Summary
Ici, nous présentons une approche simple utilisant des milieux de culture spécifiques qui permettent l’établissement de cultures enrichies de neurones et d’astrocytes, ou de cultures neuron-glia du cortex embryonnaire, avec un rendement élevé et une reproductibilité.
Abstract
L’AVC ischémique est une condition clinique caractérisée par l’hypoperfusion du tissu cérébral, conduisant à la privation d’oxygène et de glucose, et la perte neuronale conséquente. De nombreuses preuves suggèrent que l’interaction entre les cellules gliales et neuronales exercent des effets bénéfiques après un événement ischémique. Par conséquent, pour explorer les mécanismes de protection potentiels, il est important de développer des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurone-glia dans un environnement ischémique. Ici, nous présentons une approche simple pour isoler les astrocytes et les neurones du cortex embryonnaire du rat, et qu’en utilisant des milieux de culture spécifiques, permet l’établissement de cultures enrichies de neurones ou d’astrocytes ou de cultures neuronaux-glia à haut rendement et reproductibilité.
Pour étudier le croisement entre les astrocytes et les neurones, nous proposons une approche basée sur un système de co-culture dans lequel les neurones cultivés en couvercles sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes plaqués dans des plaques multi-puits. Les deux cultures sont maintenues à part par de petites sphères de paraffine. Cette approche permet la manipulation indépendante et l’application de traitements spécifiques à chaque type de cellule, ce qui représente un avantage dans de nombreuses études.
Pour simuler ce qui se produit lors d’un AVC ischémique, les cultures sont soumises à un protocole de privation d’oxygène et de glucose. Ce protocole représente un outil utile pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans les accidents vasculaires cérébraux ischémiques.
Introduction
Selon les données de l’Organisation mondiale de la santé, environ 5,5 millions de personnes meurent chaque année d’un AVC ischémique1. Cette condition est caractérisée par l’interruption du flux sanguin vers une certaine région du cerveau, résultant en une perte réversible ou irréversible dans l’approvisionnement en oxygène et en nutriments du tissu, qui modifie la fonction tissulaire et conduit à un dysfonctionnement mitochondrial, dysrégulation du calcium, excitotoxicité glutamate, inflammation et perte cellulaire2,3.
En dehors des cellules vasculaires, les cellules neuronales et gliales sont impliquées dans la pathophysiologie de l’AVC ischémique4. En particulier, les astrocytes sont essentiels à l’entretien des neurones et ont récemment été montrés pour jouer un rôle critique dans la réponse à la lésion ischémique5. Ce type de cellule gliale remplit les fonctions de soutien structurel, de défense contre le stress oxydatif, de synthèse des neurotransmetteurs, de stabilisation de la communication cellule-cellule, entre autres6. Avec les neurones, les astrocytes jouent un rôle direct dans la transmission synaptique, régulant la libération de molécules telles que l’adénosine triphosphate, l’acide gamma-aminobutyrique et le glutamate7. Une partie de la blessure induite par l’ischémie est causée par la libération excessive de glutamate et son accumulation à la fissure synaptique, conduisant à la suractivation des récepteurs N-méthyl-D-aspartate, l’activation en aval des cascades de signalisation, résultant finalement en excitotoxicité8. Puisque les astrocytes sont capables d’enlever le glutamate de la fente synaptique et de le convertir en glutamine, ils sont cruciaux dans la défense contre l’excitotoxicité, exerçant ainsi un effet neuroprotecteur sur l’ischémie. Ces cellules jouent également un rôle dans la neuroinflammation induite par l’ischémie. Après l’insulte ischémique, les astrocytes activés subissent des changements morphologiques (hypertrophie), prolifèrent, et montrent une augmentation de l’expression de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). Ils peuvent devenir réactifs (astrogliose), libérant des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale α, l’interleukine-1α et l’interleukine-1β, et produisant des radicaux libres, y compris l’oxyde nitrique et le superoxyde, qui à son tour peuvent induire la mort neuronale9,10. En revanche, les astrocytes réactifs peuvent également jouer un effet neuroprotecteur, puisqu’ils libèrent des cytokines anti-inflammatoires, telles que la transformation du facteur de croissance β, qui est upregulated après l’AVC11. En outre, ils peuvent générer une cicatrice gliale, qui peut limiter la régénération des tissus en inhibant la germination axonale; cependant, cette cicatrice gliale peut isoler le site de blessure du tissu viable, empêchant ainsi une vague en cascade de dommages incontrôlés de tissu12,13.
Ainsi, il est impératif d’établir des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurone-glia sous une lésion ischémique afin de trouver des stratégies thérapeutiques qui limitent ou inversent les effets des lésions ischémiques. Par rapport à d’autres modèles utilisés pour étudier les lésions ischémiques, à savoir les modèles in vivo 14,15,16, les cultures organotypices17,18,19 et les tranches cérébrales aiguës20,21,22, les cultures cellulaires primaires sont moins complexes, ce qui permet l’étude des contributions individuelles de chaque type de cellule dans la pathophysiologie de l’AVC ischémique et comment chaque type de cellule répond à des cibles thérapeutiques possibles. Typiquement, afin d’étudier les interactions entre les cultures enrichies de neurones et les cultures enrichies d’astrocytes, les neurones et les cellules gliales d’origine postnatale sont utilisés23,24, ou cellules gliales gliales postnatales et neurones embryonnaires25,26. Ici, on propose une approche simple pour établir des cultures et des cultures de neurones enrichies de neurones ou d’astrocytes et des cultures de neurones-glia à partir du même tissu. Ces cellules primaires sont obtenues à partir du cortex embryonnaire du rat, une région fréquemment affectée par l’AVC27,28. En outre, la dissociation du tissu n’est effectuée que par une procédure mécanique. Par conséquent, ce protocole permet d’isoler les cellules dans le même stade de développement, d’une manière rapide et peu coûteuse, et avec des performances élevées et la reproductibilité.
Le croisement entre les astrocytes et les neurones peut être exploré à l’aide d’un système de co-culture dans lequel les neurones cultivés dans des couvercles sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes ensemencés dans des plaques multi-puits. De petites sphères de paraffine peuvent être utilisées pour assurer la séparation des deux cultures cellulaires. Cette approche permet une manipulation indépendante de chaque type de cellule avant qu’ils ne soient mis en contact. Par exemple, il est possible de réduire au silence un gène spécifique dans les astrocytes et de voir comment il peut influencer la vulnérabilité neuronale ou la protection contre les dommages induits par l’ischémique. Une méthode établie pour induire des conditions ischémiques in vitro est la privation d’oxygène et de glucose (OGD)3, qui consiste à remplacer l’atmosphère régulière (95% d’air et 5% de CO2)par une atmosphère anoxique (95% N2 et 5% CO2),associée à l’omission du glucose.
La méthode décrite convient à l’étude des interactions entre les neurones et les astrocytes dans le contexte d’un AVC ischémique, d’une manière simple, rapide, reproductible et peu coûteuse.
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Protocol
Tous les animaux utilisés ont été élevés au Centre de recherche en sciences de la santé du CICS-UBI conformément aux exigences éthiques nationales de la recherche sur les animaux et à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres à des fins scientifiques (directive 2010/63/UE).
1. Culture cellulaire primaire du cortex embryonnaire de rat
- Préparation des moyens culturels
- Préparer le milieu neurobasal (NBM) en ajoutant les suppléments suivants : 2 % B27, 0,5 mM de glutamine, 25 μM de glutamate et 120 μg/mL gentamicine. Homogénéiser, ajuster le pH à 7,2 et stériliser le milieu à l’aide d’une étape de filtration sous vide, à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Pour la culture cellulaire neurone-glia, compléter le milieu de culture cellulaire NBM avec 10% du sérum fœtal bovin (HI-FBS).
- Préparer le milieu minimum essentiel de l’aigle moyen (MEM) avec les suppléments suivants : carbonate d’hydrogène de sodium 2,2 g/L, insuline du pancréas bovin 5 mg/L, anhydrous D-glucose 3,4 g/L, pénicilline (12 U/mL) /streptomycine (12 μg/mL) et 10 % DE-FBS. Homogénéiser, ajuster le pH à 7,2 et stériliser le milieu à l’aide d’une étape de filtration.
- Préparation des matériaux et de l’équipement
- Percer la partie terminale d’une pointe de micropipette en plastique de 1 mL d’un côté à l’autre, à l’aide d’une aiguille d’un diamètre spécifique (0,5 mm pour S; 0,6 mm pour M; 0,8 mm pour L) et sceller l’ouverture de la pointe à l’aide d’une flamme.
- Stériliser toute la verrerie. Tout au long de la dissection garder les outils utilisés (par exemple, ciseaux, pinces à épiler, scalpel) immergé dans 70% d’éthanol. Vaporiser les matériaux avec 70 % d’éthanol avant de les pénétrer dans la chambre à débit laminaire.
- Réglez la température du bain d’eau à 37 °C et placez le milieu de culture cellulaire dans le bain d’eau avant de commencer la procédure.
REMARQUE : Pour les essais d’immunocytochimie, le revêtement poly-D-lysine doit être effectué dans des plaques multiwell contenant des couvercles.
- Culture du cortex embryonnaire des rats
- Retirer les embryons de rat d’un rat Wistar femelle avec 15-16 jours de gestation (la fin de l’accouplement, qui devrait durer 24 h, est considérée comme le1er jour du développement embryonnaire). À cette fin, anesthésier la femelle avec de la kétamine (87,5 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) et enlever les embryons. Puis euthanasier le rat femelle par dislocation cervicale, suivant le protocole standard.
- Placez les embryons dans un tube stérile de 50 ml, ajoutez la solution saline tampon de phosphate (PBS) jusqu’à ce qu’ils couvrent les embryons et les emmène rapidement dans la salle de culture.
- Toujours à l’intérieur du sac jaune, placer les embryons dans une boîte de Pétri contenant 25 mL de PBS froid. À l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, casser le sac jaune, enlever l’embryon et le transférer dans une autre boîte de Pétri contenant également pbs froid. Le PBS dans la boîte de Pétri devrait être suffisant pour couvrir l’embryon entier.
REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous ouvrez le sac jaune pour éviter d’endommager l’embryon. En 1.3.3 et 1.3.4, nous avons utilisé des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre placées sur des blocs de glace recouverts de papier absorbant pour maintenir le PBS à basse température. - Pour la dissection de l’embryon, transférez-le dans une autre boîte de Pétri contenant 30 mL de PBS froid. Placez l’embryon sous un microscope à dissection et immobilisez-le à l’aide d’une pince à épiler. Faites l’incision initiale parallèle au cortex, allant de la cavité oculaire à l’extrémité du museau et faites attention à ne pas décapiter l’animal.
- Retirez soigneusement le cuir chevelu et les méninges à l’aide de pinces à épiler, afin de ne pas endommager le tissu cortical du cerveau. Faites la prochaine incision pour séparer le cortex. Transférer le tissu cortical dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de PBS à l’aide d’une pipette Pasteur.
- Effectuer la digestion mécanique du tissu cortical du cerveau à l’aide des pointes en plastique 1 mL préparées en 1.2.1. Triturate 10 fois avec une pipette régulière et répéter le processus à l’aide de pipettes avec des trous progressivement plus petits (L, M et S), jusqu’à ce que les morceaux se soient effondrés.
- Après la digestion mécanique, centrifugez la suspension à 400 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et réesserrasser les sédiments avec le milieu de culture cellulaire approprié préalablement réchauffé à 37 °C.
- Déterminer le nombre total de cellules présentes dans la suspension cellulaire (densité cellulaire) à l’aide d’une chambre Neubauer, faire les dilutions appropriées et plaquer les cellules. La densité cellulaire initiale a été définie sur la base d’une étude précédente5.
- Pour une culture enrichie en neurones, utilisez 0,21 x 106 cellules/cm2 comme densité cellulaire initiale et maintenez les cellules dans le milieu de culture NBM sans HI-FBS.
- Pour les cultures neuroneur-glia utiliser 0,14 x 106 cellules/cm2 comme densité cellulaire initiale et de maintenir les cellules dans le milieu de culture NBM complété par 10% HI-FBS.
- Pour une culture enrichie d’astrocytes, utilisez 0,26 x 106 cellules/cm2 comme densité cellulaire initiale et maintenez les cellules dans MEM complétées comme indiqué précédemment.
- Placer les cellules dans un incubateur fixé à 37 °C, 95% O2 et 5% CO2.
REMARQUE : Pour des périodes de culture plus longues, une uridine anti-mitotique telle que 27 μM 5-fluoro-2′-désoxyuridine avec 68 μM d’uridine doit être ajoutée pour supprimer la croissance cellulaire.
2. Système de coculture
- Préparation des matériaux
- Chauffer la paraffine à 150 °C dans un bloc de chauffage pendant environ 7 min. Conserver à 150 °C jusqu’à la fin de la procédure. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile de 1 mm de diamètre, ajoutez une petite goutte sur des couvercles stérilisés et recouverts de PDL. Les sphères de paraffine sont irrégulières, mais elles ont environ 2 mm de diamètre. Les sphères permettront de séparer les deux cultures d’environ 1,25 mm.
- Comme la paraffine n’est pas stérile, placez le multiwell avec les sphères de paraffine sous rayonnement ultraviolet pendant 15 min.
- Pour établir la co-culture, transférer le couvercle avec les sphères de paraffine à l’aide d’une pince à épiler précédemment immergée dans 70% d’éthanol pendant 15 min.
- Co-culture
- Lorsque les deux cultures sont prêtes à l’emploi (c.-à-d. après 7 jours de culture dans les conditions mentionnées à l’étape 1.3.8), transférez les neurones ensemencés dans les couvercles avec des sphères de paraffine vers les puits contenant les astrocytes.
- 24 h avant que les deux cultures soient mises en contact, changer le milieu de culture des neurones et des astrocytes à NBM complété, ou non, avec HI-FBS, selon le but de l’expérience.
- Après avoir mis les deux types de cellules en contact, attendez 8-12 h avant de commencer les différents stimuli et procédures.
REMARQUE : La représentation schématique du système de coculture est indiquée à la figure 1.
3. Privation d’oxygène et de glucose
- Préparation de la culture moyenne
- Pour les expériences OGD, utilisez hank’s Balanced Salt Solution (HBSS). Préparer le support HBSS avec les réactifs suivants : 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mMNa2HPO4 .4 Homogénéiser et ajuster le pH à 7,2. Stériliser le milieu par filtration.
REMARQUE : Le cas échéant, compléter la solution HBSS par du glucose (HBSSglu+), en ajoutant 5,56 mM de glucose. Pour les cultures soumises à ogd ne complètent pas le milieu HBSS avec du glucose (HBSSglu-).
- Pour les expériences OGD, utilisez hank’s Balanced Salt Solution (HBSS). Préparer le support HBSS avec les réactifs suivants : 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mMNa2HPO4 .4 Homogénéiser et ajuster le pH à 7,2. Stériliser le milieu par filtration.
- Procédure OGD
- 7 jours après l’ensemencement des cellules, retirez le milieu de culture et lavez-le deux fois avec HBSSglu-. Après le lavage ajouter le milieu de culture HBSglu- cellule et placer le multiwell dans la chambre d’hypoxie.
- Sceller la chambre d’hypoxie et ajouter un mélange de gaz contenant 95% N2/5% CO2 pendant 4 min avec un débit de 20 L/min pour enlever l’oxygène présent à l’intérieur de la chambre. Après cela, arrêter le débit et placer la chambre d’hypoxie dans un incubateur à 37 °C pendant 4 h ou 6 h, selon l’étendue de l’ischémie prévue.
- Après la période d’OGD, remplacer le milieu HBSSglu par le support de culture approprié pour les procédures restantes.
REMARQUE : L’expérience OGD vise à simuler les conditions in vitro que souffrent les cellules lors d’un événement ischémique, il est donc important de certifier que tous les médias utilisés précédemment sont supprimés.
4. Essai d’immunocytochimie
REMARQUE : Effectuer l’essai d’immunocytochimie tel qu’il a été décrit précédemment5.
- En bref, pour caractériser les différentes cultures corticales, incuber les cellules pendant la nuit à 4 °C avec le lapin anti-GFAP (1:2000) et la protéine associée à l’anti-microtubule de souris 2 (MAP2; 1:500); puis 1 h à température ambiante avec les anticorps secondaires suivants : anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 546 et anti-souris conjugué à Alexa Fluor 488, tous deux à 1:1000 dilution.
- Étiqueter les noyaux cellulaires par incubation avec 2 μM Hoechst 33342 pendant 10 min à température ambiante.
- Montez les couvercles dans le milieu de montage de fluorescence et obtenez des images sur un microscope d’épifluorescence avec un grossissement 63x.
5. Analyse statistique
- Exprimer des données en pourcentage du nombre total de cellules ou en pourcentage de contrôle et présentées comme l’erreur standard moyenne ± de la moyenne (SEM) d’au moins 3 expériences indépendantes effectuées en triple.
- Effectuer une analyse statistique avec un logiciel (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), à l’aide du test t de l’étudiant non apparié. Les résultats ont été considérés comme significatifs lorsque les valeurs de p < 0,05.
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Representative Results
Pour caractériser les cultures, l’immunocytochimie pour évaluer le nombre de cellules qui ont exprimé GFAP ou MAP2, marqueurs largement utilisés des astrocytes et des neurones (figure 2), a été effectuée dans chaque type de culture corticale. Cette analyse a révélé que les cultures enrichies d’astrocytes présentaient 97 % des cellules exprimant le GFAP (figure 2A). En ce qui concerne la culture enrichie en neurones, 78 % des cellules ont exprimé le MAP2, 4 % des cellules ont exprimé le GFAP, et 18 % des cellules étaient à la fois GFAP et MAP2-négatives (figure 2B). En ce qui concerne la culture corticale neuronal-glia, 49% des cellules étaient MAP2-positives, 31% étaient GFAP-positive et 20% étaient négatives pour les deux marqueurs (Figure 2C).
Sept jours après l’établissement de la culture corticale, la culture neuroneur-glia et la culture neuronale-enrichie ont été soumises à la procédure OGD, pour 4 h ou 6 h. Après cette procédure, le nombre de cellules MAP2 et GFAP-positives a été évalué par immunocytochimie. Dans la culture neuroneur-glia, la perte de cellules MAP2-positives était de 30% et 60% après 4 h et 6 h d’OGD, respectivement (figure 3B), tandis que la perte de cellules GFAP-positives était de 9% et 17% après 4 h et 6 h d’OGD, respectivement (figure 3C). En ce qui concerne la culture enrichie en neurones, il y a eu une diminution de 41 % et de 64 % du nombre de cellules positives du MAP2 après 4 h et 6 h d’OGD, respectivement (figure 3A). En outre, dans la culture des neurones enrichi, il y avait une légère augmentation de l’extension des blessures induite par 4 h d’OGD par rapport à la culture neurone-glia (Figure 3A).
Figure 1 : Représentation schématique du système de coculture.
(A) Les astrocytes ont été ensemencés dans un multiwell contenant des couvercles recouverts de PDL et les neurones ont été ensemencés dans un multiwell avec des couvercles recouverts de PDL contenant 3 sphères de paraffine. (B) Lorsque les deux cultures étaient prêtes à être utilisées, les neurones des couvercles avec les sphères ont été transférés dans les puits contenant les astrocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractérisation de la culture corticale neuronal-glia, de la culture corticale enrichie en neurones et de la culture corticale enrichie d’astrocytes.
Pourcentage de neurones (cellules positives MAP2), pourcentage d’astrocytes (cellules GFAP-positives) et pourcentage de cellules double-négatives (cellules négatives MAP2/GFAP-négatives) au7ème jour en culture dans (A) culture enrichie d’astrocytes (B) culture neuronale enrichie et (C) culture neuronal-glia et images représentatives montrant l’immunostaining pour MAP2 (vert) et GFAP (rouge). Le nombre total de cellules a été évalué en quantifiant les noyaux étiquetés Hoechst 33342 avec une morphologie non pyknotique (bleu). En raison du faible nombre de neurones dans la culture corticale enrichie d’astrocytes, l’image représentative ne montre pas la coloration MAP2-positive. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM de 3 expériences indépendantes (A) et 6 expériences indépendantes (B, C) réalisées en triple. Les images ont été acquises avec un objectif 63x. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Évaluation de la perte neuronale après une période de DOG.
(A, B) Nombre de neurones/champ (cellules MAP2-positives) dans une culture neuronal-glia et une culture enrichie en neurones et (C)nombre astrocytes/champ (cellules GFAP-positives) et image représentative de MAP2 (vert) et GFAP (rouge) immunostaining dans une culture neuroneur-glia. Le nombre total de cellules a été évalué en quantifiant les noyaux étiquetés Hoechst 33342 avec une morphologie non pyknotique (bleu). Les cultures neuronaux-glia et neuronaux-enrichies ont été soumises à la privation d’oxygène et de glucose (OGD) pour une période de 4 h et 6 h. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM d’au moins 3 expériences indépendantes effectuées en triple. Le nombre total de cellules a été évalué en quantifiant les noyaux étiquetés Hoechst 33342. **p < 0,01, ***p < 0,001 et 0,0001 par rapport à OGD 0 h (test t de l’étudiant non apparié) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La méthode décrite ici consiste en l’isolation des astrocytes et des neurones du tissu cortical embryonnaire du rat, permettant l’établissement de cultures ou de cultures neuronal-glia enrichies par les neurones ou les astrocytes. Il a été adapté d’une étude précédente de notre groupe5, où le neurone cortical-glia et l’isolement des cultures embryonnaires neuron-enrichies ont été décrits et les deux cultures caractérisées. En utilisant ces cultures, Roque et coll. ont constaté que les astrocytes jouent un rôle clé dans la réponse à un dommage ischémique et suggère que la communication entre les astrocytes et les neurones est essentielle à la neuroprotection5. Dans le protocole actuel, en plus de la préparation des cultures neuronal-glia et neuronales enrichies, nous sommes également en mesure d’obtenir des cultures enrichies d’astrocytes, ce qui nous permet d’étudier l’effet d’un environnement ischémique sur les neurones et les astrocytes isolés ou ensemble.
L’analyse des données d’immunocytochimie a montré que 18% des cellules de la culture enrichie en neurones et 20% dans les cultures neuroneur-glia étaient négatives pour MAP2 et GFAP. Ces cellules ont présenté des noyaux avec la morphologie non pyknotique. Étant donné que les cultures ont été préparées à partir de tissus embryonnaires, une partie des cellules peut ne pas encore exprimer le marqueur neuronal, nécessitant une maturation supplémentaire. Ceci est conforme aux études précédentes indiquant que l’expression MAP2 augmente avec la maturité neuronale et que le nombre de cellules MAP2-positives a augmenté avec le temps en culture et avec l’âge des embryons au moment de la dissection29,30. Nous avons déjà démontré que dans la culture des neurones-glia seulement 0,7% des cellules étaient positives pour le marqueur microglial ionisé molécule d’adaptateur de liaison de calcium 15. Bien que le milieu de culture utilisé dans les cultures de neurones-glia ait le soutien nutritionnel nécessaire pour la croissance des cellules gliales, la quantité de microglie dans le cortex des embryons avec 15-16 jours est réduite et comme le temps de culture est réduit, la croissance de ce type de cellule est limitée. Il en va de même pour les cultures enrichies de neurones, mais dans ce cas, la croissance des cellules gliales est encore plus limitée en raison de l’absence de HI-FBS dans le milieu de la culture.
En plus de permettre d’obtenir différents types de cultures à partir de la même préparation, le protocole décrit ici présente d’autres avantages. La suspension unicellulaire est obtenue simplement par digestion mécanique, contrairement à d’autres méthodes qui utilisent à la fois la digestion enzymatique et mécanique24,25,31,32; par conséquent, il est plus rapide et moins cher. Un autre avantage est que ce protocole peut également être utilisé pour préparer des cellules d’autres régions du cerveau, comme l’hippocampe ou le midbrain, permettant l’étude des pathologies affectant différentes zones du cerveau. En outre, la procédure alternative décrite, qui permet l’établissement de co-cultures, permet l’analyse des changements biochimiques et morphologiques qui se produisent dans des types de cellules spécifiques présents dans la co-culture en utilisant des méthodes telles que l’immunocytochimie. Un modèle commun pour l’établissement de co-cultures est les systèmes transwell24,25,33,34. Contrairement à ce qui se produit avec un système de co-culture utilisant de petits espaceurs, tels que les sphères de paraffine, les modèles de culture de la coculture transwell ne permettent pas d’effectuer l’immunocytochimie sur les deux types de cellules présents dans la co-culture. En outre, les co-cultures utilisant des espaceurs tels que les sphères de paraffine sont simples et peu coûteux.
Soumettre les cultures neuronaux enrichies ou neuronaux-glia à l’OGD est un modèle in vitro commun pour l’ischémie, néanmoins d’autres méthodes in vitro ont été utilisées, à savoir les méthodes chimiques et enzymatiques ou l’induction de l’excitotoxicité par glutamate3,35. Par rapport à d’autres méthodes, OGD permet la simulation des deux phases qui se produisent au cours de l’AVC ischémique, à savoir la privation d’oxygène et de glucose et la reperfusion, qui est un avantage parce qu’il imite ce qui se produit in vivo. En outre, bien que les méthodes chimiques et enzymatiques puissent être utiles en raison de sa réponse rapide et de sa facilité d’application, on s’inquiète de la pertinence de l’état pathologique in vivo, parce que l’hypoxie chimique conduit à une génération de radicaux libres plus importante que l’anoxie, dépassant ce qui est observé in vivo35. En ce qui concerne le protocole OGD, nous avons observé qu’il conduit à la perte neuronale et que l’extension de la lésion peut être ajustée en modifiant la durée de la période OGD, afin d’atteindre les exigences expérimentales. Les différences observées dans la perte neuronale après la période d’OGD dans les cultures neuronales-enrichies et les cultures de neurone-glia pourraient être dues au rôle protecteur joué par les astrocytes, atténuant ainsi la mort neuronale.
Comme prévu, les dommages d’OGD aux astrocytes dans les cultures de neurone-glia étaient plus bas à 4 h et 6 h par rapport aux neurones. La résistance plus élevée des astrocytes à l’OGD est attribuée à de multiples aspects. Ils sont capables de maintenir des niveaux d’ATP plus longtemps que les neurones pendant l’ischémie, et la dysrégulation ionique grave procède plus lentement36: tout d’abord parce que les neurones ont une densité plus élevée des canaux ioniques et une demande d’énergie plus importante conséquente pour maintenir des gradients ioniques ; et deuxièmement parce que la plupart des réserves de glycogène dans le cerveau se trouve dans les astrocytes36. En outre, les astrocytes expriment des niveaux inférieurs de récepteurs de glutamate ionotrope que les neurones et ont une meilleure capacité ionique tampon et antioxydant36. Ces attributs sous-tendent probablement la perte sélective bien connue des neurones sur les astrocytes36.
En ce qui concerne les limites du protocole proposé ici, le plus important est qu’il est basé sur un modèle in vitro qui n’a pas la complexité des interactions qui se produisent dans un système in vivo, ce qui peut causer des problèmes de translatabilité à une situation in vivo. Cependant, il présente les avantages associés aux cultures cellulaires, à savoir la simplicité, la facilité de manipulation, la capacité de fournir des informations détaillées de base sur la façon dont une population cellulaire spécifique répond à une certaine insulte3. Les modèles in vitro de la maladie sont moins longs et moins coûteux à entretenir que les modèles in vivo. Plus précisément, pour la modélisation de l’AVC ischémique, un modèle in vitro possède également l’avantage d’être plus facile à contrôler les niveaux de glucose et d’oxygène par rapport aux alternatives in vivo 34. En outre, nous proposons également l’utilisation de co-cultures, qui peuvent donner un niveau plus élevé de complexité, permettant d’étudier l’interaction entre les différents types de cellules présents dans un tissu.
Il y a quelques étapes critiques qui nécessitent plus d’attention lors de l’exécution du protocole. En raison de l’exigence nutritionnelle des astrocytes, le NBM utilisé pour obtenir des cultures de neurone-glie devrait être complété par 10% des facteurs de croissance hi-FBS-contenant, les acides aminés et les acides gras. Cette supplémentation est ce qui différencie la culture neurone-glia de la culture neuronale enrichie. Pour préparer une culture enrichie d’astrocytes, un milieu dépourvu de suppléments nécessaires à la croissance neuronale, comme le B27, devrait être utilisé. Dans le protocole actuel, le moyen d’élection pour la culture enrichie d’astrocytes était MEM. Il est également très important que les besoins des différents types de cellules soient assurés lorsqu’ils sont mis en contact. À cette fin, un milieu de culture compatible avec les astrocytes et les neurones, à savoir le NBM complété par B27 et HI-FBS, peut être utilisé. En ce qui concerne le protocole OGD, les principales étapes critiques sont l’enlèvement de tous les O2 de la chambre avant de commencer la période OGD, et le lavage approprié des cellules avec HBSS sans glucose, afin d’éliminer tout le glucose présent dans le milieu.
En conclusion, nous présentons ici un modèle in vitro pour étudier l’AVC ischémique établi d’une manière simple, rapide, peu coûteuse et reproductible. En outre, la méthode décrite permet également de mettre en œuvre des cultures primaires enrichies de neurones et d’astrocytes, mais aussi des cultures neuronal-glia, fournissant ainsi un excellent modèle in vitro pour modéliser plusieurs maladies du cerveau, avec un niveau de complexité plus élevé que les lignées cellulaires immortalisées et les cultures neuronales ou gliales pures.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de Fundação para a Ciência e a Tecnologia par le biais de Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 et la bourse SFRH/BD/135936/2018 à JP, par ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' par le biais du projet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 et le financement de la plate-forme PPBI-Portugalo-portugaise de bioimaging par le biais du projet POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
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