Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Создание соответствующих пар моделей IN vivo/In vitro, полученных от пациента, органоидов PDX и PDX для исследований фармакологии рака

doi: 10.3791/61382 Published: May 5, 2021

Summary

Описан способ создания органоидов с использованием полученных от пациента ксенотрансплантатов (PDX) для скрининга in vitro, в результате чего получаются совпадают пары моделей in vivo /in vitro. Опухоли PDX собирали / перерабатывали на мелкие кусочки механически или ферментаматически, за которым следовал метод Клеверса для выращивания опухолевых органоидов, которые были проницаемы, криоконсервированы и охарактеризованы против оригинального PDX.

Abstract

Полученные от пациента опухолевые ксенотрансплантаты (PDX) считаются наиболее прогностическими доклиническими моделями, которые, как полагают, в значительной степени основаны на раковых стволовых клетках (CSC) для обычной оценки лекарств от рака. Большая библиотека PDX отражает разнообразие популяций пациентов и, таким образом, позволяет проводить доклинические испытания на основе популяций («Фаза II-подобных клинических испытаний на мышах»); однако PDX имеют практические ограничения низкой пропускной способности, высоких затрат и длительности. Опухолевые органоиды, также производные от пациента моделями, управляемыми CSC, можно рассматривать как эквивалент PDX in vitro, преодолевая определенные ограничения PDX для работы с большими библиотеками органоидов или соединений. Это исследование описывает метод создания органоидов, полученных из PDX (PDXO), что приводит к парным моделям для фармакологических исследований in vitro и in vivo. Подкожно пересаженные опухоли PDX-CR2110 были собраны у опухоленосных мышей, когда опухоли достигали 200-800мм3,согласно утвержденной процедуре вскрытия, с последующим удалением соседних неопухолевых тканей и диссоциацией на мелкие фрагменты опухоли. Небольшие фрагменты опухоли промывали и пропускали через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм для удаления обломков. Кластеры клеток собирали и суспендировали в растворе экстракта базальной мембраны (BME) и покрыли 6-скважинной пластиной в виде твердой капли с окружающей жидкой средой для роста в инкубаторе CO2. Рост органоидов контролировали два раза в неделю под световой микроскопией и регистрировали фотографированием с последующим изменением жидкой среды 2 или 3 раза в неделю. Выращенные органоиды были дополнительно проходимы (через 7 дней) в соотношении 1:2 путем разрушения встроенных органоидов BME с помощью механической сдвига, чему способствовало добавление трипсина и добавление 10 мкМ Y-27632. Органоиды были криоконсервированы в криотрубках для длительного хранения после высвобождения из BME путем центрифугирования, а также отобраны (например, ДНК, РНК и блок FFPE) для дальнейшей характеристики.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рак — это совокупность разнообразных генетических и иммунологических нарушений. Успешная разработка эффективных методов лечения в значительной степени зависит от экспериментальных моделей, которые эффективно предсказывают клинические результаты. Большие библиотеки хорошо охарактеризованных ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX), уже давно рассматриваются как трансляционная система in vivo выбора для тестирования химио- и / или таргетной терапии из-за их способности резюмировать характеристики опухоли пациента, гетерогенность и реакцию пациента на лекарства1,что позволяет клиническим испытаниям на мышах, подобным фазеII,улучшить клинический успех2,3. PDX обычно рассматриваются как заболевания раковых стволовых клеток, отличающиеся генетической стабильностью, в отличие от ксенотрансплантатов, полученных из клеточных линий2. За последние несколько десятилетий во всем мире были созданы большие коллекции PDX, которые сегодня становятся рабочей лошадкой разработки лекарств от рака. Несмотря на широкое использование и большую трансляционную ценность, эти модели животных по своей сути являются дорогостоящими, трудоемкими и малопроизводительными, поэтому недостаточны для крупномасштабного скрининга. PDX также нежелательны для иммуноонкологического тестирования (IO) из-за иммуноскомпрометированной природы4. Таким образом, нецелесообразно в полной мере использовать доступную большую библиотеку PDX.

Недавние открытия, впервые сделанные лабораторией Ганса Клеверса5,привели к созданию in vitro культур органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток, в большинстве органов человека эпителиального происхождения5. Эти протоколы были дополнительно доработаны, чтобы обеспечить рост органоидов из предполагаемых CSC при карциномах человека различных показаний6,7. Эти органоиды, полученные от пациента (PPO), являются геномно-стабильными8,9 и, как было показано, высоко прогнозируют результаты клиническоголечения 10,11,12. Кроме того, природа PPO in vitro обеспечивает высокопроизводительный скрининг (HTS)13,тем самым потенциально предлагая преимущество перед моделями in vivo и используя большие библиотеки органоидов в качестве суррогата популяции пациентов. PPO готовы стать важной платформой для открытий и трансляции, преодолевая многие ограничения PDX, описанные выше.

Как PDO, так и PDX являются моделями, полученными от пациентов и управляемыми CSC, с возможностью оценки терапевтических средств в контексте либо персонализированного лечения, либо формата клинических испытаний. Существующие большие библиотеки PDX, такие как собственная коллекция >3000 PDXs14,15,16,17,поэтому подходят для быстрой генерации библиотек опухолевых органоидов (PDX-производных органоидов или PDXO), что приводит к сопоставлению библиотеки парных моделей PDX и PDXO. В настоящем отчете описана процедура создания и характеристики колоректального рака PDXO-CR2110 по отношению к его родительской модели PDX-CR211016.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все протоколы и поправки или процедуры, связанные с уходом за животными и их использованием, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) до проведения исследований. Уход и использование животных проводились в соответствии с Международными руководящими принципами AAALAC (Ассоциация по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными), как сообщается в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, Национальный исследовательский совет (2011). Все экспериментальные процедуры на животных проводились в стерильных условиях в учреждениях SPF (без конкретных патогенов) и проводились в строгом соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию из различных государственных учреждений (например, Национальных институтов здравоохранения). Протоколы были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных в учреждении учреждения (например, институциональным комитетом IACUC).

1. Подготовка к трансплантации опухоли

  1. Содержание животных
    1. Дом бальб/с обнаженных мышей (n=5) в отдельных вентилируемых клетках, при 20-26 °C, влажности 30-70% и цикле освещения 12-ч света/12-ч темноты, с еженедельной подстилкой из кукурузных початков и облучением стерилизованной сухой гранулированной пищи плюс стерильная питьевая вода ad libitum.
  2. Подготовка фрагмента донорской опухоли
    1. Внимательно следите за опухолевыми донорскими мышами на наличие массы тела (BW, через весы) и объема опухоли (TV, путем измерения суппорта).
    2. Когда телевизор достигнет 800-1000мм3,усыплите опухоленосных животных в капюшон биологической опасности.
      1. Поместите мышей в камеру эвтаназии с крышкой, которая доставляет газ CO2 в камеру. Сброс газа в камеру со скоростью потока, которая производит быстрое бессознательное состояние с минимальным дистрессом для животного. Оптимальный расход для CO2 составляет около 2-2,5 л/мин.
      2. Обеспечьте эвтаназию, наблюдая, что животные не восстанавливают сознание.
      3. После очевидной клинической смерти поддерживайте поток газа в течение >1 мин, чтобы свести к минимуму вероятность того, что животное может выздороветь.
    3. Стерилизуйте кожу вокруг опухоли с помощью йодофорных тампонов. Соберите опухоли, удалив соседние неопухолевые ткани и поместив в чашку Петри, содержащую 20 мл PBS, предварительно охлажденный (4 ° C) перед эвтаназией.
    4. Промыть опухоли pBS в другой чашке Петри, чтобы удалить компоненты крови, а затем разрезать пополам и удалить лишнюю кожу, кровеносные сосуды, кальцификацию и / или некроз.
    5. Поместите только неповрежденные кусочки опухоли в стерильную 50-мл центрифужную трубку с 20 мл PBS перед транспортировкой в отдельную комнату для трансплантации животных.

2. Рост подкожной опухоли

  1. Подкожная инокуляция опухолевого куска мышам с ослабленным иммунитетом
    1. Разрежьте опухоль PDX на кусочки по 2 мм скальпелем и поместите каждую в троакары для подкожной (SC) имплантации.
    2. Обезболивать животных-реципиентов 5% изофлурана (поддерживается носовым конусом на уровне 1%). Животные расслабляются, теряя свой правый рефлекс и в конечном итоге становясь неподвижными, пока не реагируют на боль. Зафиксируйте обезболенные мыши на экспериментальной доске в правильном боковом положении и стерилизуйте йодофорными тампонами, особенно области, окружающие место прививки опухоли.
    3. На левом фланге кожи как раз черепно к бедру делают разрез 0,5 см скальпелем и создают туннель под кожей в сторону передних конечностей, 2-3 см, используя тупые щипцы.
    4. Асептически перенести один куб фрагмента опухоли на место прививки из среды и поместить глубоко внутрь подкожного туннеля. Визуально подтвердить положение фрагмента до закрытия раны раневыми клипсами.
    5. Следите за опухолью имплантированных мышей (5) до тех пор, пока они не пристанут в сознание, чтобы сохранить стернальное лежание, а затем верните их в свою клетку только после их полного восстановления после анестезии.
  2. Мониторинг здоровья опухоленосных мышей
    1. Проверяйте потребление воды и пищи ежедневно и регистрируйте массу тела еженедельно.
    2. Проверьте мышей во время обычного мониторинга. Регистрировать любые эффекты на подвижность, дыхание, уход и общий внешний вид, потребление пищи и воды, увеличение / потерю BW, асцит и т. Д.
    3. Измеряют ТВ два раза в неделю с помощью суппортов и экспресс в мм3 пер: ТВ = 0,5 а × b2, где a и b — длина и ширина опухоли соответственно.
    4. Жертвоприношение животных для сбора образцов при появлении любого из следующих признаков: потеря БО >20%; нарушение подвижности (неспособность есть или пить); неспособность нормально двигаться из-за значительного асцита или увеличения живота; усилие в дыхании; смерть.

3. Некропсия и сбор опухолей

  1. Когда объем опухоли достигнет 200-800мм3,усыплите мышей по утвержденным протоколам (см. шаг 1.2.2).
  2. Соберите опухолевые ткани, удалив соседние неопухолевые ткани, а затем поместив ткань в пластиковую трубку объемом 50 мл с AD + ++ (на льду) перед диссоциацией.

4. Подготовка к органоидной культуре, полученной из PDX

ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги были выполнены внутри шкафа биобезопасности в соответствии со стандартными рекомендациями по культуре тканей. Перед использованием храните предварительно нагретые запасы плит из 96, 24 и 6 скважин в инкубаторе с 37 °C.

  1. Препараты реагентов
    1. Готовят раствор экстракта базальной мембраны (BME) (фактор роста снижен, фенол не содержит красного цвета). Хранить 10 мл BME в холодильнике с 4 °C на ночь. После размораживания закрутите бутылку BME, чтобы обеспечить диспергирование.
    2. Подготовьте базовый носитель/буфер мойки AD+++. Добавьте 5 мл 200 мМ L-глутамина, 1 М HEPES и Pen/Strep в жим Advanced DMEM/F12 путем пипетки 5 мл.
    3. Готовят органоидную среду толстой кишки, как описано Sato et al.18, путем дополнения базовых сред N-Ac (1 мМ), A83-01 (500 нМ), B27 (1x), EGF (50 нг / мл), Ноггин (100 нг / мл), никотинамид (10 мМ), SD202190 (10 нМ), R-спондин (500 нг / мл), L-глутамин (2 мМ), HEPES (10 мкМ), пенициллин-стрептомицин (1x) и Y-27623 (10 мкМ)19.
    4. Приготовьте AD+++Пищеварительную среду: 10 мл 1x органоидной культуральной среды с 500 мкл коллагеназы типа II (20 мг/мл) и 10 мкл RhoKI Y-27632 (10 мМ).
  2. Диссоциация опухоли20
    1. Перенесите опухоль в пластиковой трубке объемом 50 мл в чашку Петри 10 см. Сделайте макроскопическую фотографию рядом с линейкой и запишите описание ее состояния (например, размер, жировые ткани, васкуляризация, некроз и т. Д.).
    2. Удалите избыток AD+++ путем аспирации и разрежьте опухолевую ткань на мелкие кусочки ножницами с последующим переносом 1-2 кусочков в микротрубку объемом 2 мл для замораживания на сухом льду. Хранить при -80 °C для геномного профилирования. Измечить оставшиеся кусочки на более мелкие кусочки ножницами перед переносом в пластиковую трубку объемом 50 мл с помощью AD+++.
    3. Промыть измельченную ткань 2-3 раза по 35 мл AD+++, с последующим добавлением 10 мл среды для пищеварения (см. этап 4.1.4) и размещением на орбитальном шейкере при 4 х г в течение 1 ч при 37 °C.
    4. Гомогенизировать переваренные ткани путем пипетирования вверх и вниз с использованием 5 мл стерильной пластиковой пипетки с последующим добавлением 20 мл AD+++ и фильтрацией 100 мкм клеточным ситечком.
    5. Промыть проход дважды AD+++ (открутить при 450 х г в течение 5 мин), затем повторно суспендировать в БМЭ (добавить 4х объем БМЭ в гранулу для суспензии) и держать нальду 19.
  3. Приготовление органоидной культуры
    1. Добавьте суспензию ячейки BME в 6-скважинную пластину несколькими каплями в общей сложности до 200 мкл на скважину.
    2. Перенесите пластину в инкубатор при 37 °C. Через 30 мин гелевые капли затвердевает.
    3. Добавьте 2 мл органоидных сред в каждую скважину, при этом репрезентативные капли регистрируются микроскопической фотографией перед переносом в инкубатор (37 °C и 5% CO2).
    4. Поддерживают органоидные культуры со средним изменением каждые 3-4 дня и прохождением в соотношении 1:2 каждые 7 дней или в зависимости от их роста и плотности.

5. Анализ гистопатологии и секвенирования следующего поколения (NGS)

  1. Гистопатология
    1. Собирают органоиды из скважины с имеющейся средой с помощью пипетки Р1000 с последующим центрифугированием (отжим при 450 х г в течение 5 мин), промывкой ПБС и фиксацией в 10% формалине в течение 1 ч.
    2. Поместите неподвижные органоиды в 100% желатин на дно конической трубки 50 мл с последующей рутинной обработкой и встраиванием тканей.
    3. Выполняйте окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) с использованием стандартных протоколов на 4 мм парафиновых сечениях.
  2. RNAseq и секвенирование всего экзома
    1. Собирают органоиды из скважины с существующей питательной средой с помощью пипетки P1000 с последующим центрифугированием с использованием микроцентрифуги на максимальной скорости (12 000 х г)в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Соберите гранулу, удалив супернатант среды, чтобы убедиться, что не было видимого BME, с последующим замораживанием в микропробирке (сухом льду), а затем перенесите в морозильную камеру с температурой -80 °C.
    3. Извлеките РНК или ДНК с использованием стандартной процедуры от производителей и выполните анализ NGS как для RNAseq, так и для секвенирования всего экзома (WES).

6. Ic50 анализ20

  1. Посев органоидов в 384-скважинную пластину для анализа IC50
    1. Диссоциация органоидов в каплях BME из каждой скважины (переваривание BME) путем добавления 20 мкл 100-кратного диспазного раствора в каждую скважину (6-скважинную пластину), которая содержала 2 мл органоидной среды с последующим 10 мин инкубации при 37 °C.
    2. Пипетка переварила органоиды из всех скважин через фильтр 70 мкм в пластиковую трубку объемом 50 мл для сбора органоидов.
    3. Подсчитайте органоиды под микроскопией для определения концентрации органоидов. Приостановить органоиды, используя культуральную среду, перед добавлением BME для достижения конечной концентрации 5% (v/v) на льду.
    4. Добавьте 50 мкл органоидной суспензии в каждую 384-скважинную пластину с жидкостным дозатором, согласно карте пластин с плотностью посева 200 CR2110 PDXOs на скважину в соответствующей органоидной питательной среде.
  2. Лечение цисплатином и иринотеканом
    1. Используют цисплатин (с наибольшей концентрацией 100 мкМ) и «иринотекан» (с самой высокой концентрацией 10 мкМ). Добавляют SN-38 (метаболит иринотекана, в отличие от иринотекана, который обычно используют для исследований in vivo) в каждую скважину по схеме разведения препарата на 9 доз, в серийном разведении цифровым диспенсером.
    2. Создайте карту пластин с помощью программного обеспечения цифрового дозатора. Включите автомобиль с отрицательным управлением со 100% жизнеспособностью и постивным контролем 5 мкМ старуроспорина, который показал 0% жизнеспособность.
    3. Поместите обработанные препаратом 384-скважинные пластины обратно в инкубатор с 37 °C.
  3. Определение жизнеспособности органоидных клеток после медикаментозного лечения
    1. В конце 5 дней лечения препаратом определяют жизнеспособность органоидных клеток с помощью реагентов жизнеспособности люминесцентных клеток в соответствии с рекомендованной производителем процедурой. Добавьте люминесцентный реагент в каждую скважину с жидким диспенером и перемешайте в течение 5 минут на пластинчатом шейкере, после чего 30 минут инкубируйте при комнатной температуре в темноте.
    2. Запись люминесцентного сигнала на люминесцентный многоязычный пластинчатый считыватель.
    3. Рассчитайте нормализованные жизнеспособности каждой скважины, используя необработанные показания считывателя пластин, и создайте кривую доза-отклик и значения IC50 путем нелинейной подгонки кривой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Морфология PDXOs, типичная для органоидов при световой микроскопии и согласующаяся с родительским PDX на окрашивание H&E
При световой микроскопии PDXO-CR2110 демонстрирует типичную кистозную морфологию(рисунок 1A),как описано ранее для органоидов, полученных от пациента (PDO), что подтверждает сходство между PDXO и PDO в одних и тех же условиях культивирования.

Гистопатологическое исследование окрашиванием H&E показывает, что тканевые структуры и типы клеток PDXO-CR2110(Рисунок 1B)отражают оригинальный PDX-CR2110(Рисунок 1C),подтверждая, что PDX и PDXO были разработаны из одного и того же происхождения: CR2110. Это наблюдение предоставляет гистопатологические доказательства в поддержку сходства PDXO с его родительским PDX.

Экспрессия транскриптома и секвенирование всего экзома демонстрируют высокую корреляцию между PDXO-CR2110 и родительским PDX-CR2110
Опухоли PDX-CR2110 ранее были геномно профилированы с использованием секвенирования транскриптома (RNAseq,mRNA) 16 и секвенирования всего экзома (WES, ДНК). Теперь мы аналогичным образом профилировали соответствующий PDXO-CR2110. Сравнение геномного профиля соответствующих совпадающих PDX и PDXO(рисунок 2)демонстрирует высокую корреляцию 94,92% в экспрессии транскриптома (мРНК) (эпигенетическая) и высокое соответствие 97,67% мутаций ДНК (WES) (генетических), что свидетельствует об общем геномном сходстве между этой парой моделей.

Сходство фармакологических свойств между in vitro PDXO-CR2110 и in vivo PDX-CR2110
Анализы чувствительности к лекарственным средствам проводились на PDXO-CR2110 в 384-скважинных пластинах, результаты показаны на рисунке 3А. PDXO-CR2110 был чувствителен к иринотекану и резистент к цисплатину, что согласуется с результатами лечения PDX(рисунок 3B),где TGI (ингибирование роста опухоли) при уровнях дозы 100 мг/кг, т.п., Q3Dx3 для иринотекана и 5 мг/кг, т.п., Q4Dx4 для цисплатина составляет 84,63% и 6,61% соответственно. Эта наблюдаемая фармакологическая последовательность поддерживает потенциально биологическую эквивалентность обеих моделей и может быть использована для дополнительных фармакологических исследований in vitro и in vivo.

Figure 1
Рисунок 1: Морфология PDXO-CR2110. (А) Морфология под световой микроскопией (кистозный тип). (В,В) Гистопатология PDXO-CR2110 и PDX-CR2110 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Геномные профили PDXO-CR2110 против PDX-CR2110, WES и RNAseq. Верхняя панель: глобальная корреляция экспрессии мРНК между PDX-CR2110 и PDXO-CR2110 на RNAseq. Нижняя панель: таблица корреляций экспрессии мРНК на RNAseq и конкордантности мутаций ДНК на WES: PDX- vs PDXO-CR2110. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Фармакологические свойства pdxo-CR2110 in vitro и SC PDX-CR2110 in vivo. (A)PDXO-CR2110 in vitro доза-реакция на исследуемые соединения. (B) Ингибирование роста опухоли, индуцированное теми же исследуемыми соединениями на CR2110 in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Предварительные данные для PDX-/PDXO-CR2110 в этом отчете подтверждают биологическую эквивалентность между PDX и его производным, PDXO, в отношении геномики, гистопатологии и фармакологии, поскольку обе модели представляют формы заболевания, полученные из исходного CSC пациента. Обе модели являются моделями заболеваний, полученными от пациента, потенциально прогностическими клиническим ответом пациентов10,11,12,21. Согласованная пара моделей in vitro и in vivo может дополнять друг друга для скрининга in vitro и валидации in vivo, улучшая показатель успеха открытия лекарств и потенциально снижая показатели истощения в клинической разработке. Стоит отметить, что PDXO теперь может позволить HTS использовать доступные большие органоидные библиотеки, полученные от пациентов, где PDX терпят неудачу из-за высоких затрат in vivo и более длительных сроков. Излишне говорить, что соответствующая библиотека PDX-PDXO, вероятно, станет платформой выбора для поддержки открытия лекарств и трансляционных исследований в ближайшем будущем.

Преобразование существующей библиотеки аннотированных моделей PDX может быть быстрым и продуктивным подходом к созданию практической органоидной библиотеки с использованием промышленного процесса. Этот отчет преобразовал один PDX в PDXO для изучения осуществимости такого процесса, и используемый метод может стать основой для поддержки крупномасштабного процесса создания обширной библиотеки PDXO. Практически, методы создания PDXO в целом аналогичны широко описанной методике генерации PDO18,за исключением того, что источником ткани пациента являются мыши.

Существуют критические шаги для обеспечения успешного создания PDXO: 1) свежие опухоли PDX фрагментированы на мелкие кусочки; 2) условия культивируемой культуры, описанные для органоидной культуры, как описано Клеверсом и его коллегами, точно реализованы18,22,но могут быть скорректированы для разных органоидов; 3) различные органоиды имеют разные темпы роста, что влияет на продолжительность культуры органоидов и здоровье, а также на продолжительность лечения препаратом; 4) эффективный анализ для определения содержания мыши и человеческого содержимого абсолютно необходим для обеспечения того, чтобы культуры были в значительной степени органоидными для человека, поскольку некоторые культуры могут неизбежно иметь стойкое загрязнение тканей / клеток мыши (в случае, о котором сообщается здесь, существует минимальное загрязнение тканей мыши, данные не показаны). Загрязнение мышей может быть одним из важных ограничений при создании биобанков PDXO, если не используются эффективные методы обнаружения и удаления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы являются нынешними штатными сотрудниками Crown Bioscience, Inc.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Джоди Барбо, Федерику Паризи и Раджендру Кумари за критическое прочтение и редактирование рукописи. Авторы также хотели бы поблагодарить команду Crown Bioscience Oncology in vitro и in vivo за их большие технические усилия.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634028 Base medium
DMEM Hyclone SH30243.01 Washing medium
Collagenese type II Invitrogen 17101015 Digest tumor
Matrigel Corning 356231 Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac Sigma A9165 Organoid culture medium
A83-01 Tocris 2939 Organoid culture medium
B27 Life Technologies 17504044 Organoid culture medium
EGF Peprotech AF-100-15 Organoid culture medium
Noggin Peprotech 120-10C Organoid culture medium
Nicotinamide Sigma N0636 Organoid culture medium
SB202190 Sigma S7076 Organoid culture medium
Gastrin Sigma G9145 Organoid culture medium
Rspondin Peprotech 120-38-1000 Organoid culture medium
L-glutamine Life Technologies 35050038 Organoid culture medium
Hepes Life Technologies 15630056 Organoid culture medium
penicillin-streptomycin Life Technologies 15140122 Organoid culture medium
Y-27632 Abmole M1817 Organoid culture medium
Dispase Life Technologies 17105041 Screening assay
CellTiter-Glo 3D Promega G9683 Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser Thermo Fisher Multidrop combi Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener Tecan D300e Compound addition
Envision Plate reader Perkin Elmer 2104 Luminescence reading
Balb/c nude mice Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit Qiagen 74104 tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 DNA purification kit
Histogel Thermo Fisher HG-4000-012 Organoid embedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, (6), 338-350 (2012).
  2. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  3. Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132, (2), 74-84 (2013).
  4. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  6. Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18, (7), 407-418 (2018).
  7. Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22, (3), 290-291 (2018).
  8. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, (1-2), 373-386 (2018).
  9. Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (43), 13308-13311 (2015).
  10. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359, (6378), 920-926 (2018).
  11. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26, (1), 17-26 (2020).
  12. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, (10), 1607-1614 (2019).
  13. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161, (4), 933-945 (2015).
  14. Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88, (3), 282-292 (2006).
  15. Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
  16. Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6, (38), 40815-40821 (2015).
  17. Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76, (16), 4619-4626 (2016).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
  20. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25, (5), 838-849 (2019).
  21. Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. (2015).
  22. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160, (1-2), 299-312 (2015).
Создание соответствующих пар моделей IN vivo/In vitro, полученных от пациента, органоидов PDX и PDX для исследований фармакологии рака
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).More

Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter