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Neuroscience

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

doi: 10.3791/61388 Published: November 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Abstract

El accidente cerebrovascular isquémico es una condición clínica caracterizada por hipoperfusión del tejido cerebral, que conduce a la privación de oxígeno y glucosa, y la consiguiente pérdida neuronal. Numerosas pruebas sugieren que la interacción entre las células gliales y neuronales ejerce efectos beneficiosos después de un evento isquémico. Por lo tanto, para explorar posibles mecanismos de protección, es importante desarrollar modelos que permitan estudiar las interacciones neurona-glia en un entorno isquémico. Aquí presentamos un enfoque sencillo para aislar astrocitos y neuronas de la corteza embrionaria de ratas, y que mediante el uso de medios de cultivo específicos, permite el establecimiento de cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos o cultivos de neurona-glia con alto rendimiento y reproducibilidad.

Para estudiar la conversación cruzada entre astrocitos y neuronas, proponemos un enfoque basado en un sistema de co-cultivo en el que las neuronas cultivadas en cubrelips se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos chapadas en placas multipocillos. Las dos culturas se mantienen separadas por pequeñas esferas de parafina. Este enfoque permite la manipulación independiente y la aplicación de tratamientos específicos a cada tipo de célula, lo que representa una ventaja en muchos estudios.

Para simular lo que ocurre durante un accidente cerebrovascular isquémico, los cultivos se someten a un protocolo de privación de oxígeno y glucosa. Este protocolo representa una herramienta útil para estudiar el papel de las interacciones neurona-glia en el accidente cerebrovascular isquémico.

Introduction

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Según datos de la Organización Mundial de la Salud, alrededor de 5,5 millones de personas mueren cada año a causa del accidente cerebrovascular isquémico1. Esta condición se caracteriza por la interrupción del flujo sanguíneo a una determinada región cerebral, lo que resulta en una pérdida reversible o irreversible en el suministro de oxígeno y nutrientes al tejido, que altera la función tisular y conduce a la disfunción mitocondrial, desregulación del calcio, excitotoxicidad glutamato, inflamación y pérdida celular2,,3.

Aparte de las células vasculares, las células neuronales y gliales están involucradas en la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico4. En particular, los astrocitos son esenciales para el mantenimiento de las neuronas y recientemente se demostró que desempeñan un papel crítico en la respuesta a la lesión isquémica5. Este tipo de célula glial realiza funciones de soporte estructural, defensa contra el estrés oxidativo, síntesis de neurotransmisores, estabilización de la comunicación célula-célula, entre otros6. Junto con las neuronas, los astrocitos juegan un papel directo en la transmisión sináptica, regulando la liberación de moléculas como el trifosfato de adenosina, el ácido gamma-aminobutírico y el glutamato7. Parte de la lesión inducida por la isquemia es causada por la liberación excesiva de glutamato y su acumulación en la hendidura sináptica, lo que conduce a la desactivación excesiva de los receptores de N-metil-D-aspartato, activando cascadas de señalización aguas abajo, resultando en última instancia en excitotoxicidad8. Dado que los astrocitos son capaces de eliminar el glutamato de la hendidura sináptica y convertirlo en glutamina, son cruciales en la defensa contra la excitotoxicidad, ejerciendo así un efecto neuroprotector sobre la isquemia. Estas células también juegan un papel en la neuroinflamación inducida por isquemia. Después del insulto isquémico, los astrocitos activados sufren cambios morfológicos (hipertrofia), proliferan y muestran un aumento en la expresión de la proteína ácida fibribrinaria glial (GFAP). Pueden volverse reactivas (astrogliosis), liberando citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral-α, interleucina-1 e interleucina-1o, y produciendo radicales libres, incluyendo óxido nítrico y superóxido, que a su vez pueden inducir la muerte neuronal9,,10. Por el contrario, los astrocitos reactivos también pueden reproducir un efecto neuroprotector, ya que liberan citoquinas antiinflamatorias, como la transformación del factor de crecimiento β, que se regula al al al ras detrás del accidentecerebrovascular 11. Además, pueden generar una cicatriz glial, que puede limitar la regeneración tisular mediante la inhibición de la brotación axonal; sin embargo, esta cicatriz glial puede aislar el sitio de la lesión del tejido viable, evitando así una onda en cascada de daño tisular incontrolado12,13.

Por lo tanto, es imperativo establecer modelos que permitan estudiar las interacciones de la neurona-glia bajo una lesión isquémica con el fin de encontrar estrategias terapéuticas que limiten o reviertan los efectos de la lesión isquémica. En comparación con otros modelos utilizados para estudiar lesiones isquémicas, a saber, los modelos in vivo 14,15,16, cultivos organotípicos17,18,19 y rebanadas cerebrales agudas20,21,22, cultivos de células primarias son menos complejos, lo que hace posible el estudio de las contribuciones individuales de cada tipo de célula en la fisiopatología de los accidentes cerebrovasculares isquémicos y cómo cada tipo de célula responde posible a las metas terapéuticas posibles. Típicamente, con el fin de estudiar las interacciones entre cultivos enriquecidos con neuronas y cultivos enriquecidos con astrocitos, las neuronas y células gliales de origen posnatal se utilizan23,,24, o células gliales postnatales y neuronas embrionarias25,,26. Aquí se propone un enfoque simple para establecer cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos y cultivos de neurona-glia del mismo tejido. Estas células primarias se obtienen de corteza embrionaria de rata, una región frecuentemente afectada por el accidente cerebrovascular27,,28. Además, la disociación del tejido se realiza sólo mediante un procedimiento mecánico. Por lo tanto, este protocolo permite aislar las células en la misma etapa de desarrollo, de una manera rápida y económica, y con alto rendimiento y reproducibilidad.

La conversación cruzada entre astrocitos y neuronas se puede explorar utilizando un sistema de co-cultivo en el que las neuronas cultivadas en cubreobjetos se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos sembrados en placas multipocillos. Se pueden utilizar pequeñas esferas de parafina para garantizar la separación de los dos cultivos celulares. Este enfoque permite la manipulación independiente de cada tipo de celda antes de que se entren en contacto. Por ejemplo, es posible silenciar un gen específico en los astrocitos y ver cómo puede influir en la vulnerabilidad neuronal o la protección contra el daño inducido por isquémica. Un método establecido para inducir condiciones isquémicas in vitro es la privación de oxígeno y glucosa (OGD)3, que consiste en reemplazar la atmósfera regular (95% aire y 5% CO2)por una atmósfera anóxica (95% N2 y 5% CO2), asociada con la omisión de glucosa.

El método descrito es adecuado para estudiar las interacciones entre neuronas y astrocitos en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico, de una manera simple, rápida, reproducible y económica.

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Protocol

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Todos los animales utilizados fueron criados en el Centro de Investigación Científica de la Salud CICS-UBI de acuerdo con los requisitos éticos nacionales para la investigación animal y con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para fines experimentales y otros fines científicos (Directiva 2010/63/UE).

1. Cultivo de la corteza primaria de la corteza de embriones de rata

  1. Preparación de medios culturales
    1. Preparar el medio neurobasal (NBM) añadiendo los siguientes suplementos: 2% B27, 0,5 mM de glutamina, glutamato de 25 m y gentamicina de 120 g/ml. Homogeneizar, ajustar el pH a 7.2 y esterilizar el medio con un paso de filtración al vacío, utilizando un filtro de 0,22 m. Para el cultivo celular de la neurona-glia, complementar el medio de cultivo celular NBM con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (HI-FBS).
    2. Preparar el medio mínimo esencial de águila media (MEM) con los siguientes suplementos: carbonato de hidrógeno sódico 2,2 g/L, insulina del páncreas bovino 5 mg/L, D-glucosa anhidra 3,4 g/L, penicilina (12 U/ml) /estreptomicina (12 g/ml) y 10% HI-FBS. Homogeneizar, ajustar el pH a 7.2 y esterilizar el medio con un paso de filtración.
  2. Preparación de materiales y equipos
    1. Perfore la parte terminal de una punta de micropipeta de plástico de 1 ml de lado a lado, utilizando una aguja con un diámetro específico (0,5 mm para S; 0,6 mm para M; 0,8 mm para L) y selle la abertura de la punta utilizando una llama.
    2. Esterilice toda la cristalería. A lo largo de la disección, mantenga las herramientas utilizadas (por ejemplo, tijeras, pinzas, bisturí) sumergidas en 70% de etanol. Rocíe los materiales con 70% de etanol antes de introducirlos en la cámara de flujo laminar.
    3. Ajuste la temperatura del baño de agua a 37 oC y coloque el medio de cultivo celular en el baño de agua antes de iniciar el procedimiento.
      NOTA: Para ensayos de inmunocitoquímica, el recubrimiento de poli-D-lisina debe realizarse en placas multipocillos que contengan cubreobjetos.
  3. Cultivo de corteza embrionaria de rata
    1. Retirar los embriones de rata de una rata Wistar hembra con 15-16 días de gestación (el final del apareamiento, que debe durar 24 h, se considera el1o día del desarrollo embrionario). Para ello, anestesiar a la hembra con ketamina (87,5 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) y eliminar los embriones. Luego eutanasia la rata hembra por luxación cervical, siguiendo el protocolo estándar.
    2. Coloque los embriones en un tubo estéril de 50 ml, agregue la solución salina tampón de fosfato (PBS) hasta que cubra los embriones y llévenlos rápidamente a la sala de cultivo.
    3. Todavía dentro del saco de yema, coloque los embriones en un plato de Petri que contenga 25 ml de PBS frío. Con la ayuda de tijeras y pinzas, romper el saco de yema, quitar el embrión y transferirlo a otro plato de Petri que contenga también PBS frío. El PBS en el plato Petri debe ser suficiente para cubrir todo el embrión.
      NOTA: Tenga cuidado al abrir el saco de yema para evitar dañar el embrión. En 1.3.3 y 1.3.4 utilizamos platos Petri de 90 mm de diámetro colocados encima de paquetes de hielo cubiertos con papel absorbente para mantener el PBS a baja temperatura.
    4. Para la disección del embrión, transfiéralo a otro plato de Petri que contenga 30 ml de PBS frío. Coloque el embrión bajo un microscopio diseccionado e inmovilícese con una pinza. Hacer la incisión inicial paralela a la corteza, pasando desde la cavidad ocular hasta el final del hocico y tenga cuidado de no decapitar al animal.
    5. Retire cuidadosamente el cuero cabelludo y las meninges usando pinzas, con el fin de no dañar el tejido cerebral cortical. Haga la siguiente incisión para separar la corteza. Transfiera el tejido cortical a un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de PBS utilizando una pipeta Pasteur.
    6. Realizar la digestión mecánica del tejido cerebral cortical utilizando las puntas de plástico de 1 ml preparadas en 1.2.1. Triturar 10 veces con una pipeta regular y repetir el proceso utilizando pipetas con agujeros progresivamente más pequeños (L, M y S), hasta que los trozos se hayan desmoronado.
    7. Después de la digestión mecánica, centrifugar la suspensión a 400 x g durante 3 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento con el medio de cultivo celular apropiado previamente calentado a 37 oC.
    8. Determinar el número total de células presentes en la suspensión celular (densidad celular) utilizando una cámara Neubauer, hacer las diluciones apropiadas y placar las células. La densidad celular inicial se definió sobre la base de un estudio anterior5.
      1. Para un cultivo enriquecido con neuronas, utilice 0.21 x 106 células/cm2 como densidad celular inicial y mantenga las células en el medio de cultivo NBM sin HI-FBS.
      2. Para los cultivos de neurona-glia utilizar 0.14 x 106 células/cm2 como la densidad celular inicial y mantener las células en medio de cultivo NBM complementado con 10% HI-FBS.
      3. Para un cultivo enriquecido con astrocitos, utilice 0.26 x 106 células/cm2 como la densidad celular inicial y mantenga las células en MEM complementadas como se indicó anteriormente.
      4. Colocar las células en una incubadora a 37oC, 95% O2 y 5% CO2.
        NOTA: Para períodos de cultivo más largos, se debe añadir un antimitético como 27 m 5-fluoro-2o-desoxiuridina con uridina de 68 m para suprimir el crecimiento celular.

2. Sistema de co-cultura

  1. Preparación de materiales
    1. Calentar la parafina a 150oC en un bloque de calentamiento durante aproximadamente 7 min. Mantener a 150 oC hasta que finalice el procedimiento. A continuación, con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio estéril de 1 mm de diámetro, agregue una pequeña gota sobre los cubreobjetos esterilizados y recubiertos con PDL. Las esferas de parafina son irregulares, pero tienen aproximadamente 2 mm de diámetro. Las esferas permitirán separar las dos culturas por aproximadamente 1,25 mm.
    2. Como la parafina no es estéril, coloque el multipozo con las esferas de parafina bajo radiación ultravioleta durante 15 minutos.
    3. Para establecer el co-cultivo, transfiera el cubreobjetos con las esferas de parafina utilizando una pinza previamente sumergida en 70% de etanol durante 15 min.
  2. Cocultura
    1. Cuando los dos cultivos estén listos para usar (es decir, después de 7 días en cultivo en las condiciones mencionadas en el paso 1.3.8), transfiera las neuronas sembradas en los cubreobjetos con esferas de parafina a los pozos que contienen los astrocitos.
    2. 24 horas antes de que las dos culturas entren en contacto, cambie el medio de cultivo de las neuronas y astrocitos a NBM complementado, o no, con HI-FBS, dependiendo del propósito del experimento.
    3. Después de poner ambos tipos de células en contacto, espere 8-12 h antes de comenzar los diferentes estímulos y procedimientos.
      NOTA: La representación esquemática del sistema de codecultura se muestra en la Figura 1.

3. Privación de oxígeno y glucosa

  1. Preparación de Medios de Cultura
    1. Para los experimentos de OGD, utilice la Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hank. Preparar el medio HBSS con los siguientes reactivos: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4 . Homogeneizar y ajustar el pH a 7.2. Esterilice el medio por filtración.
      NOTA: Si procede, suplementar la solución HBSS con glucosa (HBSSglu+), añadiendo 5,56 mM de glucosa. Para cultivos sometidos a OGD no complementar el medio HBSS con glucosa (HBSSglu-).
  2. Procedimiento OGD
    1. 7 días después de la siembra de las células, retire el medio de cultivo y lave dos veces con HBSSglu-. Después del lavado agregue el medio de cultivo celular HBSSglu- y coloque el multipozo en la cámara de hipoxia.
    2. Selle la cámara de hipoxia y añada una mezcla de gas que contenga 95% N2/5% CO2 durante 4 min con un flujo de 20 L/min para eliminar el oxígeno presente en el interior de la cámara. Después de esto, detenga el flujo y coloque la cámara de hipoxia en una incubadora a 37 oC durante 4 h o 6 h, dependiendo de la extensión de la isquemia prevista.
    3. Después del período de OGD, sustituya el medio HBSSglu- por el medio de cultivo adecuado para los procedimientos restantes.
      NOTA: El experimento OGD tiene como objetivo simular las condiciones in vitro que sufren las células durante un evento isquémico, por lo que es importante certificar que se han eliminado todos los medios utilizados anteriormente.

4. Ensayo de inmunocitoquímica

NOTA: Realizar el ensayo de inmunocitoquímica como se describió anteriormente5.

  1. Brevemente, para caracterizar los diferentes cultivos corticales, incubar las células durante la noche a 4oC con conejo anti-GFAP (1:2000) y proteína asociada al ratón antimicrotúbulo 2 (MAP2; 1:500); y luego 1 h a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos secundarios: anti-conejo conjugado a Alexa Fluor 546 y anti-ratón conjugado a Alexa Fluor 488, ambos a 1:1000 dilución.
  2. Etiquete los núcleos celulares por incubación con 2 M de Hoechst 33342 durante 10 min a temperatura ambiente.
  3. Monte los cubreobjetos en el medio de montaje de fluorescencia y adquiera imágenes en un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 63x.

5. Análisis estadístico

  1. Expresar datos como porcentaje del número total de celdas o como porcentaje de control y presentarse como la media ± error estándar de la media (SEM) de al menos 3 experimentos independientes realizados en triplicado.
  2. Realice análisis estadísticos con software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), utilizando la prueba t del estudiante no con par. Los resultados se consideraron significativos cuando los valores de p < 0.05.

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Representative Results

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Para caracterizar los cultivos, la inmunocitoquímica para evaluar el número de células que expresaron GFAP o MAP2, se realizaron marcadores ampliamente utilizados de astrocitos y neuronas (Figura 2), en cada tipo de cultivo cortical. Este análisis reveló que los cultivos enriquecidos con astrocitos presentaban el 97% de las células que expresaban GFAP (Figura 2A). En cuanto al cultivo enriquecido con neuronas, el 78% de las células expresaron MAP2, el 4% de las células expresadas GFAP, y el 18% de las células fueron GFAP y MAP2-negativas(Figura 2B). En relación con el cultivo cortical neurona-glia, el 49% de las células fueron MAP2 positivas, el 31% eran GFAP positivas y el 20% fueron negativas para ambos marcadores(Figura 2C).

Siete días después de establecer el cultivo cortical, el cultivo de la neurona-glia y el cultivo enriquecido con neuronas fueron sometidos al procedimiento OGD, durante 4 h o 6 h. Después de este procedimiento, el número de células MAP2 y GFAP positivas fue evaluado por inmunocitoquímica. En el cultivo de neurona-glia, la pérdida de células positivas mapeadas2 fue del 30% y 60% después de 4 h y 6 h de OGD, respectivamente(Figura 3B),mientras que la pérdida de células positivas GFAP fue del 9% y 17% después de 4 h y 6 h de OGD, respectivamente (Figura 3C). En cuanto al cultivo enriquecido con neuronas, hubo una disminución del 41% y del 64% en el número de células mappositivas MAP2 después de 4 h y 6 h de OGD, respectivamente (Figura 3A). Por otra parte, en el cultivo enriquecido con neuronas, hubo un ligero aumento en la extensión de la lesión inducida por 4 h de OGD en comparación con el cultivo de la neurona-glia (Figura 3A).

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del sistema de codecultura.
(A) Los astrocitos se sembraron en un multipozo que contiene cubreobjetos recubiertos con PDL y las neuronas se sembraron en un multipozo con cubreobjetos recubiertos con PDL que contienen 3 esferas de parafina. (B) Cuando los dos cultivos estaban listos para usar, las neuronas en los cubreobjetos con las esferas se transfirieron a los pozos que contenían los astrocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización del cultivo cortical de la neurona-glia, cultivo cortical enriquecido con neuronas y cultivo cortical enriquecido con astrocitos.
Porcentaje de neuronas (células positivas MAP2), porcentaje de astrocitos (células positivas GFAP) y porcentaje de células doble negativas (células negativas MAP2/GFAP negativas) en el día7 en cultivo en (A) cultivo enriquecido con astrocitos (B) cultivo enriquecido con neuronas y (C) cultivo de neurona-glia e imágenes representativas que muestran la inmunodetención para MAPAP (verde) y GF ( El número total de células se evaluó cuantificando núcleos etiquetados con Hoechst 33342 con morfología no piknótica (azul). Debido al bajo número de neuronas en el cultivo cortical enriquecido con astrocitos, la imagen representativa no muestra la tinción positiva de MAP2. Los datos se presentan como ± SEM medio de 3 experimentos independientes (A) y 6 experimentos independientes (B, C) realizados en triplicado. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo 63x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la pérdida neuronal después de un período OGD.
(A, B) Número de neuronas/campo (células positivas MAP2) en un cultivo de neurona-glia y cultivo enriquecido con neuronas y (C) número de astrocitos/campo (células positivas GFAP) e imagen representativa de MAP2 (verde) y GFAP (rojo) inmunostaining en un cultivo de neuron-glia. El número total de células se evaluó cuantificando núcleos etiquetados con Hoechst 33342 con morfología no piknótica (azul). Los cultivos de neurona-glia y enriquecido con neuronas se sometieron a la privación de oxígeno y glucosa (OD) durante un período de 4 h y 6 h. Los datos se presentan como la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes realizados en triplicado. El número total de células se evaluó cuantificando núcleos etiquetados con Hoechst 33342. **p < 0.01, ***p < 0.001 y ****p < 0.0001 en comparación con OGD 0 h (prueba t del estudiante no publicada) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El método aquí descrito consiste en el aislamiento de astrocitos y neuronas del tejido cortical embrionario de rata, permitiendo el establecimiento de cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos o cultivos de neurona-glia. Fue adaptado de un estudio previo de nuestro grupo5,donde se describió el aislamiento de las neuronas corticales-glia y los cultivos embrionarios enriquecidos con neuronas y se caracterizaron los dos cultivos. Usando estas culturas, Roque et al. encontraron que los astrocitos juegan un papel clave en la respuesta a un daño isquémico y sugiere que la comunicación entre astrocitos y neuronas es esencial para la neuroprotección5. En el presente protocolo, además de la preparación de culturas neuron-glia y enriquecidas con neuronas, también podemos obtener culturas enriquecidas con astrocitos, lo que nos permite estudiar el efecto de un entorno isquémico en las neuronas y astrocitos aislados o juntos.

El análisis de los datos de inmunocitoquímica mostró que el 18% de las células en el cultivo enriquecido con neuronas y el 20% en los cultivos de neuronas-glia fueron negativas tanto para MAP2 como para GFAP. Estas células presentaban núcleos con morfología no piknótica. Dado que los cultivos se prepararon a partir del tejido embrionario, es posible que parte de las células aún no exprese el marcador neuronal, necesitando una maduración adicional. Esto está en línea con estudios previos que indican que la expresión MAP2 aumenta con la madurez neuronal y que el número de células MAP2 positivas aumentó con el tiempo en el cultivo y con la edad de los embriones en el momento de la disección29,,30. Hemos demostrado anteriormente que en el cultivo de neuronas-glia sólo el 0,7% de las células eran positivas para la molécula adaptadora de unión de calcio ionizada microglial marcador 15. Aunque el medio de cultivo utilizado en cultivos de neurona-glia tiene el apoyo nutricional necesario para el crecimiento de células gliales, la cantidad de microglia en la corteza de embriones con 15-16 días se reduce y como se reduce el tiempo de cultivo, el crecimiento de este tipo de célula es limitado. Lo mismo se aplica a los cultivos enriquecidos con neuronas, pero en este caso el crecimiento de las células gliales es aún más limitado debido a la ausencia de HI-FBS en el medio de cultivo.

Además de permitir que diferentes tipos de cultivos se obtengan de la misma preparación, el protocolo aquí descrito tiene otras ventajas. La suspensión de una sola célula se obtiene simplemente por digestión mecánica, a diferencia de otros métodos que utilizan digestión enzimática y mecánica24,25,31,32; por lo tanto, es más rápido y más barato. Otra ventaja es que este protocolo también se puede utilizar para preparar células de otras regiones cerebrales, como el hipocampo o el cerebro medio, permitiendo el estudio de patologías que afectan a diferentes áreas del cerebro. Además, el procedimiento alternativo descrito, que permite el establecimiento de cocultura, permite el análisis de los cambios bioquímicos y morfológicos que se producen en tipos celulares específicos presentes en el co-cultivo mediante el uso de métodos como la inmunocitoquímica. Un modelo común para el establecimiento de coculturas son los sistemas transwell24,25,33,34. Contrariamente a lo que ocurre con un sistema de co-cultivo utilizando pequeños espaciadores, como las esferas de la parafina, los modelos de co-cultivo transpolín no permiten realizar inmunocitoquímica en ambos tipos de células presentes en el co-cultivo. Además, las co-culturas que utilizan espaciadores como las esferas de parafina son simples y de bajo costo.

La sujeción de cultivos enriquecidos con neuronas o neuronas-glia a OGD es un modelo in vitro común para la isquemia, sin embargo se han utilizado otros métodos in vitro, a saber, métodos químicos y enzimáticos o la inducción de la excitotoxicidad por glutamato3,,35. En comparación con otros métodos, OGD permite la simulación de las dos fases que se producen durante el ictus isquémico, a saber, la privación de oxígeno y glucosa y la reperfusión, lo que es una ventaja porque imita lo que ocurre in vivo. Además, aunque los métodos químicos y enzimáticos pueden ser útiles debido a su rápida respuesta y facilidad de aplicación, existe una preocupación con la relevancia para el estado patológico in vivo, porque la hipoxia química conduce a una generación de radicales libres que la anoxia, superando lo que se observa in vivo35. En cuanto al protocolo OGD, observamos que conduce a la pérdida neuronal y que la extensión de la lesión se puede ajustar alterando la duración del período OGD, con el fin de alcanzar los requisitos experimentales. Las diferencias observadas en la pérdida neuronal después del período OGD en cultivos enriquecidos con neuronas y cultivos de neurona-glia pueden deberse al papel protector que desempeñan los astrocitos, atenuando así la muerte neuronal.

Como era de esperar, el daño de OGD a los astrocitos en los cultivos de neurona-glia fue menor a 4 h y 6 h en comparación con las neuronas. La mayor resistencia de los astrocitos a OGD se atribuye a múltiples aspectos. Son capaces de mantener los niveles de ATP más tiempo que las neuronas durante la isquemia, y la desregulación iónica grave procede más lentamente36:en primer lugar porque las neuronas tienen mayor densidad de canales iónicos y una consecuente mayor demanda de energía para mantener gradientes iónicos; y en segundo lugar porque la mayoría de las reservas de glucógeno en el cerebro se encuentra en astrocitos36. Además, los astrocitos expresan niveles más bajos de receptores de glutamato ionotrópico que las neuronas y tienen mejor amortiguación iónica y capacidad antioxidante36. Estos atributos presumiblemente subyacen a la conocida pérdida selectiva de neuronas sobre los astrocitos36.

En cuanto a las limitaciones del protocolo propuesto aquí, lo más significativo es que se basa en un modelo in vitro que carece de la complejidad de las interacciones que se producen en un sistema in vivo, lo que puede causar problemas de traducibilidad a una situación in vivo. Sin embargo, presenta las ventajas asociadas con los cultivos celulares, a saber, la simplicidad, la facilidad de manipulación, la capacidad de proporcionar información detallada básica sobre cómo una población celular específica responde a un cierto insulto3. Los modelos in vitro de enfermedad consumen menos tiempo y son menos costosos de mantener que los modelos in vivo. Más específicamente, para el modelado de la carrera isquémica, un modelo in vitro también posee la ventaja de ser más fácil de controlar los niveles de glucosa y oxígeno en comparación con las alternativas in vivo 34. Además, también proponemos el uso de co-cultivos, que pueden dar un mayor nivel de complejidad, permitiendo estudiar la interacción entre diferentes tipos celulares presentes en un tejido.

Hay algunos pasos críticos que requieren más atención al ejecutar el protocolo. Debido al requisito nutricional de los astrocitos, el NBM utilizado para la obtención de cultivos de neurona-glia debe complementarse con 10% de factores de crecimiento que contienen HI-FBS, aminoácidos y ácidos grasos. Esta suplementación es lo que diferencia el cultivo de la neurona-glia de la cultura enriquecida con neuronas. Para preparar un cultivo enriquecido con astrocitos se debe utilizar un medio carente de suplementos necesarios para el crecimiento neuronal, como B27. En el protocolo actual, el medio electoral para la cultura enriquecida con astrocitos era mem. También es muy importante que las necesidades de los diferentes tipos de células se asegure cuando se ponen en contacto. Para ello, podrá utilizarse un medio de cultivo compatible con astrocitos y neuronas, a saber, el NBM complementado con B27 y HI-FBS. En cuanto al protocolo OGD, los principales pasos críticos son la eliminación de todo el O2 de la cámara antes de iniciar el período OGD, y el lavado adecuado de las células con HBSS sin glucosa, con el fin de eliminar toda la glucosa presente en el medio.

En conclusión, aquí presentamos un modelo in vitro para estudiar el ictus isquémico establecido de una manera sencilla, rápida, barata y reproducible. Además, el método descrito también permite implementar cultivos primarios enriquecidos con neuronas y astrocitos, pero también cultivos de neurona-glia, proporcionando así un gran modelo in vitro para modelar varias enfermedades cerebrales, con un mayor nivel de complejidad que las líneas celulares inmortalizadas y cultivos neuronales o gliales puros.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo de financiación de la Fundación para la Ciencias y la Tecnología a través de los Proyectos UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 y la beca SFRH/BD/135936/2018 a JP, por ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" a través del proyecto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 y financiación a la Plataforma PPBI-Portugués de BioImaging a través del Proyecto POCI-01-0145-FEDER-022122.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 -well culture plates Thermo Fischer Scientific 142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
B27 supplement (50x) Gibco 17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium Dako S3023
D-glucose anhydrous Fisher Scientific G/0450/60 3.4 g/L
Epifluorescence microscope Zeiss AxioObserver Z1x 63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0615 10%
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272 120 µg/mL
Glutamate Sigma-Aldrich G8415 25µM
Glutamine Sigma-Aldrich G3126 0.5 mM
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber Stemcell Technologies 27310 Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 5 mg/L
Ketamine Sigma-Aldrich K-002 87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium Sigma-Aldrich M0268 warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2 Santa Cruz Biotechnology Sc-74421 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103-049 warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology Sigma-Aldrich 1.07164 Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde Sigma -Aldrich P6148 4% in PBS
Penicilin/Streptomycin Biochrom A 2213 penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1024
Rabbit Anti-GFAP DAKO Z0334 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate Fisher Scientific S/4240/60 2.2g/L
Xylazine Sigma-Aldrich X1126 12 mg/Kg

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References

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Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia
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Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).More

Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).

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