Summary
描述使用患者衍生的异种格拉夫特 （PDX） 进行体外筛查的方法，从而形成匹配的体内/体外模型对。PDX 肿瘤被机械或酶地收获/加工成小块，然后是 Clevers 的生长肿瘤器官的方法，这些器官是通过、冷冻保存和针对原始 PDX 进行特征的。
Abstract
患者衍生的肿瘤异种移植（PDXs）被认为是最具预测性的前科模型，主要被认为是由癌症干细胞（CSC）驱动的常规癌症药物评估。一个大型的PDX库反映了患者群体的多样性，从而能够进行基于人群的临床前试验（"第二阶段类似小鼠的临床试验"）：但是，PDX 具有吞吐量低、成本高、持续时间长的实际局限性。肿瘤器官，也是患者衍生的CSC驱动模型，可以被认为是PDX的体外等价物，克服了某些PDX限制，用于处理大型器官库或化合物库。这项研究描述了一种创建PDX衍生器官（PDXO）的方法，从而产生了体外和体内药理学研究的配对模型。皮下移植的PDX-CR2110肿瘤是从肿瘤携带小鼠身上采集的，当肿瘤达到200-800毫米3时，按照批准的尸检程序，然后切除相邻的非肿瘤组织，分离成小肿瘤片段。小肿瘤碎片被洗净，并通过一个100μm细胞过滤器去除碎片。细胞簇被收集并悬挂在地下室膜提取物 （BME） 溶液中，并镀在 6 井板中，作为与周围液体介质一起生长的固体液滴，用于 CO2 孵化器的生长。在光显微镜下每周监测两次器官生长，并记录摄影，然后每周进行2次或3次液体介质变化。通过机械剪切破坏BME嵌入器官，辅之以添加滴虫素和添加10μM Y-27632，进一步通过（7天后）1：2的比例。器官在离心从BME释放后，在低温管中冷冻保存，用于长期储存，并取样（如DNA、RNA和FFPE块）以作进一步鉴定。
Introduction
癌症是各种遗传和免疫学疾病的集合。有效治疗的成功开发高度依赖于有效预测临床结果的实验模型。长期以来，大型患者衍生异种移植（PDX）库一直被视为体外系统的转化系统，以测试化疗和/或靶向疗法，因为他们能够重新概括患者肿瘤特征、异质性和患者药物反应1，从而使II期样小鼠临床试验能够提高临床成功率。PDX通常被认为是癌症干细胞疾病，具有遗传稳定性，与细胞系衍生的异种移植2形成鲜明对比。在过去的几十年里，世界各地都建立了大量的PDX系列，成为当今癌症药物开发的主力军。这些动物模型虽然应用广泛，转化价值巨大，但内在成本高、耗时、吞吐量低，因此不足以进行大规模筛选。PDX也不适合免疫肿瘤学（IO）测试，由于免疫损害的性质4。因此，充分利用现有的大型 PDX 库是不切实际的。
最近由汉斯·克莱弗斯实验室5号开创的发现，在大多数上皮起源5的人类器官中，建立了由成人干细胞产生的器官体外培养。这些协议已经进一步完善，使有机体从假定的CSC在人类癌的各种迹象6，7的增长。这些患者衍生的器官（PDOs）是基因稳定的8，9，并已被证明是高度预测临床治疗结果10，11，12。此外，PDOs 的体外性质使高通量筛查 （HTS）13能够实现，从而有可能提供比体内模型更优越的优势，并利用大型器官库作为患者群体的代名词。PDOs 有望成为重要的发现和转化平台，克服上述 PDX 的许多局限性。
PDO 和 PDX 都是患者衍生和 CSC 驱动的模型，能够在个性化治疗或临床试验格式的背景下评估治疗。现有的大型PDX库，如专有收藏的>3000 PDXs 14，15，16，17，因此适合肿瘤器官库（PDX衍生器官，或PDXO），从而形成了一个匹配的配对PDX和PDXO模型库。本报告描述了创建和描述结肠直肠癌PDXO-CR2110与其父母PDX-CR2110模型16相关的程序。
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Protocol
所有涉及动物护理和使用的协议和修正或程序在开展研究之前都经过皇家生物科学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的审查和批准。根据国家研究理事会《实验室动物护理和使用指南》（2011年）中报告的《实验室动物护理和使用指南》，对动物的护理和使用是根据AALAC（实验室动物护理评估和认证协会）国际准则进行的。所有动物实验程序均在SPF（特定无病原体）设施的无菌条件下进行，并严格按照不同政府机构（如国家卫生研究院）的《实验室动物护理和使用指南》进行。这些议定书得到了设施机构动物实验道德委员会（例如机构IACUC委员会）的批准。
1. 肿瘤移植准备
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动物住房
- House Balb/c 裸鼠 （n=5） 在单独通风的笼子里，在 20-26 °C， 30-70% 湿度， 和 12 小时光/12-h 黑暗的照明周期， 玉米棒床上用品每周更换， 辐照消毒干颗粒食物加上无菌饮用水 ad libitum.
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捐赠肿瘤片段准备
- 密切监测肿瘤携带的供体小鼠的体重（BW，通过称重平衡）和肿瘤体积（电视，通过卡钳测量）。
- 当电视达到800-1000毫米3时，在生物危害罩中安乐死携带肿瘤的动物。
- 将小鼠放入安乐死室，盖上盖子，将二氧化碳 气体送入室内。以流速向腔室排放气体，产生快速无意识，对动物的困扰最小。二氧化碳 的最佳流量约为2-2.5 Lpm。
- 通过观察动物不能恢复知觉，确保安乐死。
- 在明显的临床死亡后，将气体流量保持在>1分钟，以尽量减少动物可能康复的可能性。
- 使用碘化拭子对肿瘤周围的皮肤进行消毒。通过切除相邻的非肿瘤组织并放入含有 20 mL PBS 的培养皿中收集肿瘤，在安乐死前预冷 （4 °C）。
- 在另一个培养皿中用 PBS 清洗肿瘤，去除血液成分，然后切成两半，去除任何额外的皮肤、血管、钙化和/或坏死。
- 在运送到单独的动物室进行移植之前，只将完整的肿瘤片放入带有 20 mL PBS 的无菌 50 mL 离心管中。
2. 皮下肿瘤生长
-
将肿瘤片的皮下接种到免疫功能低下的小鼠体内
- 用手术刀将 PDX 肿瘤切成 2 mm 片，并将每个肿瘤放入小车中进行皮下植入 （SC） 植入。
- 用5%的异氟兰（由鼻锥维持在1%）麻醉接受动物。动物们放松，失去正确的反射，最终变得不动，直到对疼痛没有反应。将麻醉小鼠固定在右侧位置的实验板上，用碘化拭子消毒，特别是肿瘤接种部位周围的区域。
- 在左侧皮肤只是颅面到臀部，用手术刀做一个0.5厘米的切口，并在皮肤下创建一个隧道，走向前肢，2-3厘米，使用钝钳。
- 无菌地从介质中转移一个肿瘤片段立方体，并放置在皮下隧道深处。用伤口夹封住伤口之前，可直观地确认碎片的位置。
- 监测植入肿瘤的小鼠（5），直到它们意识到要保持胸骨屈积，然后在麻醉完全恢复后才将它们送回笼子。
-
肿瘤携带小鼠健康监测
- 每天检查水和食物的消耗量，每周记录体重。
- 在常规监控期间检查鼠标。记录对行动、呼吸、梳妆和一般外观、食物和水消耗、BW 增减、兴奋等的任何影响。
- 每周测量电视两次使用卡钳和表达毫米3 每：电视=0.5一×b2，其中a和b分别是肿瘤的长度和宽度。
- 牺牲动物收集样品时，出现以下任何迹象：BW损失>20%：行动不便（不能吃喝）;由于腹部明显松动或扩大，无法正常移动;呼吸的努力;死亡。
3. 坏死和肿瘤收成
- 当肿瘤体积达到200-800毫米3时，根据批准的协议对小鼠实施安乐死（见步骤1.2.2）。
- 通过去除相邻的非肿瘤组织来收集肿瘤组织，然后在分离前将组织放入带有 AD++（冰）的 50 mL 塑料管中。
4. 准备PDX衍生器官培养
注：根据组织培养标准准则，所有以下步骤均在生物安全柜内执行。使用前，将 96、24 和 6 井板的预热库存保存在 37 °C 的孵化器中。
- 试剂制剂
- 准备基膜提取物 （BME） 溶液 （生长因子降低， 无苯酚） 。将 10 mL 的 BME 保存在 4 °C 冰箱中过夜。解冻后，旋转 BME 瓶以确保分散。
- 准备基础介质/洗涤缓冲区广告+通过用 5 毫升移液器管道，将 5 毫升 200 m L-谷氨酰胺、1 M HEPES 和笔/链球添加到高级 DMEM/F12 介质中。
- 准备佐藤等人描述的结肠器官介质。18通过补充基础介质与 N-Ac （1 mM）， A83-01 （500 nM）， B27 （1x）， EGF （50 ng/mL）， 诺金 （100 ng/mL）， 尼科蒂纳米德 （10 mM）， SD2021 90 （10 nM）， R-斯庞丁 （500 ng/mL）， L-谷氨酰胺 （2 mM）， HEPES （10 μM）， 青霉素链霉素 （1x） 和 Y-27623 （10 μM）19.
- 准备 AD++消化介质：10 mL 的 1x 器官培养介质，500μL 拼贴酶 II 型 （20 毫克/mL） 和 10 μL 的 RhoKI Y-27632 （10 mM）。
- 肿瘤分离20
- 将 50 mL 塑料管中的肿瘤转移到 10 厘米的培养皿中。在尺子旁边拍摄一张宏观照片，并记录其状况的描述（即大小、脂肪组织、血管化、坏死等）。
- 通过吸气去除多余的AD++，用剪刀将肿瘤组织切成小块，然后将1-2块转移到2mL微管中，在干冰上快速冻结。储存在-80°C进行基因组分析。使用 AD+将剩余的碎片用剪刀切成更细的碎片，然后使用 AD+将剩余件放入 50 mL 塑料管中。
- 将碎组织洗2-3次，减去35毫升AD+，然后加入10mL的消化介质（见第4.1.4步），在37°C时以 4×g 的1小时放置在轨道摇床上。
- 使用 5 mL 无菌塑料移液器上下管道，然后添加 20 mL AD++和过滤 100 μm 细胞过滤器，使消化后的组织均匀化。
- 用 AD++（旋转 450 x g 5 分钟）清洗两次通过，然后在 BME 中重新悬念（将 4 倍的 BME 体积添加到颗粒中以进行悬浮），并保持在冰上19。
- 器官培养的准备
- 将 BME 细胞悬架加入 6 井板，在多个跌落中添加到每口井总计 200 μL。
- 将板转移到 37 °C 孵化器。30分钟后，凝胶滴凝固。
- 在每个井中加入 2 mL 的有机介质，在转移到孵化器（37 °C 和 5% CO2）之前，通过显微摄影记录具有代表性的滴水。
- 保持器官培养物每3-4天发生中等变化，每7天以1：2的比例通过，或根据其生长和密度进行。
5. 组织病理学和下一代测序分析
- 组织病理学
- 使用 P1000 移液器从井中用现有介质收集有机物，然后进行离心（旋转 450 x g 5 分钟），用 PBS 清洗，并固定在 10% 正式素中 1 小时。
- 将固定器官放在 50 mL 锥形管底部 100% 明胶中，然后进行常规组织处理和嵌入。
- 使用标准协议在 4 mm 石蜡部分进行血氧林 （H&E） 染色。
- 雷纳塞克和整个外向体测序
- 使用 P1000 移液器从井中用现有培养介质收集有机物，然后使用微中微管以最高速度 （12，000 x g）进行离心处理，在 4 °C 下 5 分钟。
- 通过去除中等超细剂来收集颗粒，以确保不存在可见的 BME，然后在微管（干冰）中快速冻结，然后转移到 -80 °C 冰柜。
- 使用制造商的标准程序提取RNA或DNA，并针对RNASeq和整个外向测序（WES）进行NGS分析。
6. IC50 检测20
- IC50 测定 384 井板中的器官播种
- BME 中的分离器官从每口井（消化 BME）中滴落，在每口井（6 口井板）中加入 20μL 的 100 倍脱口而出溶液，其中含有 2 mL 的器官介质，随后在 37 °C 处进行 10 分钟的孵化。
- Pipette 通过 70μm 过滤器将所有井中的有机物消化到 50 mL 塑料管中以收集有机物。
- 在显微镜下计算器官，以确定器官浓度。使用培养介质暂停器官，然后加入 BME 以达到冰上 5% （v/v） 的最终浓度。
- 根据在相应的器官培养介质中每口井的播种密度为 200 CR2110 PDXO 的板图，在液体分配器下将 50 μL 的器官悬浮液添加到每个 384 井板中。
- 西斯铂和伊里诺特坎治疗
- 使用西斯铂（最高浓度为100μM）和"伊里诺坎"（最高浓度为10μM）。根据9剂药物稀释方案，在每口井中加入SN-38（一种伊里诺特坎代谢物，而不是通常用于体内研究的伊里诺特坎）。
- 使用数字分配器软件工具创建板图。包括负控制车辆，其 100% 生存能力和 5 μM 淀罗孢菌素的后控制，显示 0% 的生存能力。
- 将经过药物处理的 384 井板放回 37 °C 孵化器中。
- 药物治疗后器官细胞生存能力的确定
- 在5天的药物治疗结束时，根据制造商的建议程序，使用发光细胞生存能力试剂确定器官细胞的生存能力。将发光试剂加入每个井中，加入液体分离剂，在板式摇床上混合5分钟，然后在黑暗的室温下孵化30分钟。
- 在发光多井板读卡器上记录发光信号。
- 使用板读取器中的原始读数计算每口油井的正常通过性，并通过非线性曲线拟合创建剂量响应曲线和 IC50 值。
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Representative Results
PDXO 的形态学，典型的光显微镜下的器官，与父母的 PDX 每 H&E 染色一致
在光显微镜下，PDXO-CR2110演示了典型的囊性形态（图1A），如以前描述的患者衍生器官（PDO），支持PDXO和PDO在相同培养条件下相似的证据。
H&E染色组织的病理学检查显示，PDXO-CR2110（图1B）的组织结构和细胞类型反映了原始的PDX-CR2110（图1C），支持PDX和PDXO是从同一来源开发的：CR2110。这一观察提供了组织病理学证据，以支持PDXO与其父母PDX的相似性。
转录表表达和整个外向测序表明PDXO-CR2110与父PDX-CR2110之间有很高的相关性
PDX-CR2110肿瘤以前使用转录体测序（RNAseq，mRNA）16和整个外显子（WES，DNA）测序进行基因组分析。我们现在也对相应的 PDXO-CR2110 进行了类似的描述。对应的PDX和PDXO（图2）的基因组特征比较表明转录体（mRNA）表达（表观遗传学）的相关性高达94.92%，DNA突变（WES）（遗传）的高相容性，表明这两个模型在基因组上的整体相似性。
体外PDXO-CR2110和体内PDX-CR2110之间的药理特性观察到的相似性
药物敏感性检测在384井板的PDXO-CR2110上进行，结果显示在 图3A中。PDXO-CR2110对伊里诺特坎很敏感，对西斯铂有抵抗力， 符合PDX治疗结果（图3B），其中TGI（肿瘤生长抑制）的剂量水平为100毫克/千克，即第3Dx3季度为伊里诺特坎和5毫克/千克，即第4Dx4季度为西斯铂分别为84.63%和6.61%。这种观察到的药理学一致性支持两种模型的潜在生物学等价性，并可用于体外和体内的补充药理学研究。
图1：PDXO-CR2110的形态学。（A） 光显微镜下的形态学（囊性类型）。（B ， C）PDXO-CR2110和PDX-CR2110的病理学。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：PDXO-CR2110与PDX-CR2110、WES和RNA塞克的基因组配置文件。上面板：PDX-CR2110和PDXO-CR2110之间的全球mRNA表达相关性。下面板：每个RNASeq的mRNA表达相关性和每个WES的DNA突变一致性表：PDX-与PDXO-CR2110。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：体外PDXO-CR2110和SC PDX-CR2110体内的药理特性。（A） PDXO-CR2110 体外剂量对测试化合物的反应。（B） 肿瘤生长抑制诱导由同一测试化合物在CR2110体内。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本报告中PDX-/PDXO-CR2110的初步数据支持PDX与其衍生物PDXO在基因组学、组织病理学和药理学方面的生物学等价性，因为这两种模型都代表了从患者原始CSC衍生的疾病形式。这两种模型都是患者衍生的疾病模型，可能预测患者10、11、12、21的临床反应。匹配的体外模型和体内模型可以相辅相成，在体内进行体外筛查和验证，提高药物发现的成功率，并可能降低临床开发中的自然减员率。值得注意的是，PDXO 现在可以使 HTS 能够利用现有的大型患者衍生器官库，其中 PDX 因体内成本高和时间较长而失败。不用说，一个匹配的PDX-PDXO库可能会成为在不久的将来支持药物发现和转化研究的选择平台。
转换现有带注释的 PDX 模型库，可以采用工业流程快速高效地构建实用的有机体库。本报告将一个 PDX 转换为 PDXO，以探讨此过程的可行性，所使用的方法可以作为支持大规模进程以构建广泛的 PDXO 库的基础。实际上，创建PDXO的方法通常类似于广泛描述的PDO18生成方法，除了患者组织来源是小鼠。
有关键步骤，以确保PDXO成功创建：1）新鲜的PDX肿瘤被分割成小块：2） Clevers 及其同事描述的器官文化文化条件如实执行18、22，但可针对不同的器官进行调整：3） 不同的器官有不同的生长速度，影响器官培养和健康的持续时间以及药物治疗持续时间：4） 确定小鼠含量与人类含量的有效检测对于确保培养物主要是人体器官绝对至关重要，因为某些培养物可能不可避免地存在持续的鼠标组织/细胞污染（在此处报告的案例中，小鼠组织污染最小，未显示的数据）。如果不使用有效的检测和去除方法，鼠标污染可能是创建 PDXO 生物库的重要限制之一。
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Disclosures
所有作者都是皇冠生物科学公司的全职员工。
Acknowledgments
作者要感谢乔迪·巴博博士、费德里卡·帕里西博士和拉金德拉·库马里博士对手稿的批判性阅读和编辑。作者还要感谢皇家生物科学肿瘤学体外和体内团队的巨大技术努力。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
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