Summary
Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.
Abstract
L'ictus ischemico è una condizione clinica caratterizzata da ipoperfusione di tessuto cerebrale, che porta alla privazione di ossigeno e glucosio, e la conseguente perdita neuronale. Numerose prove suggeriscono che l'interazione tra cellule gliali e neuronali esercitano effetti benefici dopo un evento ischemico. Pertanto, per esplorare potenziali meccanismi protettivi, è importante sviluppare modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia in un ambiente ischemico. Qui presentiamo un approccio semplice per isolare gli astrociti e neuroni dalla corteccia embrionale del ratto, e che utilizzando specifici mezzi di coltura, permette la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neurone-glia con alto rendimento e riproducibilità.
Per studiare il crosstalk tra astrociti e neuroni, proponiamo un approccio basato su un sistema di co-coltura in cui i neuroni colti in coperture vengono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti placcati in piastre multiwell. Le due culture sono tenute a parte da piccole sfere di paraffina. Questo approccio consente la manipolazione indipendente e l'applicazione di trattamenti specifici per ogni tipo di cellula, che rappresenta un vantaggio in molti studi.
Per simulare ciò che accade durante un ictus ischemico, le colture sono sottoposte a un protocollo di privazione di ossigeno e glucosio. Questo protocollo rappresenta uno strumento utile per studiare il ruolo delle interazioni neurone-glia nell'ictus ischemico.
Introduction
Secondo i dati dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, circa 5,5 milioni di persone muoiono ogni anno a causa di un ictus ischemico1. Questa condizione è caratterizzata dall'interruzione del flusso sanguigno in una determinata regione del cervello, con conseguente perdita reversibile o irreversibile nell'apporto di ossigeno e sostanze nutritive al tessuto, che altera la funzione del tessuto e porta a disfunzione mitocondriale, disregolazione del calcio, ecitotossicità del glutammato, infiammazione e perdita cellulare2,3.
Oltre alle cellule vascolari, le cellule neuronali e gliali sono coinvolte nella fisiofisiologia dell'ictus ischemico4. In particolare, gli astrociti sono essenziali per il mantenimento dei neuroni e recentemente hanno dimostrato di svolgere un ruolo critico nella risposta alla lesione ischemica5. Questo tipo di cellula gliale svolge funzioni di supporto strutturale, difesa contro lo stress ossidativo, sintesi di neurotrasmettitori, stabilizzazione della comunicazione cellulare-cellula, tra gli altri6. Insieme ai neuroni, gli astrociti svolgono un ruolo diretto nella trasmissione sinaptica, regolando il rilascio di molecole come l'adenosina triphosfato, l'acido gamma-aminobutyrico e il glutammato7. Parte della lesione indotta dall'ischemia è causata dall'eccessivo rilascio di glutammato e dal suo accumulo alla fessura sinaptica, che porta all'eccessiva attivazione dei recettori N-methyl-D-aspartate, attivando le cascate di segnalazione a valle, con conseguente ecitotossicità8. Poiché gli astrociti sono in grado di rimuovere il glutammato dalla fessura sinaptica e convertirlo in glutammina, sono fondamentali per difendersi dall'eccitatossicità, esercitando così un effetto neuroprotettivo sull'ischemia. Queste cellule svolgono anche un ruolo nella neuroinfiammazione indotta da ischemia. Dopo l'insulto ischemico, gli astrociti attivati subiscono cambiamenti morfologici (ipertrofia), proliferano e mostrano un aumento dell'espressione della proteina acida fibrillale gliale (GFAP). Possono diventare reattivi (astrogliosi), rilasciando citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-α, l'interleuchina-1 e l'interleuchina-1β, e producendo radicali liberi, tra cui ossido nitrico e superossido, che a sua volta possono indurre la morte neuronale9,10. Al contrario, gli astrociti reattivi possono anche svolgere un effetto neuroprotettivo, poiché rilasciano citochine antinfiammatorie, come trasformare il fattore di crescita-β, che viene regolato dopol'ictus 11. Inoltre, possono generare una cicatrice gliale, che può limitare la rigenerazione dei tessuti inibendo la germogliazione assonale; tuttavia, questa cicatrice gliale può isolare il sito di lesione dal tessuto vitale, impedendo così un'ondata a cascata di danni ai tessutiincontrollati 12,13.
Pertanto, è imperativo stabilire modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia sotto una lesione ischemica al fine di trovare strategie terapeutiche che limitino o inverodino gli effetti della lesione ischemica. Rispetto ad altri modelli utilizzati per studiare le lesioni ischemiche, vale a dire i modelli in vivo 14,15,16, le colture organotipiche17,18,19 e le fette cerebrali acute20,21,22, le colture cellulari primarie sono meno complesse, il che rende possibile lo studio dei singoli contributi di ogni tipo di cellula nella fisiofisiologia dell'ictus ischemico e come ogni tipo di cellula risponde a possibili bersagli terapeutici.22 Tipicamente, al fine di studiare le interazioni tra colture arricchite di neuroni e colture arricchite di astrociti, i neuroni e le cellule gliali di origine postnatale vengonoutilizzati 23,24, o cellule gliali postnatali e neuroni embrionali25,26. Qui viene proposto un approccio semplice per stabilire colture arricchite di neuroni o astrociti e colture neurone-glia dallo stesso tessuto. Queste cellule primarie sono ottenute dalla corteccia embrionale del ratto, una regione spesso colpitadall'ictus 27,28. Inoltre, la dissociazione del tessuto viene eseguita solo con una procedura meccanica. Pertanto, questo protocollo consente di isolare le cellule nella stessa fase di sviluppo, in modo rapido ed economico e con elevate prestazioni e riproducibilità.
L'incrocio tra astrociti e neuroni può essere esplorato utilizzando un sistema di co-coltura in cui i neuroni colturati in co-lips sono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti semi di placche multiwell. Piccole sfere di paraffina possono essere utilizzate per garantire la separazione delle due colture cellulari. Questo approccio consente la manipolazione indipendente di ogni tipo di cella prima che siano portati in contatto. Ad esempio, è possibile silenziare un gene specifico negli astrociti e vedere come può influenzare la vulnerabilità neuronale o la protezione contro i danni indotta dall'ischemia. Un metodo consolidato per indurre condizioni ischemiche in vitro è la privazione di ossigeno e glucosio (OGD)3, che consiste nel sostituire l'atmosfera regolare (95% aria e 5% CO2) da un'atmosfera anossica (95% N2 e 5% CO2), associata all'omissione di glucosio.
Il metodo descritto è adatto per studiare le interazioni tra neuroni e astrociti nel contesto dell'ictus ischemico, in modo semplice, veloce, riproducibile ed economico.
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Protocol
Tutti gli animali utilizzati sono stati allevati presso il Centro di ricerca sulla scienza della salute CICS-UBI in conformità con i requisiti etici nazionali per la ricerca sugli animali e con la Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (direttiva 2010/63/UE).
1. Coltura delle cellule primarie della corteccia embrionale di ratto
- Preparazione media della coltura
- Preparare il Neurobasal Medium (NBM) aggiungendo i seguenti integratori: 2% B27, 0,5 mM di glutammina, 25 glutammato di M e 120 g/mL di gentamina. Omogeneizzare, regolare il pH a 7,2 e sterilizzare il mezzo con una fase di filtrazione sottovuoto, utilizzando un filtro da 0,22 m. Per la coltura di cellule neurone-glia, integrare il mezzo di coltura cellulare NBM con il 10% del siero bovino fetale inattivato dal calore (HI-FBS).
- Preparare il mezzo minimo di aquila media essenziale (MEM) con i seguenti integratori: carbonato di idrogeno di sodio 2,2 g/L, insulina da pancreas bovino 5 mg/L, anidrosio D-glucosio 3,4 g/L, penicillina (12 U/mL) /streptomycin (12 g/mL) e 10% HI-FBS. Omogeneizzare, regolare il pH a 7.2 e sterilizzare il mezzo con un passo di filtrazione.
- Preparazione dei materiali e delle attrezzature
- Forare la parte terminale di una punta di micropipette di plastica da 1 mL da un lato all'altro, utilizzando un ago con un diametro specifico (0,5 mm per S; 0,6 mm per M; 0,8 mm per L) e sigillare l'apertura della punta utilizzando una fiamma.
- Sterilizzare tutte le vetreria. Durante la dissezione tenere gli strumenti utilizzati (ad esempio, forbici, pinzette, bisturi) immersi nel 70% di etanolo. Spruzzare i materiali con il 70% di etanolo prima di entrarli nella camera di flusso laminare.
- Impostare la temperatura del bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e posizionare il mezzo di coltura cellulare nel bagno d'acqua prima di iniziare la procedura.
NOTA: Per i test di immunocitochimica, il rivestimento poli-D-lisina deve essere eseguito in piastre multiwell contenenti coperture.
- Coltura della corteccia embrionale del ratto
- Rimuovere gli embrioni di ratto da un ratto Wistar femmina con 15-16 giorni di gestazione (la fine dell'accoppiamento, che dovrebbe durare 24 h, è considerata il primogiorno dello sviluppo embrionale). A tal fine, anestetizzare la femmina con ketamina (87,5 mg/kg) e xylazina (12 mg/kg) e rimuovere gli embrioni. Quindi eutanasia il ratto femmina per lussazione cervicale, seguendo il protocollo standard.
- Mettere gli embrioni in un tubo sterile di 50 mL, aggiungere la salina tampone di fosfato (PBS) fino a quando non copre gli embrioni e portarli rapidamente nella stanza di coltura.
- Ancora all'interno del sacco del tuorlo, mettere gli embrioni in un piatto Petri contenente 25 mL di PBS freddo. Con l'aiuto di forbici e pinzette, rompere il sacco tuorlo, rimuovere l'embrione e trasferirlo in un altro piatto Petri contenente anche PBS freddo. Il PBS nel piatto Petri dovrebbe essere sufficiente a coprire l'intero embrione.
NOTA: Fare attenzione quando si apre il sacco del tuorlo per evitare di danneggiare l'embrione. In 1.3.3 e 1.3.4 abbiamo utilizzato piatti Petri di 90 mm di diametro posti sopra confezioni di ghiaccio ricoperte di carta assorbente per mantenere il PBS a bassa temperatura. - Per la dissezione dell'embrione, trasferirlo in un altro piatto Petri contenente 30 mL di PBS freddo. Posizionare l'embrione sotto un microscopio sezionante e immobilizzarlo usando una pinze. Rendere l'incisione iniziale parallela alla corteccia, passando dalla cavità oculare alla fine del muso e fare attenzione a non decapitare l'animale.
- Rimuovere con attenzione il cuoio capelluto e le meningi utilizzando una pinzetta, al fine di non danneggiare il tessuto cerebrale corticale. Fare l'incisione successiva per separare la corteccia. Trasferire il tessuto corticale in un tubo di 15 mL contenente 5 mL di PBS utilizzando una pipetta Pasteur.
- Eseguire la digestione meccanica del tessuto cerebrale corticale utilizzando le punte di plastica da 1 mL preparate in 1.2.1. Triturate 10 volte con una pipetta regolare e ripetere il processo utilizzando pipette con fori progressivamente più piccoli (L, M e S), fino a quando i pezzi sono caduti a pezzi.
- Dopo la digestione meccanica, centrifugare la sospensione a 400 x g per 3 min. Scartare il supernatant e risundere il sedimento con il mezzo di coltura cellulare appropriato precedentemente riscaldato a 37 gradi centigradi.
- Determinare il numero totale di cellule presenti nella sospensione cellulare (densità cellulare) utilizzando una camera Neubauer, effettuare le diluizioni appropriate e placcare le cellule. La densità cellulare iniziale è stata definita sulla base di uno studio precedente5.
- Per una coltura arricchita da neuroni, utilizzare 0,21 x 106 cellule/cm2 come densità cellulare iniziale e mantenere le cellule nel mezzo di coltura NBM senza HI-FBS.
- Per le colture neurone-glia utilizzare 0,14 x 106 cellule/cm2 come densità cellulare iniziale e mantenere le cellule nel mezzo di coltura NBM integrato con 10% HI-FBS.
- Per una coltura arricchita di astrociti, utilizzare 0,26 x 106 celle/cm2 come densità cellulare iniziale e mantenere le cellule in MEM integrate come indicato in precedenza.
- Collocare le cellule in un'incubatrice fissata a 37 gradi centigradi, 95% O2 e 5% CO2.
NOTA: Per periodi di coltura più lunghi, è necessario aggiungere un anti-mitotico, ad esempio 27 s M 5-fluoro-2, con 68 sM uridina, per sopprimere la crescita cellulare.
2. Sistema di co-coltura
- Preparazione dei materiali
- Riscaldare la paraffina a 150 gradi centigradi in un blocco di riscaldamento per circa 7 minuti. Tenere a 150 gradi centigradi fino a completare la procedura. Quindi, con l'aiuto di una pipetta Pasteur in vetro sterile di 1 mm di diametro, aggiungere una piccola goccia sopra le coperture sterilizzate e rivestite con PDL. Le sfere di paraffina sono irregolari, ma hanno un diametro di circa 2 mm. Le sfere permetteranno alle due culture di essere separate di circa 1,25 mm.
- Poiché la paraffina non è sterile, posizionare il multiwell con le sfere di paraffina sotto la radiazione ultravioletta per 15 min.
- Per stabilire la co-coltura, trasferire il coverslip con le sfere di paraffina utilizzando un pinzetta precedentemente immerso nel 70% di etanolo per 15 min.
- Co-cultura
- Quando le due colture sono pronte all'uso (cioè dopo 7 giorni in coltura alle condizioni di cui al punto 1.3.8), trasferire i neuroni semiti nelle coperture con sfere di paraffina ai pozzi contenenti gli astrociti.
- 24 h prima che le due culture siano portate a contatto, cambiare il mezzo di coltura dei neuroni e degli astrociti in NBM integrato, o meno, con HI-FBS, a seconda dello scopo dell'esperimento.
- Dopo aver messo entrambi i tipi di cellule in contatto, attendere 8-12 h prima di iniziare i diversi stimoli e procedure.
NOTA: la rappresentazione schematica del sistema di co-impostazioni cultura è illustrata nella Figura 1.
3. Privazione di ossigeno e glucosio
- Preparazione media della cultura
- Per gli esperimenti OGD, utilizzare la soluzione di sale bilanciata di Hank (HBSS). Preparare il supporto HBSS con i seguenti reagenti: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Omogeneizzare e regolare il pH a 7.2. Sterilizzare il mezzo filtrando.
NOTA: Se appropriato, integrare la soluzione HBSS con glucosio (HBSSglu), aggiungendo 5,56 mM di glucosio. Per le colture presentate a OGD non integrare il mezzo HBSS con glucosio (HBSSglu-).
- Per gli esperimenti OGD, utilizzare la soluzione di sale bilanciata di Hank (HBSS). Preparare il supporto HBSS con i seguenti reagenti: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Omogeneizzare e regolare il pH a 7.2. Sterilizzare il mezzo filtrando.
- Procedura OGD
- 7 giorni dopo la semina delle cellule, rimuovere il mezzo di coltura e lavare due volte con HBSSglu-. Dopo il lavaggio aggiungere il mezzo di coltura delle cellule HBSSglu e posizionare il multiwell nella camera dell'ipossia.
- Sigillare la camera di ipossia e aggiungere una miscela di gas contenente 95% N2/5% CO2 per 4 min con un flusso di 20 L/min per rimuovere l'ossigeno presente all'interno della camera. Dopo questo, fermare il flusso e posizionare la camera di ipossia in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 4 h o 6 h, a seconda dell'estensione dell'ischemia prevista.
- Dopo il periodo di OGD, sostituire il supporto HBSSglu- con il mezzo di coltura appropriato per le procedure rimanenti.
NOTA: L'esperimento OGD mira a simulare le condizioni in vitro che le cellule subiscono durante un evento ischemico, quindi è importante certificare che tutti i media utilizzati in precedenza vengono rimossi.
4. Analisi dell'immunocitochimica
NOTA: Eseguire l'analisi dell'immunocitochimica come descritto in precedenza5.
- In breve, per caratterizzare le diverse colture corticali, incubare le cellule durante la notte a 4 gradi centigradi con coniglio anti-GFAP (1:2000) e proteina associata al topo anti-microtubulo 2 (MAP2; 1:500); e poi 1 h a temperatura ambiente con i seguenti anticorpi secondari: anti-coniglio coniugato ad Alexa Fluor 546 e anti-mouse coniugato ad Alexa Fluor 488, entrambi a 1:1000 diluizione.
- Etichettare i nuclei cellulari mediante incubazione con 2 M Hoechst 33342 per 10 min a temperatura ambiente.
- Montare le coperture in fluorescenza nel mezzo di montaggio e acquisire immagini su un microscopio epifluorescenza con un ingrandimento 63x.
5. Analisi statistica
- Esprimere i dati come percentuale del numero totale di cellule o come percentuale di controllo e presentati come l'errore standard medio ± della media (SEM) di almeno 3 esperimenti indipendenti eseguiti in triplice.
- Eseguire analisi statistiche con il software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), utilizzando il test t di Student non accoppiato. I risultati sono stati considerati significativi quando i valori di p < 0.05.
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Representative Results
Per caratterizzare le colture, l'immunocitochimica per valutare il numero di cellule che esprimevano GFAP o MAP2, marcatori ampiamente utilizzati di astrociti e neuroni (Figura 2), è stata eseguita in ogni tipo di coltura corticale. Questa analisi ha rivelato che le colture arricchite di astrociti presentavano il 97% delle cellule che esprimevano GFAP (Figura 2A). Per quanto riguarda la coltura arricchita di neuroni 78% delle cellule espresse MAP2, 4% delle cellule espresse GFAP, e 18% delle cellule erano sia GFAP e MAP2-negativo (Figura 2B). Per quanto riguarda la coltura corticale neurone-glia, il 49% delle cellule era MAP2 positivo, il 31% era GFAP-positivo e il 20% negativo per entrambi i marcatori (Figura 2C).
Sette giorni dopo aver stabilito la cultura corticale, la cultura del neurone-glia e la coltura arricchita di neuroni sono state sottoposte alla procedura OGD, per 4 h o 6 h. Dopo questa procedura, il numero di cellule MAP2 e GFAP positive è stato valutato dall'immunocitochimica. Nella coltura neurone-glia, la perdita di cellule MAP2-positive è stata rispettivamente del 30% e del 60% dopo 4 h e 6 h di OGD(Figura 3B), mentre la perdita di cellule GFAP positive è stata rispettivamente del 9% e del 17% dopo 4 h e 6 h di OGD(Figura 3C). Per quanto riguarda la coltura arricchita di neuroni, c'è stata una diminuzione del 41% e del 64% nel numero di cellule MAP2-positive dopo 4 h e 6 h di OGD, rispettivamente (Figura 3A). Inoltre, nella coltura arricchita di neuroni, c'è stato un leggero aumento dell'estensione della lesione indotta da 4 h di OGD rispetto alla coltura neurone-glia (Figura 3A).
Figura 1: rappresentazione schematica del sistema di co-impostazioni cultura.
(A) Gli astrociti sono stati semiti in un multiwell contenente coperture rivestite di PDL e neuroni sono stati semi in un multiwell con coperture rivestite di PDL contenenti 3 sfere di paraffina. (B) Quando le due culture erano pronte all'uso, i neuroni nelle coperture con le sfere sono stati trasferiti ai pozzi contenenti gli astrociti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione della coltura corticale neurone-glia, cultura corticale arricchita da neuroni e cultura corticale arricchita da astrociti.
Percentuale di neuroni (cellule MAP2-positive), percentuale di astrociti (cellule positive GFAP) e percentuale di cellule a doppio-negativo (map2-negative/GFAP-negative cells)al 7o giorno in coltura in (A) coltura arricchita di astrociti (B) coltura arricchita di neuroni e (C) coltura neurone-glia e immagini rappresentative che mostrano l'immunosostenimento per MAP2 (verde) e GF (rosso). Il numero totale di cellule è stato valutato quantificando i nuclei etichettati Hoechst 33342 con morfologia non pisnotica (blu). A causa del basso numero di neuroni nella coltura corticale arricchita di astrociti, l'immagine rappresentativa non mostra la colorazione MAP2-positiva. I dati sono presentati come media ± SEM di 3 esperimenti indipendenti (A) e 6 esperimenti indipendenti (B, C) eseguiti in tripliceto. Le immagini sono state acquisite con un obiettivo 63x. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della perdita neuronale dopo un periodo di OGD.
(A, B) Numero di neuroni/campo (cellule MAP2-positive) in una coltura neurone-glia e coltura arricchita di neuroni e (C) numero astrociti/campo (cellule GFAP-positive) e immagine rappresentativa di MAP2 (verde) e GFAP (rosso) immunostaining in una coltura neurone-glia. Il numero totale di cellule è stato valutato quantificando i nuclei etichettati Hoechst 33342 con morfologia non pisnotica (blu). Le colture arricchite di neuroni-glia e neuroni sono state presentate alla privazione di ossigeno e glucosio (OGD) per un periodo di 4 h e 6 h. I dati sono presentati come media ± SEM di almeno 3 esperimenti indipendenti eseguiti in triplice. Il numero totale di cellule è stato valutato quantificando i nuclei etichettati Hoechst 33342. < 0.01 , p < 0.001 e p < 0.0001 rispetto a OGD 0 h (test t dello studente non accoppiato) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto consiste nell'isolamento dell'astrocito e del neurone dal tessuto corticale embrionale del ratto, consentendo la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neurone-glia. È stato adattato da un precedente studio del nostro gruppo5, dove sono stati descritti l'isolamento delle colture embrionali corticali neurone-glia e neurone-arricchite e le due culture caratterizzate. Utilizzando queste colture, Roque et al. ha scoperto che gli astrociti svolgono un ruolo chiave nel rispondere a un danno ischemico e suggerisce che la comunicazione tra astrociti e neuroni è essenziale per la neuroprotezione5. Nell'attuale protocollo, oltre alla preparazione di colture neurone-glia e arricchite da neuroni, siamo anche in grado di ottenere colture arricchite di astrociti, che ci permette di studiare l'effetto di un ambiente ischemico sui neuroni e sugli astrociti isolati o insieme.
L'analisi dei dati di immunocitochimica ha mostrato che il 18% delle cellule nella coltura arricchita di neuroni e il 20% nelle colture neurone-glia erano negative sia per MAP2 che per GFAP. Queste cellule presentavano nuclei con morfologia non-pyknotica. Dato che le colture sono state preparate dal tessuto embrionale, parte delle cellule potrebbe non ancora esprimere il marcatore neuronale, necessitando di un'ulteriore maturazione. Questo è in linea con studi precedenti che indicano che l'espressione MAP2 aumenta con la maturità neuronale e che il numero di cellule MAP2-positive è aumentato con il tempo in coltura e con l'età degli embrioni al momento della dissezione29,30. Abbiamo già dimostrato che nella coltura neurone-glia solo lo 0,7% delle cellule era positivo per la molecola di adattatore di legatura del calcio ionizzato del marcatore microgliale 15. Anche se il mezzo di coltura utilizzato nelle colture neurone-glia ha il supporto nutrizionale necessario per la crescita delle cellule gliali, la quantità di microglia nella corteccia degli embrioni con 15-16 giorni è ridotta e come il tempo di coltura è ridotto, la crescita di questo tipo di cellula è limitata. Lo stesso vale per le colture arricchite di neuroni, ma in questo caso la crescita delle cellule gliali è ancora più limitata a causa dell'assenza di HI-FBS nel mezzo di coltura.
Oltre a consentire l'osa ottenuti da diversi tipi di culture dalla stessa preparazione, il protocollo qui descritto presenta altri vantaggi. La sospensione a cella singola si ottiene semplicemente per digestione meccanica, a differenza di altri metodi che utilizzano sia la digestione ezimaticache meccanica 24,25,31,32; pertanto, è più veloce ed economico. Un altro vantaggio è che questo protocollo può essere utilizzato anche per preparare cellule provenienti da altre regioni del cervello, come l'ippocampo o il midbrain, permettendo lo studio di patologie che interessano diverse aree del cervello. Inoltre, la procedura alternativa descritta, che consente la creazione di co-culture, consente l'analisi dei cambiamenti biochimici e morfologici che si verificano in specifici tipi di cellule presenti nella co-coltura utilizzando metodi come l'immunocitochimica. Un modello comune per la creazione di co-culture è transwell systems24,25,33,34. Contrariamente a quanto avviene con un sistema di co-coltura che utilizza piccoli distanziali, come le sfere di paraffina, i modelli di co-coltura transwell non consentono di eseguire l'immunocitochimica su entrambi i tipi di cellule presenti nella co-coltura. Inoltre, le co-culture che utilizzano distanziali come le sfere di paraffina sono semplici e a basso costo.
L'applicazione di colture neurone-arricchite o neurone-glia a OGD è un modello in vitro comune per l'ischemia, tuttavia sono stati utilizzati altri metodi in vitro, vale a dire metodi chimici ed ezimatici o induzione di escitotossicità da glutammato3,35. Rispetto ad altri metodi, OGD consente la simulazione delle due fasi che si verificano durante l'ictus ischemico, vale a dire la privazione di ossigeno e glucosio e la reperfusione, che è un vantaggio perché imita ciò che accade in vivo. Inoltre, anche se i metodi chimici ed ezimatici possono essere utili a causa della sua risposta rapida e facilità di applicazione, c'è una preoccupazione con la rilevanza per lo stato patologico in vivo, perché l'ipossia chimica porta a una generazione di radicali più libera di anossia, superando ciò che si osserva in vivo35. Per quanto riguarda il protocollo OGD, abbiamo osservato che porta alla perdita neuronale e che l'estensione della lesione può essere regolata alterando la durata del periodo OGD, al fine di raggiungere i requisiti sperimentali. Le differenze osservate nella perdita neuronale dopo il periodo OGD nelle colture arricchite di neuroni e nelle colture neurone-glia potrebbero essere dovute al ruolo protettivo svolto dagli astrociti, attenuando così la morte neuronale.
Come previsto, il danno da OGD agli astrociti nelle colture neurone-glia era inferiore sia a 4 h che a 6 h rispetto ai neuroni. La maggiore resistenza degli astrociti alla OGD è attribuita a molteplici aspetti. Sono in grado di mantenere i livelli di ATP più a lungo dei neuroni durante l'ischemia, e la grave disregolazione ionica procede più lentamente36: in primo luogo perché i neuroni hanno una maggiore densità di canali ionici e una conseguente maggiore domanda di energia per mantenere i gradienti ionici; e in secondo luogo perché la maggior parte dei negozi di glicogeno nel cervello si trova negli astrociti36. Inoltre, gli astrociti esprimono livelli più bassi di recettori del glutammato ionotropico rispetto ai neuroni e hanno una migliore capacità di buffering ionico eantiossidante 36. Questi attributi presumibilmente sono alla base della ben nota perdita selettiva di neuroni rispetto agli astrociti36.
Per quanto riguarda le limitazioni del protocollo qui proposto, il più significativo è che si basa su un modello in vitro che manca della complessità delle interazioni che si verificano in un sistema in vivo, che può causare problemi di traslabilità a una situazione in vivo. Tuttavia, presenta i vantaggi associati alle culture cellulari, vale a dire la semplicità, la facilità di manipolazione, la capacità di fornire informazioni dettagliate di base su come una popolazione di celle specifica risponde a un certo insulto3. I modelli in vitro di malattia sono meno lunghi e meno costosi da mantenere rispetto ai modelli in vivo. Più specificamente, per la modellazione dell'ictus ischemico, un modello in vitro possiede anche il vantaggio di essere più facile controllare i livelli di glucosio e ossigeno rispetto alle alternative in vivo 34. Inoltre, proponiamo anche l'uso di co-culture, che possono dare un più alto livello di complessità, permettendo di studiare l'interazione tra i diversi tipi di cellule presenti in un tessuto.
Esistono alcuni passaggi critici che richiedono ulteriore attenzione durante l'esecuzione del protocollo. A causa del requisito nutrizionale degli astrociti, il NBM utilizzato per ottenere colture neurone-glia dovrebbe essere integrato con il 10% dei fattori di crescita contenenti HI-FBS, aminoacidi e acidi grassi. Questo completamento è ciò che differenzia la coltura neurone-glia dalla cultura neurone-arricchito. Per preparare una coltura arricchita di astrociti deve essere utilizzato un mezzo privo di integratori necessari per la crescita neuronale, come B27. Nell'attuale protocollo, il mezzo di elezione per la cultura arricchita da astrociti era MEM. È anche molto importante che le esigenze dei diversi tipi di cellule siano garantite quando vengono portate in contatto. A tale scopo, può essere utilizzato un mezzo di coltura compatibile sia con gli astrociti che con i neuroni, vale a dire l'NBM integrato con B27 e HI-FBS. Per quanto riguarda il protocollo OGD, i principali passaggi critici sono la rimozione di tutti gli O2 dalla camera prima di iniziare il periodo OGD, e il corretto lavaggio delle cellule con HBSS senza glucosio, al fine di eliminare tutto il glucosio presente nel mezzo.
In conclusione, qui presentiamo un modello in vitro per studiare l'ictus ischemico stabilito in modo semplice, veloce, economico e riproducibile. Inoltre, il metodo descritto permette anche di implementare colture primarie arricchite da neuroni e astrociti, ma anche colture neurone-glia, fornendo così un ottimo modello in vitro per la modellazione di diverse malattie cerebrali, con un livello di complessità superiore rispetto alle linee cellulari immortalizzate e pure culture neuronali o gliali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario da parte di Fundao para a Ciància e a Tecnologia attraverso i progetti UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 e la borsa di studio SFRH/BD/135936/2018 a JP, di ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' attraverso il progetto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 e il finanziamento alla Piattaforma PPBI-Portoghese di BioImaging attraverso il Progetto POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
