Summary
يتم وصف طريقة لإنشاء organoids باستخدام xenografts المشتقة من المريض (PDX) للفحص في المختبر ، مما أدى إلى أزواج متطابقة من نماذج في الجسم الحي / في المختبر. تم حصاد أورام PDX / معالجتها إلى قطع صغيرة ميكانيكيا أو أنزيميا ، تليها طريقة Clevers لزراعة الأعضاء السرطانية التي تم تمريرها والتبريد وتميزها ضد PDX الأصلي.
Abstract
تعتبر xenografts الورم المشتقة من المريض (PDXs) النماذج قبل السريرية الأكثر تنبؤا، ويعتقد إلى حد كبير أن تكون مدفوعة بالخلايا الجذعية السرطانية (CSC) لتقييم أدوية السرطان التقليدية. مكتبة كبيرة من PDXs يعكس تنوع مجموعات المرضى، وبالتالي تمكن التجارب قبل السريرية القائمة على السكان ("المرحلة الثانية مثل التجارب السريرية الماوس"); ومع ذلك، فإن PDX لديها قيود عملية على الإنتاجية المنخفضة، والتكاليف المرتفعة والمدة الطويلة. يمكن اعتبار الأورام العضوية ، التي هي أيضا نماذج مشتقة من المريض مدفوعة ب CSC ، مكافئا في المختبر ل PDX ، متغلبة على بعض قيود PDX للتعامل مع المكتبات الكبيرة من الأعضاء العضوية أو المركبات. تصف هذه الدراسة طريقة لإنشاء الأجهزة العضوية المشتقة من PDX (PDXO) ، مما يؤدي إلى نماذج مقترنة لأبحاث الصيدلة في المختبر وفي الجسم الحي. تم جمع الأورام المزروعة تحت الجلد PDX-CR2110 من الفئران الحاملة للورم عندما وصلت الأورام إلى 200-800 مم3، وفقا لإجراء تشريح معتمد ، يليه إزالة الأنسجة غير السرطانية المجاورة والتفكك إلى شظايا ورم صغيرة. تم غسل شظايا الورم الصغيرة ومرت عبر مصفاة خلايا 100 ميكرومتر لإزالة الحطام. تم جمع مجموعات الخلايا وتعليقها في محلول مستخلص غشاء الطابق السفلي (BME) ومطلية في لوحة من 6 آبار كقطرات صلبة مع الوسائط السائلة المحيطة للنمو فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون. تم رصد نمو الجهاز مرتين أسبوعيا تحت المجهر الخفيف وسجلت عن طريق التصوير الفوتوغرافي، تليها تغيير متوسط السائل 2 أو 3 مرات في الأسبوع. تم تمرير الأعضاء المزروعة كذلك (7 أيام في وقت لاحق) بنسبة 1:2 عن طريق تعطيل الأجهزة العضوية المضمنة BME باستخدام القص الميكانيكي ، بمساعدة إضافة التريبسين وإضافة 10 ميكرومتر Y-27632. وكانت الأرغنويدات تقدم في أنابيب التبريد للتخزين الطويل الأجل، بعد إطلاقها من BME عن طريق الطرد المركزي، كما تم أخذ عينات منها (مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي وكتلة FFPE) لمزيد من التوصيف.
Introduction
السرطانات هي مجموعة من الاضطرابات الوراثية والمناعية المتنوعة. يعتمد التطوير الناجح للعلاجات الفعالة بشكل كبير على النماذج التجريبية التي تتنبأ بفعالية بالنتائج السريرية. مكتبات كبيرة من xenografts المريض المستمدة من سمات جيدة (PDX) منذ فترة طويلة ينظر إليها على أنها ترجمة في النظام الحي للاختيار لاختبار العلاج الكيميائي و / أو العلاجات المستهدفة بسبب قدرتها على تلخيص خصائص ورم المريض، وعدم التجانس والاستجابة للأدوية المريض1،وبالتالي تمكين المرحلة الثانية مثل التجارب السريرية الماوس لتحسين النجاح السريري2،3. تعتبر PDXs عموما كأمراض الخلايا الجذعية السرطانية، ويضم الاستقرار الوراثي، على النقيض من خط الخلية المستمدة xenografts2. على مدى العقود القليلة الماضية ، تم إنشاء مجموعات كبيرة من PDXs في جميع أنحاء العالم ، لتصبح العمود الفقري لتطوير أدوية السرطان اليوم. وعلى الرغم من استخدامها على نطاق واسع وقيمتها النقلية الكبيرة، فإن هذه النماذج الحيوانية مكلفة في جوهرها، وتستغرق وقتا طويلا، وتستغرق إنتاجية منخفضة، وبالتالي فهي غير كافية للفحص على نطاق واسع. PDX هي أيضا غير مرغوب فيها لاختبار الأورام المناعية (IO) بسبب طبيعة المناعة للخطر4. وبالتالي فمن غير العملي الاستفادة الكاملة من المكتبة الكبيرة المتوفرة من PDXs.
وقد أدت الاكتشافات الأخيرة، رائدة من قبل مختبر هانز ذكيز5،إلى إنشاء الثقافات في المختبر من organoids ولدت من الخلايا الجذعية الكبار في معظم الأعضاء البشرية من أصلظهاري 5. وقد تم تنقيح هذه البروتوكولات للسماح لنمو organoids من CSCs المفترضة في سرطان الإنسان من مؤشرات مختلفة6،7. هذه الأجهزة المشتقة من المريض (PDOs) هي مستقرة جينيا8،9 وقد ثبت أنها تنبؤية للغاية لنتائج العلاج السريري10،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطبيعة المختبرية ل PDOs تمكن من الفحص عالي الإنتاجية (HTS)13، وبالتالي من المحتمل أن تقدم ميزة في نماذج الجسم الحي والاستفادة من المكتبات العضوية الكبيرة كبديل للسكان المرضى. تستعد PDOs لتصبح منصة اكتشاف وترجمة مهمة ، والتغلب على العديد من القيود المفروضة على PDXs المذكورة أعلاه.
كل من PDO و PDX هي نماذج مشتقة من المريض وCSC مدفوعة ، مع القدرة على تقييم العلاجات في سياق العلاج الشخصي أو شكل التجربة السريرية. المكتبات الكبيرة الموجودة من PDXs ، مثل مجموعة الملكية من >3000 PDXs14،15،16،17، وبالتالي فهي مناسبة لتوليد سريع من المكتبات من organoids الورم (PDX المستمدة من الأجهزة العضوية ، أو PDXO) ، مما أدى إلى مكتبة مطابقة من نماذج PDX و PDXO المقترنة. يصف هذا التقرير الإجراء لإنشاء وتوصيف سرطان القولون والمستقيم PDXO-CR2110 فيما يتعلق بنموذجه الأبوي PDX-CR211016.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم مراجعة جميع البروتوكولات والتعديلات أو الإجراءات التي تنطوي على رعاية واستخدام الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة الملكية للعلوم الحيوية المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) قبل إجراء الدراسات. تم إجراء رعاية الحيوانات واستخدامها وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية ل AAALAC (رابطة تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية) كما ورد في دليل رعاية واستخدام المختبر، المجلس الوطني للبحوث (2011). وكانت جميع الإجراءات التجريبية للحيوانات في ظروف معقمة في مرافق SPF (محددة خالية من مسببات الأمراض) وأجريت وفقا صارما لدليل رعاية واستخدام المختبر من مختلف المؤسسات الحكومية (مثل المعاهد الوطنية للصحة). وقد وافقت لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في مؤسسة المرفق (مثل اللجنة المؤسسية التابعة للجنة المشتركة بين اللجان المشتركة بين اللجان).
1. التحضير لزرع الورم
-
إسكان الحيوانات
- البيت بالب / ج الفئران عارية (ن = 5) في أقفاص التهوية الفردية، في 20-26 درجة مئوية، 30-70٪ الرطوبة، ودورة الإضاءة من 12 ساعة ضوء/ 12 ساعة الظلام، مع الفراش كوب الذرة تغيرت أسبوعيا، وتشعيع أغذية الحبيبات الجافة المعقمة بالإضافة إلى مياه الشرب العقيمة الإعلانية libitum.
-
إعداد جزء الورم المانح
- مراقبة الفئران المانحة الحاملة للورم عن كثب لوزن الجسم (BW ، عن طريق توازن الوزن) ، وحجم الورم (التلفزيون ، عن طريق قياس الفرجار).
- عندما يصل التلفزيون 800-1000 ملم3، القتل الرحيم الحيوانات الحاملة للورم في غطاء محرك السيارة الخطرة بيولوجيا.
- ضع الفئران في غرفة القتل الرحيم مع غطاء يسلمغاز ثاني أكسيد الكربون إلى الغرفة. تفريغ الغاز في الغرفة بمعدل تدفق التي تنتج اللاوعي السريع مع الحد الأدنى من الضيق للحيوان. معدل التدفق الأمثل لثاني أكسيد الكربون حوالي 2-2.5 لتر في الدقيقة.
- ضمان القتل الرحيم من خلال ملاحظة أن الحيوانات لا تستعيد وعيها.
- بعد الوفاة السريرية الواضحة، حافظ على تدفق الغاز لمدة >1 دقيقة لتقليل احتمال تعافي الحيوان.
- تعقيم الجلد حول الورم باستخدام مسحات iodophor. جمع الأورام عن طريق إزالة الأنسجة غير السرطانية المجاورة ووضعها في طبق بيتري يحتوي على 20 مل من برنامج تلفزيوني، مبردة مسبقا (4 درجة مئوية) قبل القتل الرحيم.
- غسل الأورام مع برنامج تلفزيوني في طبق بيتري آخر لإزالة مكونات الدم تليها قطع في النصف وإزالة أي الجلد إضافية، والأوعية الدموية، والتكلس و / أو نخر.
- ضع قطع الورم السليمة فقط في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل مع 20 مل من PBS ، قبل نقله إلى غرفة منفصلة لزرعها.
2. نمو الورم تحت الجلد
-
تلقيح تحت الجلد من قطعة الورم إلى فئران مناعة
- قطع الورم PDX إلى قطع 2 ملم مع مشرط، ووضع كل في trocars لزرع تحت الجلد (SC).
- تخدير الحيوانات المتلقية مع 5٪ isoflurane (التي تحتفظ بها مخروط الأنف في 1٪). الحيوانات الاسترخاء، وفقدان منعكس الحق وتصبح في نهاية المطاف غير متحركة، حتى لا تستجيب للألم. إصلاح الفئران تخدير على لوحة التجارب في الموضع الجانبي الأيمن وتعقيم مع مسحات iodophor، ولا سيما المناطق المحيطة موقع تلقيح الورم.
- على جلد الجناح الأيسر فقط الجمجمة إلى الورك، وجعل شق 0.5 سم مع مشرط وإنشاء نفق تحت الجلد نحو الأطراف الأمامية، 2-3 سم، وذلك باستخدام ملقط حادة.
- نقل مطهر مكعب واحد من جزء الورم لكل موقع تلقيح من المتوسطة ومكان عميق داخل النفق تحت الجلد. تأكيد موضع الجزء بصريا قبل إغلاق الجرح بمقاطع الجرح.
- مراقبة الفئران المزروعة الورم (5) حتى تصبح واعية للحفاظ على الحثالة القصية، ومن ثم إعادتها إلى قفصهم إلا بعد شفائهم الكامل من التخدير.
-
مراقبة صحة الفئران الحاملة للورم
- تحقق من استهلاك المياه والغذاء يوميا وسجل وزن الجسم أسبوعيا.
- تحقق من الفئران أثناء المراقبة الروتينية. سجل أي آثار على التنقل والتنفس والاستمالة والمظهر العام ، واستهلاك الطعام والماء ، وكسب / خسارة BW ، والاستسقاء ، وما إلى ذلك.
- قياس التلفزيون مرتين أسبوعيا باستخدام الفرجار والتعبير في مم3 لكل: TV = 0.5 × ب2، حيث أ وب هي طول وعرض الورم، على التوالي.
- التضحية بالحيوانات لجمع العينات عند ظهور أي من العلامات التالية: فقدان BW >20٪؛ ضعف الحركة (غير قادر على تناول الطعام أو الشراب)؛ غير قادر على التحرك بشكل طبيعي بسبب استسقاء كبير أو تضخم البطن. الجهد المبذول في التنفس؛ موت.
3. النخر وحصاد الورم
- عندما وصل حجم الورم إلى 200-800 مم3، قم بالقتل الرحيم للفئران وفقا للبروتوكولات المعتمدة (انظر الخطوة 1.2.2).
- جمع أنسجة الورم عن طريق إزالة الأنسجة غير الورم المجاورة، تليها وضع الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 50 مل مع AD +++ (على الجليد) قبل الانفصال.
4. التحضير لثقافة الجهازية المشتقة من PDX
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات التالية داخل خزانة السلامة البيولوجية لكل إرشادات معيار زراعة الأنسجة. احتفظ بمخزونات مسبقة الحرارة من 96-و24 و6 آبار في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- استعدادات الكاشف
- إعداد الطابق السفلي استخراج الغشاء (BME) حل (عامل النمو خفضت، فينول الأحمر خالية). احتفظ ب 10 مل من BME في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل. بمجرد إذابة، قم بتدوير زجاجة BME لضمان التشتت.
- إعداد الوسائط الأساسية/المخزن المؤقت للغسيل AD+++. إضافة 5 مل من 200 MM L-الجلوتامين, 1 M HEPES والقلم / ستريب إلى وسائل الإعلام المتقدمة DMEM/F12 عن طريق pipetting مع ماصة 5 مل.
- إعداد القولون الجهازية المتوسطة كما وصفها ساتو وآخرون.18 من خلال استكمال الوسائط الأساسية مع N-Ac (1 mM)، A83-01 (500 nM)، B27 (1x)، EGF (50 نانوغرام/مل)، نوجين (100 نانوغرام/مل)، نيكوتيناميد (10 mM)، SD2021 90 (10 نانومتر)، R-spondin (500 نانوغرام/مل)، L-الجلوتامين (2 mM)، HEPES (10 ميكرومتر)، البنسلين-الستربتومايسين (1x) وY-27623 (10 ميكرومتر)19.
- إعداد AD +++Digestion المتوسط: 10 مل من وسائط الثقافة العضوية 1x مع 500 ميكرولتر من نوع الكولاجيناز الثاني (20 ملغم / مل) و 10 ميكرولتر من RhoKI Y-27632 (10 mM).
- فصام الورم20
- نقل الورم في أنبوب بلاستيكي 50 مل إلى طبق بيتري 10 سم. التقط صورة بالمنظار إلى جانب المسطرة وسجل وصفا لظروفها (أي الحجم والأنسجة الدهنية والأوعية الدموية والنخر وما إلى ذلك).
- إزالة AD الزائدة +++ عن طريق الطموح، وقطع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة عن طريق مقص تليها نقل من 1-2 قطعة إلى 2 مل ميكروtube للمفاجئة تجميد على الجليد الجاف. تخزين في -80 درجة مئوية للتنميط الجينومي. فرم القطع المتبقية إلى قطع أدق بمقص قبل نقلها إلى أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل باستخدام AD+++.
- غسل الأنسجة المفرومة 2-3 مرات في 35 مل من AD +++، تليها إضافة 10 مل من متوسط الهضم (انظر الخطوة 4.1.4) ووضع على شاكر المداري في 4 × ز ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- تجانس الأنسجة المهضومة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة 5 مل ، تليها إضافة 20 مل من AD +++ والترشيح بواسطة مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
- غسل تمرير من خلال مرتين مع AD +++ (تدور في 450 × ز لمدة 5 دقائق)، تليها إعادة الإنفاق في BME (إضافة حجم 4X من BME إلى بيليه للتعليق) والحفاظ على الجليد19.
- إعداد الثقافة العضوية
- أضف تعليق الخلية BME إلى لوحة 6-well في قطرات متعددة إلى ما مجموعه 200 ميكرولتر لكل بئر.
- نقل لوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة، يسقط الجل.
- إضافة 2 مل من الوسائط العضوية إلى كل بئر ، مع قطرات الممثل المسجلة عن طريق التصوير المجهري قبل نقلها إلى حاضنة (37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2).
- الحفاظ على الثقافات organoid مع تغيير متوسط كل 3-4 أيام، والمرور بنسبة 1:2 كل 7 أيام أو اعتمادا على نموها وكثافتها.
5. علم الأنسجة وتحليل تسلسل الجيل التالي (NGS)
- علم الأنسجة
- جمع organoids من البئر مع المتوسطة القائمة باستخدام ماصة P1000، تليها الطرد المركزي (تدور في 450 × ز لمدة 5 دقائق)، وغسل مع برنامج تلفزيوني والتثبيت في 10٪ الفورمالين لمدة 1 ساعة.
- ضع الأجهزة العضوية الثابتة في الجيلاتين بنسبة 100٪ في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، يليه معالجة الأنسجة الروتينية وتضمينها.
- إجراء تلطيخ haematoxylin-eosin (H&؛E) باستخدام بروتوكولات قياسية على أقسام البارافين 4 مم.
- RNAseq وتسلسل إكسوم كله
- جمع organoids من البئر مع وسيط الثقافة القائمة باستخدام ماصة P1000 ، تليها الطرد المركزي باستخدام جهاز الطرد المركزي الدقيق بأقصى سرعة (12000 × غرام)لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- جمع بيليه عن طريق إزالة supernatant المتوسطة لضمان عدم وجود BME مرئية، تليها تجميد المفاجئة في microtube (الجليد الجاف) ومن ثم نقل إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
- استخراج الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي باستخدام الإجراء القياسي من الشركات المصنعة وإجراء تحليل NGS لكل من تسلسل RNAseq و exome كله (WES).
6. IC50 المقايسة20
- البذر العضوي في لوحة 384 جيدا لIC50 المقايسة
- الأجهزة التفككية في BME قطرات من كل بئر (هضم BME) عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من محلول 100x ديسباس لكل بئر (لوحة 6-جيدا)، والتي تحتوي على 2 مل من المتوسطة العضوية، تليها 10 دقيقة من الحضانة في 37 درجة مئوية.
- ماصة هضم organoids من جميع الآبار من خلال مرشح 70 ميكرومتر في أنبوب بلاستيكي 50 مل لجمع organoids.
- عد organoids تحت المجهر لتحديد تركيز organoid. تعليق organoids باستخدام ثقافة المتوسطة، قبل إضافة BME للوصول إلى التركيز النهائي من 5٪ (v/v) على الجليد.
- أضف 50 ميكرولتر من التعليق العضوي إلى كل لوحة من 384 بئرا مع موزع السائل ، وفقا لخريطة اللوحة مع كثافة بذر تبلغ 200 CR2110 PDXOs لكل بئر في متوسط الثقافة العضوية المقابلة.
- علاج سيسبلاتين والإيرينوتكان
- استخدام سيسبلاتين (مع تركيز أعلى من 100 ميكرومتر) و "irinotecan" (مع تركيز أعلى من 10 ميكرومتر). إضافة SN-38 (المستقلب من irinotecan, بدلا من irinotecan الذي يستخدم عادة في الدراسات في الجسم الحي) إلى كل بئر وفقا لمخطط تخفيف المخدرات لمدة 9 جرعات, في تخفيف المسلسل عن طريق dispener الرقمية.
- إنشاء خريطة لوحة باستخدام أداة برنامج موزع الرقمية. وتشمل مركبة التحكم السلبية مع 100٪ البقاء والسيطرة على وظيفة من 5 ميكرومتر ستاروروسبورين, التي أظهرت 0٪ البقاء.
- ضع الصفائح المعالجة بالمخدرات 384 بئرا مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.
- تحديد صلاحية الخلية العضوية بعد العلاج من المخدرات
- في نهاية 5 أيام من العلاج الدوائي، حدد صلاحية الخلية العضوية باستخدام كاشفات قابلية بقاء الخلايا الإنارة وفقا للإجراء الموصى به من قبل الشركة المصنعة. إضافة كاشف الإنارة في كل بئر مع المفك السائل ومزيج لمدة 5 دقائق على شاكر لوحة، تليها حضانة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- سجل إشارة الإنارة على قارئ لوحة متعددة الآبار.
- حساب viabilities تطبيع كل بئر باستخدام قراءات الخام من قارئ لوحة وخلق منحنى الجرعة والاستجابة والقيم IC50 من قبل منحنى غير الخطية المناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مورفولوجيا PDXOs ، نموذجية من organoids تحت المجهر الخفيف ، ومتسقة مع PDX الأبوية لكل تلطيخ H &؛ E
تحت المجهر الخفيف ، PDXO - CR2110 يوضح المورفولوجيا الكيسية النموذجية(الشكل 1A)، كما هو موضح سابقا للأعضاء المشتقة من المريض (PDO) ، والأدلة التي تدعم التشابه بين PDXO وPDO في ظل ظروف الثقافة نفسها.
يكشف الفحص النسيجي بواسطة تلطيخ H &؛ E أن هياكل الأنسجة وأنواع الخلايا PDXO-CR2110(الشكل 1B)تعكس PDX-CR2110 الأصلي(الشكل 1C)،مما يدعم أن PDX و PDXO تم تطويرهما من نفس الأصل: CR2110. توفر هذه الملاحظة أدلة علم الأنسجة لدعم تشابه PDXO مع PDX الأبوية.
التعبير Transcriptome وتسلسل إكسوم كله يوضح وجود علاقة عالية بين PDXO-CR2110 والأبوة PDX-CR2110
وقد تم سابقا PDX-CR2110 الأورام الجينومية لمحة باستخدام تسلسل النسخ (RNAseq، ميرنا)16 وإكسوم كله (WES، الحمض النووي) تسلسل. لدينا الآن لمحة مماثلة المقابلة PDXO -CR2110. تظهر مقارنات الملف الجينومي لتعبير PDX و PDXO المطابق(الشكل 2)ارتباطا كبيرا بنسبة 94.92٪ في تعبير النسخ (mRNA) (اللاجيني) وانسجاما كبيرا بنسبة 97.67٪ من طفرات الحمض النووي (WES) (الوراثية) ، مما يشير إلى تشابه جينومي شامل بين هذا الزوج من النماذج.
أوجه التشابه الملاحظة للخصائص الدوائية بين PDXO-CR2110 في المختبر وفي الجسم الحي PDX-CR2110
تم إجراء فحوصات حساسية المخدرات على PDXO-CR2110 في لوحات 384-well ، مع ظهور النتائج في الشكل 3A. PDXO-CR2110 كان حساسا لirinotecan ومقاومة ل سيسبلاتين، بما يتفق مع نتائج العلاج PDX(الشكل 3B)حيث TGI (تثبيط نمو الورم) عند مستويات الجرعة من 100 ملغ / كجم، أي p.، Q3Dx3 لirinotecan و 5 ملغ / كغ، أي p.، Q4Dx4 ل سيسبلاتين هو 84.63٪ و 6.61٪ على التوالي. ويدعم هذا الاتساق الملاحظ في علم الصيدلة التكافؤ البيولوجي المحتمل لكلا النموذجين، ويمكن استخدامه في الدراسات التكميلية لعلم الصيدلة في المختبر وفي الجسم الحي.
الشكل 1: مورفولوجيا PDXO-CR2110. (أ) مورفولوجيا تحت المجهر الخفيف (نوع الكيسي). (B, C) علم الأنسجة من PDXO-CR2110 و PDX-CR2110، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لمحات الجينوم من PDXO-CR2110 مقابل PDX-CR2110، وسوس وRNAseq. اللوحة العليا: ارتباط تعبير مرنا العالمي بين PDX-CR2110 و PDXO-CR2110 لكل RNAseq. لوحة السفلى: جدول كل من الارتباطات التعبير ميرنا لكل RNAseq وتوافق طفرة الحمض النووي لكل WES: PDX- مقابل PDXO-CR2110. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خصائص الدوائية لكل من PDXO-CR2110 في المختبر وSC PDX-CR2110 في الجسم الحي. (أ) PDXO-CR2110 في المختبر جرعة استجابة لمركبات الاختبار. (ب)تثبيط نمو الورم الناجم عن نفس مركبات الاختبار على CR2110 في الجسم الحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تدعم البيانات الأولية ل PDX-/PDXO-CR2110 في هذا التقرير التكافؤ البيولوجي بين PDX ومشتقه ، PDXO ، فيما يتعلق بعلم الجينوم وعلم الأنسجة وعلم الأدوية ، لأن كلا النموذجين يمثلان أشكال المرض المستمدة من CSC الأصلي للمريض. كلا النموذجين هي نماذج المرض المشتقة من المريض، ويحتمل أن تكون تنبؤية للاستجابة السريرية للمرضى10،11،12،21. يمكن للزوج المطابق من نماذج المختبر وفي الجسم الحي أن يكمل كل منهما الآخر للفحص المختبري والتحقق في الجسم الحي ، مما يحسن معدل نجاح اكتشاف الأدوية وربما يقلل من معدلات الاستنزاف في التطوير السريري. تجدر الإشارة إلى أن PDXO يمكن الآن تمكين HTS للاستفادة من المكتبات العضوية الكبيرة المشتقة من المريض ، حيث تفشل PDXs بسبب ارتفاع تكاليف الجسم الحي والجداول الزمنية الأطول. وغني عن القول، مكتبة PDX-PDXO مطابقة من المرجح أن تصبح منصة الاختيار لدعم اكتشاف المخدرات والبحوث التحويلية في المستقبل القريب.
ويمكن أن يكون تحويل المكتبة الحالية لنماذج PDX المشروحة نهجا سريعا ومنتجا لبناء مكتبة آلية عملية من خلال استخدام عملية صناعية. حول هذا التقرير ملف PDX إلى PDXO لاستكشاف جدوى مثل هذه العملية ، ويمكن أن تكون الطريقة المستخدمة أساسا لدعم عملية واسعة النطاق لبناء مكتبة PDXO واسعة النطاق. عمليا ، فإن أساليب إنشاء PDXO تشبه بشكل عام الطريقة الموصوفة على نطاق واسع لتوليد PDO18، باستثناء مصدر الأنسجة المريضة التي تكون الفئران.
هناك خطوات حاسمة لضمان إنشاء PDXOs بنجاح: 1) يتم تجزئة أورام PDX الطازجة إلى قطع صغيرة؛ 1) يتم تقسيم أورام PDX إلى قطع صغيرة؛ 1) تشتت الأورام إلى أجزاء صغيرة. 2) يتم تنفيذ الظروف الثقافية الموصوفة لثقافة organoid كما وصفها Clevers وزملاؤه بأمانة18،22، ولكن يمكن تعديلها لمختلف organoids ؛ 3) الأجهزة العضوية المختلفة لديها معدلات نمو مختلفة ، مما يؤثر على مدة الثقافة العضوية والصحة ، وكذلك مدة العلاج من المخدرات ؛ 4) إجراء فحص فعال لتحديد محتوى الماوس مقابل المحتوى البشري أمر بالغ الأهمية لضمان أن الثقافات هي إلى حد كبير العضوي البشري ، لأن بعض الثقافات قد يكون لها حتما تلوث مستمر في أنسجة الفئران / الخلايا (في الحالة المبلغ عنها هنا ، هناك الحد الأدنى من تلوث أنسجة الماوس ، والبيانات غير المعروضة). تلوث الماوس يمكن أن يكون واحدا من القيود الهامة في خلق البنوك الحيوية PDXO إذا لم يتم استخدام أساليب الكشف والإزالة الفعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين هم الموظفون الحاليون بدوام كامل في شركة كراون للعلوم الحيوية
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جودي باربو وفيديريكا باريزي وراجندرا كوماري على القراءة النقدية للمخطوطة وتحريرها. كما يود المؤلفون أن يشكروا فريق كراون للأورام في مجال العلوم البيولوجية في المختبر وفي الجسم الحي على جهودهم التقنية الكبيرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
