Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Opprette matchede in vivo/in vitro pasientavledede modellpar av PDX- og PDX-avledede organoider for kreftfarmakologiforskning

doi: 10.3791/61382 Published: May 5, 2021

Summary

En metode er beskrevet for å lage organoider ved hjelp av pasientavledede xenografts (PDX) for in vitro screening, noe som resulterer i matchede par in vivo / in vitro-modeller. PDX-svulster ble høstet/behandlet i små biter mekanisk eller enzymatisk, etterfulgt av Clevers' metode for å dyrke tumororganoider som ble passasjert, kryopreservert og karakterisert mot den opprinnelige PDX.

Abstract

Pasientavledede tumor xenografts (PDXs) regnes som de mest prediktive prekliniske modellene, i stor grad antatt å være drevet av kreft stamceller (CSC) for konvensjonell kreft narkotika evaluering. Et stort bibliotek med PDX-er gjenspeiler mangfoldet i pasientpopulasjoner og muliggjør dermed befolkningsbaserte prekliniske studier ("Fase II-lignende muse kliniske studier"); PDX har imidlertid praktiske begrensninger med lav gjennomstrømning, høye kostnader og lang varighet. Tumororganoider, som også er pasientavledede CSC-drevne modeller, kan betraktes som in vitro-ekvivalenten til PDX, og overvinne visse PDX-begrensninger for å håndtere store biblioteker av organoider eller forbindelser. Denne studien beskriver en metode for å lage PDX-avledede organoider (PDXO), noe som resulterer i parrede modeller for in vitro- og in vivo farmakologiforskning. Subkutant transplanterte PDX-CR2110 svulster ble samlet inn fra tumorbærende mus da svulstene nådde 200-800 mm3, per en godkjent obduksjonsprosedyre, etterfulgt av fjerning av tilstøtende ikke-tumorvev og dissosiasjon i små tumorfragmenter. De små tumorfragmentene ble vasket og passert gjennom en 100 μm cellesil for å fjerne rusk. Celleklynger ble samlet inn og suspendert i kjellermembranekstrakt (BME) oppløsning og belagt i en 6-brønns plate som en solid dråpe med omkringliggende flytende medier for vekst i en CO 2-inkubator. Organoid vekst ble overvåket to ganger ukentlig under lysmikroskopi og innspilt av fotografering, etterfulgt av flytende medium endring 2 eller 3 ganger i uken. De voksne organoidene ble ytterligere viderepassert (7 dager senere) med et 1:2-forhold ved å forstyrre BME innebygde organoider ved hjelp av mekanisk skjæring, hjulpet av tilsetning av trypsin og tilsetning av 10 μM Y-27632. Organoider ble kryopreservert i kryorør for langtidslagring, etter frigjøring fra BME ved sentrifugering, og også samplet (f.eks. DNA, RNA og FFPE-blokk) for videre karakterisering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kreft er en samling av ulike genetiske og immunologiske lidelser. Vellykket utvikling av effektive behandlinger er svært avhengig av eksperimentelle modeller som effektivt forutsier kliniske resultater. Store biblioteker med godt karakteriserte pasientavledede xenografts (PDX) har lenge blitt sett på som det translasjonelle in vivo-systemet som er valgt for å teste kjemo- og/eller målrettede terapier på grunn av deres evne til å rekapitulere pasientsvulstegenskaper, heterogenitet og pasientmedisinrespons1, slik at fase II-lignende muse kliniske studier kan forbedre klinisk suksess2,3. PDXer betraktes generelt som kreft stamcellesykdommer, med genetisk stabilitet, i motsetning til cellelinje avledet xenografts2. I løpet av de siste tiårene har store samlinger av PDXs blitt opprettet over hele verden, og blitt arbeidshest for utvikling av kreftmedisin i dag. Selv om de er mye brukt og med stor translasjonsverdi, er disse dyremodellene iboende kostbare, tidkrevende og lave gjennomstrømning, derfor utilstrekkelige for storskala screening. PDX er også uønsket for immuno-onkologi (IO) testing på grunn av en immunkompliserte natur4. Det er derfor upraktisk å dra full nytte av det tilgjengelige store biblioteket med PDXs.

Nylige funn, pionerer av Hans Clevers ' laboratorium5, har ført til etableringen av in vitro kulturer av organoider generert fra voksne stamceller i de fleste menneskelige organer av epitel opprinnelse5. Disse protokollene har blitt ytterligere raffinert for å tillate vekst av organoider fra antattE CSC-er i humane karsinomer av ulikeindikasjoner 6,7. Disse pasientavledede organoidene (PUD) er genomisk stabile8,9 og har vist seg å være svært prediktive for kliniske behandlingsutfall10,11,12. I tillegg muliggjør IN VITRO-naturen til PUD-er høy gjennomstrømningsscreening (HTS)13, og gir dermed potensielt en fordel i forhold til in vivo-modeller og utnytter store organoidbiblioteker som en surrogat av pasientpopulasjonen. PUD-er er klar til å bli en viktig oppdagelses- og oversettelsesplattform, og overvinner de mange begrensningene til PDXer beskrevet ovenfor.

Både PUD og PDX er pasientavledede og CSC-drevne modeller, med evne til å evaluere terapeutiske behandlinger i sammenheng med enten personlig behandling eller klinisk studieformat. Eksisterende store biblioteker av PDXs, som den proprietære samlingen av >3000 PDXs14,15,16,17, er derfor egnet for rask generering av biblioteker av tumororganoider (PDX-avledede organoider eller PDXO), noe som resulterer i et matchet bibliotek med parrede PDX- og PDXO-modeller. Denne rapporten beskriver prosedyren for å skape og karakterisere kolorektal kreft PDXO-CR2110 i forhold til foreldre PDX-CR2110 modell16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle protokoller og endringer eller prosedyrer som involverer pleie og bruk av dyr ble gjennomgått og godkjent av Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) før studiene ble gjennomført. Pleie og bruk av dyr ble utført i samsvar med AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) Internasjonale retningslinjer som rapportert i Guide for care and use of Laboratory Animals, National Research Council (2011). Alle eksperimentelle prosedyrer for dyr var under sterile forhold ved SPF (spesifikke patogenfrie) anlegg og utført i henhold til Guide for the Care and Use of Laboratory Animals fra forskjellige offentlige institusjoner (f.eks. Protokollene ble godkjent av Komiteen for etikk for dyreforsøk ved anleggsinstitusjonen (f.eks. institusjonell IACUC-komité).

1. Forberedelse for tumortransplantasjon

  1. Dyrehus
    1. Hus Balb / c naken mus (n = 5) i individuelle ventilerte bur, ved 20-26 ° C, 30-70% fuktighet, og en belysning syklus av 12-t lys / 12-h mørk, med mais cob sengetøy endret ukentlig, og bestråling sterilisert tørr granulat mat pluss sterilt drikkevann ad libitum.
  2. Donor tumor fragment forberedelse
    1. Overvåk nøye tumorbærende donormus for kroppsvekt (BW, via veiebalanse) og tumorvolum (TV, ved kalipermåling).
    2. Når TV når 800-1000 mm3, euthanize de tumorbærende dyrene i en biohazard hette.
      1. Plasser mus i et eutanasikammer med et lokk som leverer CO2-gass inn i kammeret. Utslippsgass inn i kammeret med en strømningshastighet som produserer rask bevisstløshet med minimal nød for dyret. Den optimale strømningshastigheten for CO2 er rundt 2-2,5 Lpm.
      2. Sørg for eutanasi ved å observere at dyrene ikke gjenvinner bevisstheten.
      3. Etter tilsynelatende klinisk død, opprettholde gassstrømmen i >1 min for å minimere muligheten for at et dyr kan gjenopprette.
    3. Steriliser huden rundt svulsten ved hjelp av iodoforpinner. Samle svulster ved å fjerne tilstøtende ikke-tumorvev og plassere i en Petri-tallerken som inneholder 20 ml PBS, forkjølt (4 °C) før eutanasi.
    4. Vask svulstene med PBS i en annen Petri-tallerken for å fjerne blodkomponenter etterfulgt av å kutte i halvparten og fjerne eventuell ekstra hud, blodkar, forkalkning og/eller nekrose.
    5. Plasser bare intakte tumorstykker i et sterilt 50 ml sentrifugerør med 20 ml PBS, før du transporterer til et eget dyrerom for transplantasjon.

2. Subkutan tumorvekst

  1. Subkutan inokulasjon av tumorstykke i immunkompromitterte mus
    1. Klipp PDX-svulsten i 2 mm stykker med en skalpell, og legg hver i trokarer for subkutan (SC) implantasjon.
    2. Bedøv mottakerdyrene med 5% isofluran (vedlikeholdt av en nesekjegle ved 1%). Dyrene slapper av, mister sin rette refleks og til slutt blir immobile, til de ikke reagerer på smerte. Fest de bedøvede musene på et eksperimentbrett i riktig lateral posisjon og steriliser med iodoforpinner, spesielt områdene rundt stedet for tumorinokulering.
    3. På venstre flankehud bare kranial til hoften, gjør et 0,5 cm snitt med en skalpell og lag en tunnel under huden mot forbenet, 2-3 cm, ved hjelp av stumpe tang.
    4. Aseptisk overføre en kube av tumor fragment per inokulasjon sted fra mediet og plassere dypt inne i den subkutane tunnelen. Bekreft fragmentets posisjon visuelt før sårlukking med sårklemmer lukkes.
    5. Overvåk tumorimplantaterte mus (5) til de blir bevisste på å opprettholde sternal recumbence, og returner dem deretter til buret bare etter full gjenoppretting fra anestesi.
  2. Tumorbærende mus helseovervåking
    1. Sjekk vann- og matforbruket daglig og registrer kroppsvekt ukentlig.
    2. Kontroller musene under rutinemessig overvåking. Registrer eventuelle effekter på mobilitet, pust, grooming og generelt utseende, mat- og vannforbruk, BW gevinst / tap, ascites, etc.
    3. Mål TV to ganger i uken ved hjelp av kalipere og uttrykk i mm3 per: TV = 0,5 a × b2, hvor a og b er henholdsvis lengden og bredden på svulsten.
    4. Ofre dyr for å samle prøver når noen av følgende tegn vises: BW-tap >20%; nedsatt mobilitet (ikke i stand til å spise eller drikke); ikke i stand til å bevege seg normalt på grunn av betydelige ascites eller forstørret mage; innsats i åndedrett; død.

3. Nekropsi og tumorhøsting

  1. Når tumorvolumet nådde 200-800 mm3, euthanize mus per godkjente protokoller (se trinn 1.2.2).
  2. Samle tumorvev ved å fjerne tilstøtende ikke-tumorvev, etterfulgt av å plassere vevet i et 50 ml plastrør med AD +++ (på is) før dissosiasjon.

4. Forberedelse for PDX-avledet organoidkultur

MERK: Alle følgende trinn ble utført i et biosikkerhetsskap i henhold til retningslinjene for vevskulturstandard. Oppbevar forvarmede lagre på 96-, 24- og 6-brønnsplater i en 37 °C inkubator før bruk.

  1. Reagenspreparater
    1. Forbered kjellermembranekstrakt (BME) løsning (vekstfaktor redusert, Fenol rødfri). Oppbevar 10 ml BME i et 4 °C kjøleskap over natten. Når BME-flasken er tint, virvler du den for å sikre spredning.
    2. Klargjør basismedier/vaskebuffer AD+++. Tilsett 5 ml 200 mM L-glutamin, 1 M HEPES og Penn/Strep til avanserte DMEM/F12-medier ved å pipettere med en 5 ml pipette.
    3. Forbered kolon organoid medium som beskrevet av Sato et al.18 gjennom å supplere basismedier med N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/ml), Noggin (100 ng/ml), Nikotinamid (10 mM), SD202190 (10 nM), R-spondin (500 ng/ml), L-glutamin (2 mM), HEPES (10 μM), penicillin-streptomycin (1x) og Y-27623 (10 μM)19.
    4. Forbered AD+++Fordøyelsesmedium: 10 ml 1x organoidkulturmedier med 500 μL kollagenalus type II (20 mg/ml) og 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM).
  2. Tumor dissosiasjon20
    1. Overfør svulsten i et 50 ml plastrør til en 10 cm Petri-tallerken. Ta et makroskopisk fotografi sammen med en linjal og registrer en beskrivelse av forholdene (dvs. størrelse, fettvev, vaskularisering, nekrose, etc.).
    2. Fjern overflødig AD +++ ved aspirasjon, og kutt tumorvevet i små biter av saks etterfulgt av overføring av 1-2 stykker i et 2 ml mikrorør for snapfrysing på tørris. Oppbevars ved -80 °C for genomisk profilering. Hakk de resterende brikkene i finere biter med saks før overføring til et 50 ml plastrør ved hjelp av AD +++.
    3. Vask hakket vev 2-3 ganger med 35 ml AD+++, etterfulgt av tilsetning av 10 ml fordøyelsesmedium (se trinn 4.1.4) og plassering på en orbital shaker ved 4 x g i 1 t ved 37 °C.
    4. Homogeniser det fordøyde vevet ved å pipettere opp og ned ved hjelp av en 5 ml steril plastpipette, etterfulgt av tilsetning av 20 ml AD +++ og filtrering med 100 μm cellesil.
    5. Vask gjennomslaget to ganger med AD+++ (spinn ved 450 x g i 5 minutter), etterfulgt av resuspensjon i BME (tilsett 4x volum BME til pelletsen for suspensjon) og hold på is19.
  3. Fremstilling av organoid kultur
    1. Tilsett BME-cellefjæringen i 6-brønnsplaten i flere dråper til totalt 200 μL per brønn.
    2. Overfør platen til en inkubator på 37 °C. Etter 30 min størkner gelen.
    3. Tilsett 2 ml organoidmedier til hver brønn, med de representative dråpene registrert av mikroskopisk fotografering før du overfører til en inkubator (37 °C og 5 % CO2).
    4. Oppretthold organoidkulturene med middels forandring hver 3-4 dager, og passasje med et 1:2-forhold hver 7.

5. Histopatologi og neste generasjons sekvenseringsanalyse (NGS)

  1. Histopatologi
    1. Samle organoider fra brønnen med det eksisterende mediet ved hjelp av en P1000 pipette, etterfulgt av sentrifugering (spinn på 450 x g i 5 min), vask med PBS og fiksering i 10% formalin i 1 time.
    2. Plasser de faste organoidene i 100% gelatin på bunnen av 50 ml konisk rør, etterfulgt av rutinemessig vevsbehandling og innebygging.
    3. Utfør hematoksylin-eosin (H&E) farging ved hjelp av standardprotokoller på 4 mm parafinseksjoner.
  2. RNAseq og hele exome sekvensering
    1. Samle organoider fra brønnen med det eksisterende kulturmediet ved hjelp av en P1000 pipette, etterfulgt av sentrifugering ved hjelp av en mikrocentrifuge ved maksimal hastighet (12.000 x g) i 5 min ved 4 °C.
    2. Samle pellets ved å fjerne medium supernatant for å sikre at ingen synlig BME var til stede, etterfulgt av snap frysing i en mikrotube (tørris) og deretter overføre til en -80 °C fryser.
    3. Trekk ut RNA eller DNA ved hjelp av standard prosedyre fra produsenter og utfør NGS-analyse for både RNAseq og hele exome sekvensering (WES).

6. IC50 analyse20

  1. Organoid såing i 384-brønnsplate for IC50-analyse
    1. Dissosier organoider i BME-dråper fra hver brønn (fordøye BME) ved å tilsette 20 μL 100x dispaseoppløsning til hver brønn (6-brønns plate), som inneholdt 2 ml organoid medium, etterfulgt av 10 min inkubasjon ved 37 °C.
    2. Pipette fordøyde organoider fra alle brønner gjennom et 70 μm filter i et 50 ml plastrør for å samle organoidene.
    3. Tell organoidene under mikroskopi for bestemmelse av organoid konsentrasjon. Suspender organoidene ved hjelp av kulturmedium, før du tilsetter BME for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 % (v/v) på is.
    4. Tilsett 50 μL av organoidfjæringen i hver 384-brønnsplate med væskedispenseren, i henhold til platekartet med en såddtetthet på 200 CR2110 PDXOer per brønn i tilsvarende organoidkulturmedium.
  2. Cisplatin og irinotecan behandling
    1. Bruk cisplatin (med den høyeste konsentrasjonen på 100 μM) og "irinotecan" (med den høyeste konsentrasjonen på 10 μM). Tilsett SN-38 (en metabolitt av irinotekan, i motsetning til irinotekan som vanligvis brukes til in vivo-studier) til hver brønn i henhold til legemiddelfortynning ordningen for 9 doser, i seriell fortynning av digital dispenser.
    2. Lag platekartet ved hjelp av programvareverktøyet for digital dispenser. Inkluder et negativt kontrollkjøretøy med 100% levedyktighet og postiv kontroll av 5 μM starurosporine, som viste 0% levedyktighet.
    3. Plasser de legemiddelbehandlede 384-brønnsplatene tilbake i 37 °C inkubator.
  3. Bestemmelse av organoid celle levedyktighet etter legemiddelbehandling
    1. På slutten av de 5 dagene med legemiddelbehandling, bestem organoid celle levedyktighet ved hjelp av luminescerende celle levedyktighet reagenser i henhold til produsentens anbefalte prosedyre. Tilsett luminescerende reagens i hver brønn med væskedispeneren og bland i 5 min på en tallerken shaker, etterfulgt av en 30 min inkubasjon ved romtemperatur i mørket.
    2. Registrer lystetthetssignalet på en luminescens multi-brønn plateleser.
    3. Beregn normalisert viavansker for hver brønn ved hjelp av råavlesningene fra plateleseren og lag en doseresponskurve og IC50-verdier ved ikke-lineær kurvetilpasning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Morfologi av PDXOer, typisk for organoider under lysmikrokopi, og i samsvar med foreldre PDX per H&E farging
Under lysmikroskopi demonstrerer PDXO-CR2110 typisk cystisk morfologi (figur 1A), som beskrevet tidligere for pasientavledede organoider (PUD), bevis som støtter likheten mellom PDXO og PUD under de samme kulturforholdene.

Histopatologiske undersøkelser ved H&E-farging viser at vevsstrukturer og celletyper av PDXO-CR2110 (figur 1B) reflekterer den opprinnelige PDX-CR2110 (figur 1C), som støtter at PDX og PDXO ble utviklet fra samme opprinnelse: CR2110. Denne observasjonen gir histopatologi bevis for å støtte likheten av PDXO til sin foreldre PDX.

Transkripsjonsuttrykk og hele exome-sekvensering viser høy sammenheng mellom PDXO-CR2110 og foreldre-PDX-CR2110
PDX-CR2110 svulster har tidligere blitt genomisk profilert ved hjelp av transkripsjonssekvensering (RNAseq, mRNA)16 og hele eksom (WES, DNA) sekvensert. Vi har nå på samme måte profilert den tilsvarende PDXO-CR2110. De genomiske profilsammenligningene av det tilsvarende samsvarende PDX- og PDXO-uttrykket(figur 2) viser en høy korrelasjon på 94,92 % i transkripsjonsuttrykk (mRNA) (epigenetisk) og en høy konkordanse på 97,67 % av DNA-mutasjonene (WES) (genetisk), noe som tyder på en generell genomisk likhet mellom dette modellparet.

Likheter observert for de farmakologiske egenskapene mellom in vitro PDXO-CR2110 og in vivo PDX-CR2110
Legemiddelfølsomhetsanalyser ble utført på PDXO-CR2110 i 384-brønnsplater, med resultater vist i figur 3A. PDXO-CR2110 var følsom for irinotekan og motstandsdyktig mot cisplatin, samsvar med PDX-behandlingsresultater (figur 3B) der TGI (tumorveksthemming) ved dosenivåer på 100 mg/kg, dvs., Q3Dx3 for irinotekan og 5 mg/kg, dvs. Denne observerte farmakologikonsistensen støtter den potensielt biologiske ekvivalensen av begge modellene, og kan brukes til komplementære farmakologistudier in vitro og in vivo.

Figure 1
Figur 1: Morfologi av PDXO-CR2110. (A) Morfologi under lysmikroskopi (cystisk type). (B,C) Histopatologi av henholdsvis PDXO-CR2110 og PDX-CR2110. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Genomiske profiler av PDXO-CR2110 vs. PDX-CR2110, WES og RNAseq. Øvre panel: global mRNA-uttrykkskorrelasjon mellom PDX-CR2110 og PDXO-CR2110 per RNAseq. Nedre panel: tabell over både mRNA-uttrykkskorrelasjoner per RNAseq og DNA-mutasjonskordans per WES: PDX- vs PDXO-CR2110. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Farmakologiske egenskaper til både PDXO-CR2110 in vitro og SC PDX-CR2110 in vivo. (A) PDXO-CR2110 in vitro dose-respons på testforbindelsene. (B) Tumorvekstinhibering indusert av de samme testforbindelsene på CR2110 in vivo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De foreløpige dataene for PDX-/PDXO-CR2110 i denne rapporten støtter den biologiske ekvivalensen mellom PDX og dets derivat, PDXO, med hensyn til genomikk, histopatologi og farmakologi, siden begge modellene representerer sykdomsformene avledet fra den opprinnelige CSC av pasienten. Begge modellene er pasientavledede sykdomsmodeller, potensielt prediktive for pasientenes kliniske respons10,11,12,21. Det matchede paret in vitro- og in vivo-modeller kan utfylle hverandre for in vitro screening og validering in vivo, forbedre suksessraten for narkotikaoppdagelse og potensielt redusere utmattelsesraten i klinisk utvikling. Det er verdt å merke seg at PDXO nå kan gjøre det mulig for HTS å dra nytte av tilgjengelige store pasientavledede organoidbiblioteker, der PDX-er mislykkes på grunn av høye in vivo-kostnader og lengre tidslinjer. Unødvendig å si, et matchet PDX-PDXO-bibliotek vil sannsynligvis bli den foretrukne plattformen for å støtte narkotikaoppdagelse og translasjonell forskning i nær fremtid.

Konvertering av det eksisterende biblioteket med kommenterte PDX-modeller kan være en rask og produktiv tilnærming til å bygge et praktisk organoidbibliotek ved å bruke en industriell prosess. Denne rapporten konverterte en PDX til PDXO for å utforske gjennomførbarheten av en slik prosess, og metoden som brukes kan være et grunnlag for å støtte storskala prosess for å bygge et omfattende PDXO-bibliotek. Praktisk sett er metodene for å lage PDXO generelt lik den mye beskrevne metoden for generering av PUD18, med unntak av kilden til at pasientvevet er mus.

Det er kritiske trinn for å sikre at PDXOer er vellykket opprettet: 1) de friske PDX-svulstene er fragmentert i små biter; 2) kulturforholdene beskrevet for organoidkultur som beskrevet av Clevers og kolleger er trofast implementert18,22, men kan justeres for forskjellige organoider; 3) forskjellige organoider har forskjellige vekstrater, som påvirker varigheten for organoid kultur og helse, samt varigheten av narkotikabehandlingen; 4) en effektiv analyse for å bestemme museinnhold vs. menneskelig innhold er helt avgjørende for å sikre at kulturene i stor grad er menneskelig organoid, siden noen kulturer uunngåelig kan ha vedvarende musevev / celleforurensning (i tilfelle rapportert her, er det minimal musevevforurensning, data ikke vist). Museforurensning kan være en av de viktige begrensningene for å lage PDXO biobanker hvis effektive deteksjons- og fjerningsmetoder ikke brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er nåværende heltidsansatte i Crown Bioscience, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi og Rajendra Kumari for kritisk lesing og redigering av manuskriptet. Forfatterne vil også takke Crown Bioscience Oncology in vitro og in vivo team for deres store tekniske innsats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634028 Base medium
DMEM Hyclone SH30243.01 Washing medium
Collagenese type II Invitrogen 17101015 Digest tumor
Matrigel Corning 356231 Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac Sigma A9165 Organoid culture medium
A83-01 Tocris 2939 Organoid culture medium
B27 Life Technologies 17504044 Organoid culture medium
EGF Peprotech AF-100-15 Organoid culture medium
Noggin Peprotech 120-10C Organoid culture medium
Nicotinamide Sigma N0636 Organoid culture medium
SB202190 Sigma S7076 Organoid culture medium
Gastrin Sigma G9145 Organoid culture medium
Rspondin Peprotech 120-38-1000 Organoid culture medium
L-glutamine Life Technologies 35050038 Organoid culture medium
Hepes Life Technologies 15630056 Organoid culture medium
penicillin-streptomycin Life Technologies 15140122 Organoid culture medium
Y-27632 Abmole M1817 Organoid culture medium
Dispase Life Technologies 17105041 Screening assay
CellTiter-Glo 3D Promega G9683 Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser Thermo Fisher Multidrop combi Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener Tecan D300e Compound addition
Envision Plate reader Perkin Elmer 2104 Luminescence reading
Balb/c nude mice Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit Qiagen 74104 tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 DNA purification kit
Histogel Thermo Fisher HG-4000-012 Organoid embedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, (6), 338-350 (2012).
  2. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  3. Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132, (2), 74-84 (2013).
  4. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  6. Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18, (7), 407-418 (2018).
  7. Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22, (3), 290-291 (2018).
  8. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, (1-2), 373-386 (2018).
  9. Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (43), 13308-13311 (2015).
  10. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359, (6378), 920-926 (2018).
  11. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26, (1), 17-26 (2020).
  12. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, (10), 1607-1614 (2019).
  13. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161, (4), 933-945 (2015).
  14. Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88, (3), 282-292 (2006).
  15. Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
  16. Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6, (38), 40815-40821 (2015).
  17. Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76, (16), 4619-4626 (2016).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
  20. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25, (5), 838-849 (2019).
  21. Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. (2015).
  22. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160, (1-2), 299-312 (2015).
Opprette matchede in vivo/in vitro pasientavledede modellpar av PDX- og PDX-avledede organoider for kreftfarmakologiforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).More

Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter