדי להגיע לריכוז הסופי של 5% (v / v) על קרח.
- הוסף 50 μL של השעיית האורגנואידים לכל צלחת 384 באר עם מתקן נוזלי, על פי מפת הצלחת עם צפיפות זריעה של 200 CR2110 PDXOs לכל באר במדיום תרבות אורגנואידי המתאים.
- טיפול ציספלטין ורינוטקן
- השתמש ציספלטין (עם הריכוז הגבוה ביותר של 100 מיקרומטר) ו "irinotecan" (עם הריכוז הגבוה ביותר של 10 מיקרומטר). הוסף SN-38 (מטבוליט של irinotecan, בניגוד irinotecan אשר משמש בדרך כלל במחקרים vivo) לכל באר על פי ערכת דילול התרופה עבור 9 מנות, בדילול סדרתי על ידי dispener דיגיטלי.
- צור את מפת הלוח באמצעות כלי התוכנה של המתקן הדיגיטלי. כלול רכב בקרה שלילי עם 100% כדאיות ושליטה postive של 5 μM starurosporine, אשר הראה 0% הכדאיות.
- מניחים את הצלחות 384-באר שטופלו בסמים בחזרה לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
- קביעת הכדאיות של תאים אורגנואידים לאחר טיפול תרופתי
- בסוף 5 ימים של טיפול תרופתי, לקבוע את הכדאיות התא אורגנואיד באמצעות ריאגנטים הכדאיות התא זוהר לפי ההליך המומלץ של היצרן. מוסיפים ריאגנט זוהר לתוך כל באר עם dispener נוזלי ומערבבים במשך 5 דקות על שייקר צלחת, ואחריו דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- הקלט את האות הזוהר על קורא לוחות רב-בארות זוהר.
- לחשב את viabilities מנורמל של כל באר באמצעות קריאות גלם מקורא הלוח וליצור עקומת תגובה מינון וערכי IC50 על ידי התאמת עקומה לא ליניארית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מורפולוגיה של PDXOs, אופיינית לאורגנואידים תחת מיקרוסקופיה קלה, עולה בקנה אחד עם PDX הורי לכל מכתים H&E
תחת מיקרוסקופיה קלה, PDXO-CR2110 מדגים מורפולוגיה סיסטיק טיפוסית (איור 1A), כפי שתואר קודם לכן עבור אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO), ראיות התומכות בדמיון בין PDXO ו- PDO באותם תנאי תרבות.
בדיקה היסטופתולוגית על ידי כתמי H&E מגלה כי מבני הרקמות וסוגי התאים של PDXO-CR2110 (איור 1B) משקפים את PDX-CR2110 המקורי (איור 1C), התומכים בכך שה- PDX וה- PDXO פותחו מאותו מקור: CR2110. תצפית זו מספקת ראיות היסטופתולוגיה כדי לתמוך בדמיון של PDXO ל PDX ההורי שלה.
ביטוי תמלול רצף exome שלם מדגים מתאם גבוה בין PDXO-CR2110 לבין ההורה PDX-CR2110
גידולי PDX-CR2110 כבר בעבר גנומי פרופיל באמצעות רצף תעתיק (RNAseq, mRNA)16 ו exome שלם (WES, DNA) רצף. כעת יש לנו פרופיל דומה PDXO-CR2110 המתאים. השוואות הפרופיל הגנומי של PDX ו-PDXO התואמות תואמות (איור 2) מדגימות מתאם גבוה של 94.92% בביטוי תמלול (mRNA) (אפיגנטי) וקונקורדנס גבוה של 97.67% ממוטציות הדנ"א (WES) (גנטיקה), מה שמרמז על דמיון גנומי כולל בין זוג מודלים זה.
קווי דמיון שנצפו עבור המאפיינים הפרמקולוגיים בין במבחנה PDXO-CR2110 ו ב vivo PDX-CR2110
בדיקות רגישות לסמים בוצעו ב-PDXO-CR2110 בצלחות של 384 בארות, והתוצאות מוצגות באיור 3A. PDXO-CR2110 היה רגיש irinotecan ועמיד בפני ציספלטין, עולה בקנה אחד עם תוצאות הטיפול PDX (איור 3B) שבו TGI (עיכוב צמיחת הגידול) ברמות מינון של 100 מ"ג / קילוגרם, כלומר, Q3Dx3 עבור irinotecan ו 5 מ"ג / קילוגרם, כלומר, Q4Dx4 עבור ציספלטין הוא 84.63% ו 6.61% בהתאמה. עקביות פרמקולוגית נצפתה תומכת בשוויון הביולוגי הפוטנציאלי של שני הדגמים, וניתן להשתמש בה למחקרי פרמקולוגיה משלימים במבחנה וב-vivo.
איור 1: מורפולוגיה של PDXO-CR2110. (A)מורפולוגיה של מיקרוסקופיה תחת אור (סוג סיסטיק). (B,C) היסטופתולוגיה של PDXO-CR2110 ו- PDX-CR2110, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרופילים גנומיים של PDXO-CR2110 לעומת PDX-CR2110, WES ו-RNAseq. לוח עליון: מתאם ביטוי mRNA גלובלי בין PDX-CR2110 ו- PDXO-CR2110 לכל RNAseq. לוח תחתון: טבלה של שני מתאמי ביטוי mRNA לכל קונקורדנציה מוטציה RNAseq ו- DNA לכל WES: PDX- לעומת PDXO-CR2110. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מאפיינים תרופתיים של PDXO-CR2110 במבחנה ו- SC PDX-CR2110 ב vivo. (A)PDXO-CR2110 במינון במבחנה-תגובה לתרכובות הבדיקה. (B) עיכוב צמיחה הגידול המושרה על ידי תרכובות בדיקה אותו על CR2110 ב vivo. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנתונים הראשוניים עבור PDX-/PDXO-CR2110 בדוח זה תומכים בשוויון הביולוגי בין PDX לבין נגזרתו, PDXO, לגבי גנומיקה, היסטופתולוגיה ופרמקולוגיה, שכן שני המודלים מייצגים את צורות המחלה הנגזרות מה- CSC המקורי של המטופל. שני המודלים הם מודלים המחלה שמקורם בחולה, פוטנציאל חיזוי של התגובה הקלינית של חולים10,11,12,21. זוג הדגמים התואמים במבחנה וב-vivo יכולים להשלים זה את זה להקרנה במבחנה ולאימות ב-vivo, לשפר את שיעור ההצלחה של גילוי תרופות ולהפחית את שיעורי ההתשה בפיתוח קליני. ראוי לציין כי PDXO יכול כעת לאפשר HTS לנצל את הספריות אורגנואידים גדולים המופקים על ידי המטופל זמין, שבו PDXs להיכשל בשל עלויות vivo גבוהות צירי זמן ארוכים יותר. למותר לציין, ספריית PDX-PDXO תואמת צפויה להפוך לפלטפורמה המועדפת לתמוך בגילוי סמים ובמחקר תרגום בעתיד הקרוב.
המרת הספרייה הקיימת של דגמי PDX מבוארים יכולה להיות גישה מהירה ופרודוקטיבית לבניית ספריית אורגנואיד מעשית על ידי שימוש בתהליך תעשייתי. דוח זה המיר PDX אחד ל- PDXO כדי לחקור את ההיתכנות של תהליך כזה, והשיטה המשמשת יכולה להיות בסיס לתמיכה בתהליך בקנה מידה גדול לבניית ספריית PDXO נרחבת. למעשה, השיטות ליצירת PDXO דומות בדרך כלל לשיטה המתוארת באופן נרחב עבור הדור של PDO18, למעט המקור של רקמת המטופל להיות עכברים.
ישנם צעדים קריטיים כדי להבטיח כי PDXOs נוצרו בהצלחה: 1) גידולי PDX טריים מפוצלים לחתיכות קטנות; 2) תנאי התרבות המתוארים לתרבות האורגנואידית כמתואר על ידי חכמים ועמיתים מיושמים בנאמנות18,22, אך ניתן להתאים אותם לאורגנואידים שונים; 3) אורגנואידים שונים יש שיעורי צמיחה שונים, המשפיעים על משך התרבות האורגנואידית ובריאות, כמו גם משך הטיפול התרופתי; 4) בדיקה יעילה כדי לקבוע את תוכן העכבר לעומת תוכן אנושי הוא קריטי לחלוטין כדי להבטיח את התרבויות הם אורגנואידים אנושיים בעיקר, שכן תרבויות מסוימות עשוי בהכרח יש רקמת עכבר מתמשכת / זיהום תא (במקרה שדווח כאן, יש זיהום מינימלי רקמת העכבר, נתונים לא מוצגים). זיהום עכבר יכול להיות אחת המגבלות החשובות ביצירת biobanks PDXO אם שיטות זיהוי והסרה יעילים אינם משמשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים הם העובדים הנוכחיים במשרה מלאה של קראון Bioscience, Inc.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'ודי ברבו, פדריקה פריסי וראג'נדרה קומארי על הקריאה והעריכה הביקורתית של כתב היד. המחברים רוצים גם להודות אונקולוגיה Bioscience הכתר במבחנה ובצוות vivo על המאמצים הטכניים הגדולים שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
