Summary
Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.
Abstract
Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel, wat leidt tot zuurstof- en glucosedeprivatie, en het daaruit voortvloeiende neuronale verlies. Tal van aanwijzingen dat de interactie tussen glia- en neuronale cellen gunstige effecten uitoefent na een ischemische gebeurtenis. Daarom, om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen. Hierin presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van de rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke cultuur media, maakt de oprichting van neuron- of astrocyten verrijkt culturen of neuron-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid.
Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor op basis van een co-cultuursysteem waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multiwellplaten. De twee culturen worden gescheiden gehouden door kleine paraffinebollen. Deze aanpak maakt het mogelijk de onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandelingen op elk celtype, die een voordeel in veel studies vertegenwoordigt.
Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.
Introduction
Volgens gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie sterven jaarlijks ongeveer 5,5 miljoen mensen aan ischemische beroerte1. Deze aandoening wordt gekenmerkt door de onderbreking van de bloedtoevoer naar een bepaald hersengebied, wat resulteert in een omkeerbaar of onomkeerbaar verlies in de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar het weefsel, wat de weefselfunctie verandert en leidt tot mitochondriale disfunctie, calciumdysregulatie, glutamaat excitotoxiciteit, ontsteking en celverlies2,3.
Afgezien van vasculaire cellen, neuronale en gliacellen zijn betrokken bij de pathofysiologie van de ischemische beroerte4. In het bijzonder, astrocyten zijn essentieel voor het onderhoud van neuronen en onlangs bleek een cruciale rol te spelen in de reactie op de ischemische laesie5. Dit type gliacel vervult functies van structurele ondersteuning, verdediging tegen oxidatieve stress, synthese van neurotransmitters, stabilisatie van celcelcommunicatie, onder andere6. Samen met neuronen, astrocyten spelen een directe rol in synaptische transmissie, het reguleren van de afgifte van moleculen zoals adenosine triphosfat, gamma-aminoboterzuur en glutamaat7. Een deel van de schade veroorzaakt door ischemie wordt veroorzaakt door de overmatige afgifte van glutamaat en de accumulatie ervan op de synaptische kloof, wat leidt tot de overactivatie van N-methyl-D-aspartaatreceptoren, het activeren van downstream signaalcascades, wat uiteindelijk resulteert in excitotoxiciteit8. Aangezien astrocyten glutamaat uit de synaptische kloof kunnen verwijderen en omzetten in glutamine, zijn ze cruciaal in het verdedigen tegen excitotoxiciteit, waardoor een neuroprotectief effect op ischemie wordt uitgeoefend. Deze cellen spelen ook een rol in ischemie-geïnduceerde neuro-ontsteking. Na de ischemische belediging ondergaan geactiveerde astrocyten morfologische veranderingen (hypertrofie), vermenigvuldigen, en tonen een toename van de gliafibrillaire zure eiwit (GFAP) expressie. Ze kunnen reactief worden (astroglise), het vrijgeven van pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrose factor-α, interleukine-1α en interleukine-1β, en het produceren van vrije radicalen, waaronder stikstofmonoxide en superoxide, die op hun beurt kan leiden tot neuronale dood9,10. In tegenstelling, reactieve astrocyten kunnen ook een neuroprotectief effect spelen, omdat ze ontstekingsremmende cytokinen afgeven, zoals het transformeren van groeifactor-β, die na beroerte11upgereguleerd is. Bovendien kunnen ze een glialitteken genereren, dat weefselregeneratie kan beperken door het remmen van axonale kiemen; dit glialitteken kan echter de letselplaats isoleren van levensvatbaar weefsel, waardoor een trapsgewijze golf van ongecontroleerde weefselschade12,13wordt voorkomen .
Zo is het noodzakelijk om modellen vast te stellen die het mogelijk maken het bestuderen van neuron-glia interacties onder een ischemische schade om therapeutische strategieën die beperken of omkeren van de effecten van ischemische letsel te vinden. In vergelijking met andere modellen die worden gebruikt om ischemische letsel te bestuderen, namelijk in vivo modellen14,15,16, organotypic culturen17,18,19 en acute hersenschijfjes20,21,22, primaire celculturen zijn minder complex, waardoor de studie van individuele bijdragen van elk celtype in de pathofysiologie van ischemische beroerte en hoe elk celtype reageert op mogelijke therapeutische doelen mogelijk maakt. Typisch, om de interacties tussen neuron-verrijkte culturen en astrocyten verrijkte culturen te bestuderen, neuronen en gliacellen van postnatale oorsprong worden gebruikt23,,24, of postnatale gliacellen en embryonale neuronen25,26. Hierin wordt voorgesteld een eenvoudige aanpak om neuron- of astrocyten verrijkte culturen en neuron-glia culturen vast te stellen uit hetzelfde weefsel. Deze primaire cellen worden verkregen uit rat embryonale cortex, een gebied vaak beïnvloed door beroerte27,28. Bovendien wordt de dissociatie van het weefsel alleen uitgevoerd door een mechanische procedure. Daarom maakt dit protocol het isoleren van cellen in dezelfde ontwikkelingsfase mogelijk, op een snelle en goedkope manier, en met hoge prestaties en reproduceerbaarheid.
De crosstalk tussen astrocyten en neuronen kan worden onderzocht met behulp van een co-cultuur systeem waarin neuronen gekweekt in coverslips worden onderhouden in contact met een monolaag van astrocyten gezaaid in multiwell platen. Kleine paraffinebollen kunnen worden gebruikt om de scheiding van de twee celculturen te garanderen. Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie van elk celtype mogelijk voordat ze in contact worden gebracht. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een specifiek gen in astrocyten het zwijgen op te leggen en te zien hoe het de neuronale kwetsbaarheid of bescherming tegen ischemische schade kan beïnvloeden. Een gevestigde methode om ischemische omstandigheden in vitro te induceren is zuurstof- en glucosedeprivatie (OGD)3, die bestaat in het vervangen van de reguliere atmosfeer (95% lucht en 5% CO2)door een anoxische atmosfeer (95% N2 en 5% CO2), geassocieerd met het weglaten van glucose.
De beschreven methode is geschikt voor het bestuderen van de interacties tussen neuronen en astrocyten in de context van ischemische beroerte, op een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en goedkope manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gebruikte dieren werden gefokt in het CICS-UBI Health Science Research Centre in overeenstemming met de nationale ethische eisen voor dieronderzoek en met het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (Richtlijn 2010/63/EU).
1. Rat embryo cortex primaire celcultuur
- Cultuur medium voorbereiding
- Bereid het Neurobasal Medium (NBM) voor door de volgende supplementen toe te voegen: 2% B27, 0,5 mM glutamine, 25 μM glutamaat en 120 μg/mL gentamicine. Homogeniseren, de pH aanpassen tot 7,2 en het medium steriliseren met een vacuümfiltratiestap, met behulp van een filter van 0,22 μm. Voor de neuron-glia celcultuur, vul het NBM celkweekmiddel aan met 10% van heat-inactivated foetale runderserum (HI-FBS).
- Bereid het medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM) voor met de volgende supplementen: natriumwaterstofcarbonaat 2,2 g/L, insuline uit runderalvleesklier 5 mg/L, D-glucosehydrous 3,4 g/L, penicilline (12 U/mL) /streptomycine (12 μg/mL) en 10% HI-FBS. Homogeniseren, de pH aanpassen tot 7,2 en het medium steriliseren met een filtratiestap.
- Bereiding van materialen en uitrusting
- Prik het einddeel van een 1 mL plastic micropipetpunt van links naar rechts, met behulp van een naald met een specifieke diameter (0,5 mm voor S; 0,6 mm voor M; 0,8 mm voor L) en verzegel de opening van de tip met behulp van een vlam.
- Steriliseer al het glaswerk. Gedurende de dissectie houden de gebruikte gereedschappen (bijvoorbeeld schaar, pincet, scalpel) ondergedompeld in 70% ethanol. Spuit de materialen met 70% ethanol voordat u ze in de laminaire stroomkamer betreedt.
- Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C en plaats het celkweekmedium in het waterbad voordat u met de procedure begint.
OPMERKING: Voor immunocytochemietesten moet poly-D-lysinecoating worden uitgevoerd in multiwellplaten met coverslips.
- De embryonale cortexcultuur van de rat
- Verwijder de rattenembryo's van een vrouwelijke Wistar-rat met 15-16 dagen zwangerschap (het einde van de paring, die 24 uur moet duren, wordt beschouwd als de1e dag van de embryonale ontwikkeling). Verdoven het vrouwtje met ketamine (87,5 mg/kg) en xylazine (12 mg/kg) en verwijder de embryo's. Euthanaseer de vrouwelijke rat vervolgens door cervicale dislocatie, volgens het standaardprotocol.
- Plaats de embryo's in een steriele buis van 50 mL, voeg fosfaatbuffer zout (PBS) toe tot het de embryo's bedekt en breng ze snel naar de kweekkamer.
- Nog steeds in de dooier zak, plaats de embryo's in een petrischaaltje met 25 mL koude PBS. Met behulp van een schaar en een pincet, breek de dooier zak, verwijder het embryo en breng het naar een andere petrischaal met ook koude PBS. De PBS in de petrischaal moet voldoende zijn om het hele embryo te bedekken.
LET OP: Wees voorzichtig bij het openen van de dooierzak om beschadiging van het embryo te voorkomen. In 1.3.3 en 1.3.4 gebruikten we petrischaaltjes met een diameter van 90 mm die bovenop ijsverpakkingen zijn geplaatst die bedekt zijn met absorberend papier om de PBS op lage temperatuur te houden. - Voor dissectie van het embryo, breng het naar een ander petrischaaltje met 30 mL koude PBS. Plaats het embryo onder een ontledenmicroscoop en immobiliseer het met een pincet. Maak de initiële incisie parallel aan de cortex, gaande van de oogholte naar het einde van de snuit en wees voorzichtig niet te onthoofden het dier.
- Verwijder voorzichtig de hoofdhuid en de hersenvliezen met behulp van een pincet, om het corticale hersenweefsel niet te beschadigen. Maak de volgende incisie om de cortex te scheiden. Breng het corticale weefsel over in een buis van 15 mL met 5 mL PBS met behulp van een Pasteur pipet.
- Voer de mechanische vertering van het corticale hersenweefsel uit met behulp van de 1 mL plastic tips bereid in 1.2.1. Trituraat 10 keer met een gewone pipet en herhaal het proces met behulp van pipetten met geleidelijk kleinere gaten (L, M en S), totdat de brokken uit elkaar zijn gevallen.
- Na de mechanische vertering, centrifugeren de suspensie op 400 x g gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg en verhoog het sediment opnieuw met het juiste celkweekmedium dat eerder bij 37 °C werd opgewarmd.
- Bepaal het totale aantal cellen aanwezig in de celsuspensie (celdichtheid) met behulp van een Neubauer-kamer, maak de juiste verdunningen en plaat van de cellen. De initiële celdichtheid werd gedefinieerd op basis van een eerdere studie5.
- Voor een neuron-verrijkte cultuur, gebruik 0,21 x 106 cellen/cm2 als de initiële celdichtheid en onderhouden van de cellen in NBM cultuurmedium zonder HI-FBS.
- Voor de neuron-glia culturen gebruiken 0.14 x 106 cellen/cm2 als de initiële celdichtheid en onderhouden van de cellen in NBM cultuurmedium aangevuld met 10% HI-FBS.
- Voor een met astrocyten verrijkte cultuur gebruikt u 0,26 x 106 cellen/cm2 als de initiële celdichtheid en onderhoudt u de cellen in MEM, aangevuld zoals eerder aangegeven.
- Plaats de cellen in een couveuse op 37 °C, 95% O2 en 5% CO2.
OPMERKING: Voor langere kweekperiodes moet een anti-mitotisch zoals 27 μM 5-fluor-2′-deoxyuridine met 68 μM uridine worden toegevoegd om de celgroei te onderdrukken.
2. Co-cultuursysteem
- Bereiding van materialen
- Verwarm de paraffine bij 150 °C in een verwarmingsblok gedurende ongeveer 7 min. Houd op 150 °C tot het einde van de procedure. Voeg vervolgens, met behulp van een steriel glas Pasteur pipet met een diameter van 1 mm, een kleine druppel toe over gesteriliseerde en PDL-gecoate coverslips. De paraffinebollen zijn onregelmatig, maar ze hebben een diameter van ongeveer 2 mm. De bollen zullen het mogelijk maken de twee culturen te worden gescheiden door ongeveer 1,25 mm.
- Omdat de paraffine niet steriel is, plaatst u de multiwell met de paraffinebollen gedurende 15 minuten onder ultraviolette straling.
- Om de co-cultuur vast te stellen, breng de coverslip met de paraffine bollen met behulp van een pincet eerder ondergedompeld in 70% ethanol voor 15 min.
- Co-cultuur
- Wanneer de twee culturen klaar zijn voor gebruik (d.w.z. na 7 dagen in cultuur onder de in stap 1.3.8 genoemde omstandigheden), breng je de neuronen die in de coverslips met paraffinebollen zijn gezaaid over naar de putten die de astrocyten bevatten.
- 24 uur voordat de twee culturen in contact worden gebracht, verander het cultuurmedium van neuronen en astrocyten naar NBM aangevuld, of niet, met HI-FBS, afhankelijk van het doel van het experiment.
- Nadat u beide celtypen in contact hebt gebracht, wacht u 8-12 uur voordat u de verschillende stimuli en procedures start.
OPMERKING: De schematische weergave van het co-cultuursysteem is te zien in figuur 1.
3. Zuurstof- en glucosetekort
- Cultuur Medium Voorbereiding
- Gebruik voor de OGD-experimenten Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Bereid het HBSS-medium voor met de volgende reagentia: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogeniseren en de pH aanpassen aan 7,2. Steriliseren van het medium door filtratie.
OPMERKING: Vul indien van toepassing de HBSS-oplossing aan met glucose (HBSSglu+), door 5,56 mM glucose toe te voegen. Voor culturen die aan OGD worden voorgelegd, vult u het HBSS-medium niet aan met glucose (HBSSglu-).
- Gebruik voor de OGD-experimenten Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Bereid het HBSS-medium voor met de volgende reagentia: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogeniseren en de pH aanpassen aan 7,2. Steriliseren van het medium door filtratie.
- OGD-procedure
- 7 dagen na het zaaien van de cellen, verwijder het kweekmedium en was twee keer met HBSSglu-. Voeg na het wassen het HBSSglu-celkweekmedium toe en plaats de multiwell in de hypoxiekamer.
- Verzegel de hypoxiekamer en voeg een gasmengsel toe met 95% N2/5% CO2 gedurende 4 minuten met een stroom van 20 L/min om de zuurstof in de kamer te verwijderen. Stop hierna de stroom en plaats de hypoxiekamer in een couveuse op 37 °C gedurende 4 uur of 6 uur, afhankelijk van de omvang van de beoogde ischemie.
- Vervang na de periode van OGD het HBSSglu-medium door het juiste kweekmedium voor de resterende procedures.
OPMERKING: Het OGD-experiment is bedoeld om de in vitro-omstandigheden te simuleren die de cellen lijden tijdens een ischemische gebeurtenis, dus het is belangrijk om te certificeren dat alle eerder gebruikte media worden verwijderd.
4. Immunocytochemietest
OPMERKING: Voer de immunocytochemietest uit zoals eerder beschreven5.
- Kortom, om de verschillende corticale culturen te karakteriseren, de cellen 's nachts bij 4 °C uitbroeden met konijnanti-GFAP (1:2000) en muis anti-microtubuli-geassocieerd eiwit 2 (MAP2; 1:500); en vervolgens 1 uur bij kamertemperatuur met de volgende secundaire antilichamen: anti-konijn geconjugeerd aan Alexa Fluor 546 en anti-muis geconjugeerd aan Alexa Fluor 488, beide bij 1:1000 verdunning.
- Label de celkernen door incubatie met 2 μM Hoechst 33342 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Mount coverslips in fluorescentie montage medium en het verwerven van beelden op een epifluorescentie microscoop met een 63x vergroting.
5. Statistische analyse
- Gegevens uitdrukken als percentage van het totale aantal cellen of als percentage van de controle en gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van ten minste 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud.
- Statistische analyse uitvoeren met software (GraphPad Software Inc., San Diego, t CA), met behulp van de ongepaarde Student's t-test. De resultaten werden als significant beschouwd wanneer de waarden van p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de culturen te karakteriseren, immunocytochemie om het aantal cellen dat GFAP of MAP2 uitgedrukt, op grote schaal gebruikte markers van astrocyten en neuronen (figuur 2) te beoordelen werd uitgevoerd in elk type van corticale cultuur. Deze analyse toonde aan dat met astrocyten verrijkte culturen 97% van de cellen presenteerden die GFAP uitdrukken (figuur 2A). Met betrekking tot de neuron-verrijkte cultuur 78% van de cellen uitgedrukt MAP2, 4% van de cellen uitgedrukt GFAP, en 18% van de cellen waren zowel GFAP en MAP2-negatief (Figuur 2B). Met betrekking tot de neuron-glia corticale cultuur, 49% van de cellen waren MAP2-positief, 31% waren GFAP-positief en 20% waren negatief voor beide markers (Figuur 2C).
Zeven dagen na de vaststelling van de corticale cultuur, de neuron-glia cultuur en de neuron-verrijkte cultuur werden onderworpen aan de OGD procedure, voor 4 uur of 6 uur. Na deze procedure werd het aantal MAP2- en GFAP-positieve cellen beoordeeld door immunocytochemie. In de neuron-glia cultuur, het verlies van MAP2-positieve cellen was 30% en 60% na 4 uur en 6 h van OGD, respectievelijk (Figuur 3B), terwijl het verlies van GFAP-positieve cellen was 9% en 17% na 4 uur en 6 h van OGD, respectievelijk (Figuur 3C). Wat de neuron-verrijkte cultuur betreft, was er een daling van respectievelijk 41% en 64% in het aantal MAP2-positieve cellen na 4 uur en 6 uur OGD (figuur 3A). Bovendien, in de neuron-verrijkte cultuur, was er een lichte toename van de schade uitbreiding veroorzaakt door 4 h van OGD in vergelijking met de neuron-glia cultuur (Figuur 3A).
Figuur 1: Schematische representatie van het co-cultuursysteem.
(A) Astrocyten werden gezaaid in een multiwell met PDL-gecoate coverslips en neuronen werden gezaaid in een multiwell met PDL-gecoate coverslips met 3 paraffine bollen. (B) Toen de twee culturen klaar waren voor gebruik, werden de neuronen in de coverslips met de bollen overgebracht naar de putten die de astrocyten bevatten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van neuron-glia corticale cultuur, neuron-verrijkte corticale cultuur en astrocyten verrijkte corticale cultuur.
Percentage neuronen (MAP2-positieve cellen), percentage astrocyten (GFAP-positieve cellen) en percentage dubbelnegatieve cellen (MAP2-negatieve/GFAP-negatieve cellen) op de7e dag in cultuur in (A) astrocyten-verrijkte cultuur(B) neuron-verrijkte cultuur en (C) neuron-glia cultuur en representatieve beelden met de immunostaining voor MAP2 (groen) en GFAP (rood). Het totale aantal cellen werd beoordeeld door Hoechst 33342-geëtiketteerde kernen te kwantificeren met niet-pyknotische morfologie (blauw). Vanwege het lage aantal neuronen in de met astrocyten verrijkte corticale cultuur, toont het representatieve beeld geen MAP2-positieve kleuring. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van 3 onafhankelijke experimenten (A) en 6 onafhankelijke experimenten (B, C) uitgevoerd in drievoud. Beelden werden verworven met een 63x doelstelling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van neuronale verlies na een OGD-periode.
(A, B) Aantal neuronen/veld (MAP2-positieve cellen) in een neuron-glia cultuur en neuron-verrijkte cultuur en (C)aantal astrocyten / veld (GFAP-positieve cellen) en representatief beeld van MAP2 (groen) en GFAP (rood) immunostaining in een neuron-glia cultuur. Het totale aantal cellen werd beoordeeld door Hoechst 33342-geëtiketteerde kernen te kwantificeren met niet-pyknotische morfologie (blauw). De neuron-glia en neuron-verrijkte culturen werden voorgelegd aan zuurstof en glucosedeprivatie (OGD) voor een periode van 4 h en 6 h. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van ten minste 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud. Het totale aantal cellen werd beoordeeld door Hoechst 33342-geëtiketteerde kernen te kwantificeren. **p < 0,01, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001 in vergelijking t met OGD 0 h (ongepaarde Student's t-toets) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode bestaat uit de astrocyten- en neuronisolatie van ratembryonal corticaal weefsel, waardoor neuron- of astrocytenverrijkte culturen of neuron-gliaculturen kunnen worden opgericht. Het werd aangepast aan een eerdere studie van onze groep5, waar de corticale neuron-glia en neuron-verrijkte embryonale culturen isolatie werden beschreven en de twee culturen gekenmerkt. Met behulp van deze culturen, Roque et al. vond dat astrocyten een belangrijke rol spelen bij het reageren op een ischemische schade en suggereert dat de communicatie tussen astrocyten en neuronen is essentieel voor neuroprotectie5. In het huidige protocol, naast de voorbereiding van neuron-glia en neuron-verrijkte culturen, zijn we ook in staat om astrocyten verrijkte culturen te verkrijgen, waardoor we het effect van een ischemische omgeving op de neuronen en astrocyten geïsoleerd of samen kunnen bestuderen.
Analyse van de immunocytochemie gegevens toonde aan dat 18% van de cellen in de neuron-verrijkte cultuur en 20% in neuron-glia culturen negatief waren voor zowel MAP2 en GFAP. Deze cellen presenteerden kernen met niet-pyknotische morfologie. Gezien het feit dat de culturen werden bereid uit embryonaal weefsel, kan een deel van de cellen nog niet uitdrukken van de neuronale marker, die verdere rijping. Dit is in overeenstemming met eerdere studies waaruit blijkt dat map2 expressie toeneemt met neuronale rijpheid en dat het aantal MAP2-positieve cellen toegenomen met de tijd in de cultuur en met de leeftijd van de embryo's op het moment van dissectie29,30. We hebben eerder aangetoond dat in neuron-glia cultuur slechts 0,7% van de cellen positief waren voor de microglia marker geïoniseerde calcium-binding adapter molecuul 15. Hoewel het kweekmedium dat wordt gebruikt in neuron-gliaculturen de voedingsondersteuning heeft die nodig is voor de groei van de gliacel, is de hoeveelheid microglia in de cortex van embryo's met 15-16 dagen verminderd en naarmate de kweektijd wordt verkort, is de groei van dit celtype beperkt. Hetzelfde geldt voor neuron-verrijkte culturen, maar in dit geval is de groei van gliacellen nog beperkter door de afwezigheid van HI-FBS in het kweekmedium.
Naast het toestaan van verschillende soorten culturen te verkrijgen uit dezelfde voorbereiding, het protocol hier beschreven heeft andere voordelen. De eencellige suspensie wordt eenvoudig verkregen door mechanische spijsvertering, in tegenstelling tot andere methoden die zowel enzymatische als mechanische spijsvertering24,25,31,32gebruiken ; daarom is het sneller en goedkoper. Een ander voordeel is dat dit protocol ook kan worden gebruikt om cellen uit andere hersengebieden voor te bereiden, zoals de hippocampus of de midbrain, waardoor de studie van pathologieën die verschillende gebieden van de hersenen beïnvloeden. Bovendien maakt de beschreven alternatieve procedure, die het mogelijk maakt coculturen tot stand te brengen, de analyse mogelijk van biochemische en morfologische veranderingen die zich voordoen in specifieke celtypen die in de co-cultuur aanwezig zijn met behulp van methoden zoals immunocytochemie. Een gemeenschappelijk model voor de totstandkoming van coculturen is transwellsystemen24,25,33,34. In tegenstelling tot wat er gebeurt met een co-cultuur systeem met behulp van kleine afstandhouders, zoals de paraffine sferen, transwell co-cultuur modellen niet toestaan om immunocytochemie uit te voeren op beide soorten cellen aanwezig in de co-cultuur. Bovendien zijn de co-culturen met behulp van afstandhouders zoals de paraffine bollen eenvoudig en goedkoop.
Het onderwerpen van neuron-verrijkte of neuron-glia culturen aan OGD is een gemeenschappelijk in vitro model voor ischemie, niettemin zijn andere in vitro methoden gebruikt, namelijk chemische en enzymatische methoden of inductie van excitotoxiciteit door glutamaat3,35. In vergelijking met andere methoden, OGD maakt de simulatie van de twee fasen die optreden tijdens de ischemische beroerte, namelijk de ontbering van zuurstof en glucose en de reperfusie, dat is een voordeel omdat het bootst wat er gebeurt in vivo. Bovendien, hoewel chemische en enzymatische methoden nuttig kunnen zijn vanwege de snelle respons en het gemak van toepassing, is er een bezorgdheid met de relevantie voor de in vivo pathologische toestand, omdat chemische hypoxie leidt tot meer vrije radicalen generatie dan anoxie, overtreffen wat wordt waargenomen in vivo35. Wat het OGD-protocol betreft, merkten we op dat het leidt tot neuronaal verlies en dat de uitbreiding van de laesie kan worden aangepast door de duur van de OGD-periode te wijzigen om aan de experimentele vereisten te voldoen. De verschillen waargenomen in neuronale verlies na de OGD-periode in neuron-verrijkte culturen en neuron-glia culturen kunnen te wijten zijn aan de beschermende rol gespeeld door astrocyten, waardoor de neuronale dood te verzachten.
Zoals verwacht, OGD schade aan astrocyten in neuron-glia culturen was lager op zowel 4 uur en 6 uur in vergelijking met neuronen. De hogere weerstand van astrocyten tegen OGD wordt toegeschreven aan meerdere aspecten. Ze zijn in staat om ATP-niveaus langer te handhaven dan neuronen tijdens ischemie, en ernstige ionische dysregulatie verloopt langzamer36: ten eerste omdat neuronen een hogere dichtheid van ionische kanalen hebben en een daaruit voortvloeiende grotere energievraag om ionische gradiënten te behouden; en ten tweede omdat de meeste glycogeen winkels in de hersenen wordt gevonden in astrocyten36. Bovendien, astrocyten uitdrukken lagere niveaus van ionotropische glutamaat receptoren dan neuronen en hebben een betere ionische buffering en antioxidant capaciteit36. Deze attributen liggen vermoedelijk ten grondslag aan het bekende selectieve verlies van neuronen ten opzichte van astrocyten36.
Met betrekking tot de beperkingen van het hier voorgestelde protocol, is het belangrijkste dat het gebaseerd is op een in vitro model dat de complexiteit mist van de interacties die zich voordoen in een in vivo systeem, wat vertaalproblemen naar een in vivo situatie kan veroorzaken. Echter, het presenteert de voordelen in verband met celculturen, namelijk eenvoud, gemak van manipulatie, het vermogen om fundamentele gedetailleerde informatie over hoe een specifieke cel bevolking reageert op een bepaalde belediging3. In vitro modellen van de ziekte zijn minder tijdrovend en minder duur te onderhouden dan in vivo modellen. Meer in het bijzonder, voor de modellering van de ischemische beroerte, een in vitro model bezit ook het voordeel van gemakkelijker om de glucose en zuurstof niveaus in vergelijking met de in vivo alternatieven34controle . Bovendien stellen we ook het gebruik van coculturen voor, die een hoger niveau van complexiteit kunnen geven, waardoor de interactie tussen verschillende celtypen in een weefsel kan worden bestudeerd.
Er zijn enkele kritieke stappen die verdere aandacht vereisen bij het uitvoeren van het protocol. Vanwege de voedingsbehoefte van astrocyten moet het NBM dat wordt gebruikt voor het verkrijgen van neuron-gliaculturen worden aangevuld met 10% van de HI-FBS-bevattende groeifactoren, aminozuren en vetzuren. Deze suppletie is wat onderscheidt de neuron-glia cultuur van de neuron-verrijkte cultuur. Ter voorbereiding van een astrocyten-verrijkte cultuur een medium verstoken van supplementen die nodig zijn voor neuronale groei, zoals B27, moet worden gebruikt. In het huidige protocol was het medium van verkiezing voor de met astrocyten verrijkte cultuur mem. Het is ook van groot belang dat de behoeften van de verschillende celtypen worden gewaarborgd wanneer ze in contact worden gebracht. Hiervoor kan een kweekmedium worden gebruikt dat compatibel is met zowel astrocyten als neuronen, namelijk het NBM aangevuld met B27 en HI-FBS. Met betrekking tot het OGD-protocol zijn de belangrijkste kritieke stappen het verwijderen van alle O2 uit de kamer voordat de OGD-periode begint, en het goed wassen van de cellen met HBSS zonder glucose, om alle glucose in het medium te elimineren.
Tot slot presenteren we hier een in vitro model om de ischemische beroerte te bestuderen die op een eenvoudige, snelle, goedkope en reproduceerbare manier is vastgesteld. Bovendien, de beschreven methode maakt het ook mogelijk om neuron- en astrocyten verrijkte primaire culturen, maar ook neuron-glia culturen uit te voeren, waardoor een grote in vitro model voor het modelleren van verschillende hersenziekten, met een hoger niveau van complexiteit dan vereeuwigd cellijnen en pure neuronale of glia culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de financieringssteun van Fundação para a Ciência e a Tecnologia via Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 en de beurs SFRH/BD/135936/2018 aan JP, door ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" via het project CENTRO-01-0145-FEDER-000013 en financiering aan het PPBI-Portugees Platform of BioImaging via het project POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
