Summary
هنا، نقدم نهجا بسيطا باستخدام وسائل الإعلام الثقافة المحددة التي تسمح بإنشاء الثقافات المخصبة الخلايا العصبية و الفلكية، أو الثقافات العصبية غليا من القشرة الجنينية، مع ارتفاع العائد والتكرار.
Abstract
السكتة الدماغية هي حالة سريرية تتميز بنقص في الدم في أنسجة الدماغ ، مما يؤدي إلى الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، وما يترتب على ذلك من فقدان الخلايا العصبية. تشير العديد من الأدلة إلى أن التفاعل بين الخلايا الدبقية والخلايا العصبية يمارس تأثيرات مفيدة بعد حدث نقص تروية. لذلك، لاستكشاف آليات الحماية المحتملة، من المهم تطوير نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا في بيئة نقص تروية. هنا نقدم نهجا بسيطا لعزل الخلايا الفلكية والخلايا العصبية من قشرة الجنين الفئران، وذلك باستخدام وسائل الإعلام ثقافة محددة، ويسمح بإنشاء الثقافات العصبية أو استروينست أو الثقافات العصبية glia مع قابلية إنتاج عالية.
لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، نقترح نهجا يستند إلى نظام الثقافة المشتركة التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في الأغطية في اتصال مع أحادية من الخلايا الفلكية مطلية في لوحات متعددة. يتم الحفاظ على الثقافتين بعيدا عن طريق مجالات البارافين الصغيرة. هذا النهج يسمح للتلاعب مستقلة وتطبيق علاجات محددة لكل نوع الخلية، والذي يمثل ميزة في العديد من الدراسات.
لمحاكاة ما يحدث أثناء السكتة الدماغية، وتخضع الثقافات إلى الأكسجين والجلوكوز بروتوكول الحرمان. يمثل هذا البروتوكول أداة مفيدة لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في السكتة الدماغية.
Introduction
وفقا لبيانات من منظمة الصحة العالمية، يموت حوالي 5.5 مليون شخص كل عام بسبب السكتة الدماغية الإقفارية1. يتميز هذا الشرط بانقطاع تدفق الدم إلى منطقة معينة من الدماغ ، مما يؤدي إلى فقدان عكسه أو لا رجعة فيه في إمدادات الأكسجين والمواد المغذية للأنسجة ، مما يغير وظيفة الأنسجة ويؤدي إلى خلل الميتوكوندريا ، dysregulation الكالسيوم ، استثارة الجلوتامات ، الالتهاب وفقدان الخلايا2،3.
وبصرف النظر عن الخلايا الوعائية، وتشارك الخلايا العصبية والزبقية في الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغيةالإقفارية 4. على وجه الخصوص، الخلايا الفلكية ضرورية للحفاظ على الخلايا العصبية، ومؤخرا تبين أن تلعب دورا حاسما في الاستجابة للآفات الإقفاري5. هذا النوع من الخلايا الدبقية يؤدي وظائف الدعم الهيكلي، والدفاع ضد الأكسدة، وتركيب الناقلات العصبية، واستقرار الاتصالات الخلوية، من بين أمور أخرى6. جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية، تلعب الخلايا الفلكية دورا مباشرا في انتقال متشابك، وتنظيم إطلاق جزيئات مثل الأدينوسين ثلاثي الفوسفات، حمض غاما أمينوبوتيريك والغلوتامات7. جزء من الإصابة الناجمة عن نقص التروية سببه الافراط في إطلاق الغلوتامات وتراكمه عند الشق المشبكى ، مما يؤدي إلى فرط تنشيط مستقبلات N-methyl-D-aspartate ، وتفعيل الشلالات الإشارات المصب ، مما أدى في نهاية المطاف إلى استثارة8. منذ الخلايا الفلكية قادرة على إزالة الغلوتامات من الشق متشابك وتحويلها إلى الجلوتامين، فهي حاسمة في الدفاع ضد السمية، وبالتالي ممارسة تأثير العصبية على نقص تروية. هذه الخلايا تلعب أيضا دورا في نقص التروية الناجمة عن العصبية. بعد الإهانة الإقفاريّة، تخضع الخلايا الفلكية المنشطة لتغييرات مورفولوجية (تضخم)، وتتكاثر، وتظهر زيادة في تعبير البروتين الهرفي الهرفي الحمضي (GFAP). يمكن أن تصبح رد الفعل (astrogliosis), إطلاق السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل الورم نخر عامل α, interleukin-1α وinterleukin-1β, وإنتاج الجذور الحرة, بما في ذلك أكسيد النيتريك و superoxide, والتي بدورها يمكن أن تحفز الموت العصبي9,10. في المقابل، قد تلعب الخلايا الفلكية التفاعلية أيضًا تأثيرًا عصبيًا، نظرًا لأنها تطلق السيتوكينات المضادة للالتهابات، مثل تحويل عامل النمو β، الذي يتم تنظيمه بعد السكتة الدماغية11. وعلاوة على ذلك, أنها يمكن أن تولد ندبة الدبقية, التي يمكن أن تحد من تجديد الأنسجة عن طريق تثبيط تنبت محور عصبي; ومع ذلك، يمكن لهذه الندبة الدبقية عزل موقع الإصابة من الأنسجة القابلة للحياة، وبالتالي منع موجة متتالية من تلف الأنسجة غير المنضبط12،13.
وبالتالي، لا بد من إنشاء نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا تحت إصابة إقفاري من أجل العثور على استراتيجيات علاجية تحد أو تعكس آثار الإصابة الإقفاري. مقارنة مع النماذج الأخرى المستخدمة لدراسة إصابة الإقفار، وهي في نماذج vivo 14,15,16, الثقافات العضوية17,18,19 و شرائح الدماغ الحادة20,21,22, الثقافات الأولية الخلية هي أقل تعقيدا, مما يجعل من الممكن دراسة المساهمات الفردية لكل نوع خلية في الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية وكيف يستجيب كل نوع خلية للأهداف العلاجية المحتملة. عادة، من أجل دراسة التفاعلات بين الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية والثقافات المخصبة الفلكية، وتستخدم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من أصل ما بعد الولادة23،24، أو الخلايا الدبقية بعد الولادة والخلايا العصبية الجنينية25،26. ويقترح هنا نهجا بسيطا لإنشاء العصبية أو الثقافات المخصب استروينية الخلايا العصبية والخلايا العصبية- غليا الثقافات من نفس الأنسجة. يتم الحصول على هذه الخلايا الأولية من قشرة الجنين الفئران، وهي منطقة تتأثر كثيرا من السكتة الدماغية27،28. وعلاوة على ذلك ، يتم فصل الأنسجة فقط عن طريق إجراء ميكانيكي. لذلك ، يسمح هذا البروتوكول عزل الخلايا في نفس مرحلة التطوير ، بطريقة سريعة وغير مكلفة ، ومع الأداء العالي وقابلية التكاثر.
يمكن استكشاف الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام نظام الثقافة المشتركة التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في الأغطية على اتصال مع أحادية الطبقة من الخلايا الفلكية مبذرة في لوحات متعددة. ويمكن استخدام مجالات البارافين الصغيرة لضمان الفصل بين ثقافتي الخلية. يسمح هذا النهج بمعالجة مستقلة لكل نوع خلية قبل أن يتم الاتصال بها. على سبيل المثال، من الممكن إسكات جين معين في الخلايا الفلكية ونرى كيف يمكن أن تؤثر على ضعف الخلايا العصبية أو الحماية ضد الضرر الناجم عن الإقفار. وهناك طريقة راسخة للحث على حالات تشبه الإقفارية في المختبر هو الأكسجين والحرمان من الجلوكوز (OGD)3، والذي يتكون في استبدال الغلاف الجوي العادي (95٪ الهواء و 5 ٪ CO2)عن طريق الغلاف الجوي anoxic (95 ٪ N2 و 5 ٪ CO2) ، المرتبطة إغفال الجلوكوز.
الطريقة الموصوفة مناسبة لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الفلكية في سياق السكتة الدماغية الإقفارية ، بطريقة بسيطة وسريعة وقابلة للتكرار وغير مكلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تربية جميع الحيوانات المستخدمة في مركز بحوث العلوم الصحية CICS-UBI وفقا للمتطلبات الأخلاقية الوطنية للبحوث الحيوانية وللاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة للأغراض التجريبية وغيرها من الأغراض العلمية (التوجيه 2010/63/EU).
1. الجرذ الجنين قشرة ثقافة الخلية الأولية
- إعداد الثقافة المتوسطة
- إعداد متوسطة الاعصاب (NBM) عن طريق إضافة المكملات التالية: 2٪ B27, 0.5 mM الجلوتامين, 25 ميكرومتر الغلوتامات و 120 ميكروغرام/مل جنتاميسين. التجانس، وضبط درجة اله إلى 7.2 وتعقيم المتوسطة مع خطوة الترشيح فراغ، وذلك باستخدام مرشح 0.22 μm. بالنسبة لثقافة الخلية العصبية-glia، تكمل خلية NBM المتوسطة مع 10٪ من مصل البقر الجنين المعطل حراريا (HI-FBS).
- إعداد الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسية (MEM) المتوسطة مع المكملات التالية: كربونات الهيدروجين الصوديوم 2.2 غرام / لتر، الأنسولين من البنكرياس البقري 5 ملغ / لتر، د-جلوكوز اللامائية 3.4 ز / لتر، البنسلين (12 U/mL) / ستربتوميسين (12 ميكروغرام / مل) و 10٪ HI-FBS. التجانس، وضبط درجة اله إلى 7.2 وتعقيم المتوسطة مع خطوة الترشيح.
- إعداد المواد والمعدات
- ثقب الجزء الطرفي من طرف ميكروبيت بلاستيكي 1 مل من جانب إلى آخر، باستخدام إبرة بقطر محدد (0.5 مم لـ S؛ 0.6 مم لـ M؛ 0.8 مم لـ L) وختم فتحة الطرف باستخدام شعلة.
- تعقيم جميع الأواني الزجاجية. في جميع أنحاء تشريح الحفاظ على الأدوات المستخدمة (على سبيل المثال، مقص، ملاقط، مشرط) مغمورة في الإيثانول 70٪. رش المواد مع 70٪ الإيثانول قبل إدخالها في غرفة تدفق laminar.
- تعيين درجة حرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية ووضع متوسطة ثقافة الخلية في حمام الماء قبل البدء في الإجراء.
ملاحظة: بالنسبة لمقايسات الكيمياء المناعية، ينبغي إجراء طلاء بولي-د-ليسين في ألواح متعددة المستويات تحتوي على أغطية.
- ثقافة قشرة الجنينية للفئران
- إزالة الأجنة الفئران من أنثى ويستر الفئران مع 15-16 يوما من الحمل (نهاية التزاوج، والتي ينبغي أن تستمر 24 ح، ويعتبر 1st اليوم من النمو الجنيني). ولهذا الغرض، يُخدِّر الأنثى بالكيتامين (87.5 ملغم/كغم) والزيلازين (12 ملغم/كغ) ويزيل الأجنة. ثم القتل الرحيم الفئران الإناث عن طريق خلع عنق الرحم، بعد البروتوكول القياسي.
- ضع الأجنة في أنبوب معقمة 50 مل، أضف محلول الفوسفات الملحي (PBS) حتى يغطي الأجنة واصطُر بها بسرعة إلى غرفة الاستزراع.
- لا يزال داخل كيس الصفار، ووضع الأجنة في طبق بيتري تحتوي على 25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. مع مساعدة من مقص والملاقط، وكسر كيس صفار، وإزالة الجنين ونقلها إلى آخر طبق بيتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة أيضا. يجب أن يكون برنامج تلفزيوني في طبق بيتري كافيا لتغطية الجنين بأكمله.
ملاحظة: كن حذرا عند فتح كيس صفار لتجنب إتلاف الجنين. في 1.3.3 و 1.3.4 استخدمنا 90 ملم قطر أطباق بيتري وضعت على رأس حزم الجليد مغطاة ورقة ماصة للحفاظ على برنامج تلفزيوني في درجة حرارة منخفضة. - لتشريح الجنين، نقله إلى طبق بتري آخر يحتوي على 30 مل من PBS الباردة. ضع الجنين تحت مجهر تشريح وشل حركته باستخدام ملاقط. جعل الشق الأولي بالتوازي مع القشرة، والذهاب من تجويف العين إلى نهاية كمامة والحرص على عدم قطع رأس الحيوان.
- إزالة بعناية فروة الرأس وال السحايا باستخدام ملاقط، من أجل عدم تلف أنسجة الدماغ القشرية. جعل الشق المقبل لفصل القشرة. نقل الأنسجة القشرية إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة باستور.
- إجراء الهضم الميكانيكية للأنسجة المخ القشرية باستخدام نصائح بلاستيكية 1 مل أعدت في 1.2.1. Triturate 10 مرات مع ماصة العادية وتكرار العملية باستخدام الماصات مع ثقوب أصغر تدريجيا (L، M و S)، حتى تنهار قطع.
- بعد الهضم الميكانيكي، الطرد المركزي تعليق في 400 × ز لمدة 3 دقائق. تخلص من الرواسب الفائقة و resuspend مع متوسطة مناسبة لثقافة الخلية التي تم تسخينها سابقًا عند 37 درجة مئوية.
- تحديد العدد الإجمالي للخلايا الموجودة في تعليق الخلية (كثافة الخلية) باستخدام غرفة Neubauer، وجعل التخفيف المناسبة وطبق الخلايا. تم تحديد كثافة الخلية الأولية بناء على دراسة سابقة5.
- لثقافة الخلايا العصبية المخصب، استخدم 0.21 × 106 خلايا/سم2 ككثافة الخلايا الأولية والحفاظ على الخلايا في ثنائية الثقافة NBM دون عالية FBS.
- لثقافات الخلايا العصبية-glia استخدام 0.14 × 106 الخلايا/سم2 ككثافة الخلية الأولية والحفاظ على الخلايا في تربية ني إم المتوسطة تكمل مع 10٪ مرحبا FBS.
- بالنسبة لثقافة استروبايتية، استخدم 0.26 × 106 خلايا/سم2 ككثافة خلايا أولية والحفاظ على الخلايا في MEM المكملة كما هو مبين سابقاً.
- وضع الخلايا في حاضنة تعيين في 37 درجة مئوية، 95٪ O2 و 5٪ CO2.
ملاحظة: لفترات أطول من الثقافة، المضادة للميتوتيك مثل 27 μM 5-fluoro-2′deoxyuridine مع 68 μM uridine ينبغي أن تضاف لقمع نمو الخلايا.
2- نظام الثقافة المشتركة
- إعداد المواد
- سخني البارافين على درجة حرارة 150 درجة مئوية في كتلة تدفئة لمدة 7 دقائق تقريبًا. حافظ على درجة حرارة 150 درجة مئوية حتى الانتهاء من العملية. ثم، مع مساعدة من 1 مم قطرها مفط الزجاج المعقم باستور، إضافة قطرة صغيرة على تعقيم وأغطية مغلفة PDL. مجالات البارافين غير منتظمة، ولكن لديها ما يقرب من 2 ملم القطر. وسوف تسمح هذه المجالات بين الثقافتين التي تفصل بينهما حوالي 1.25 ملم.
- كما البارافين ليست عقيمة، ضع متعدد الويل مع مجالات البارافين تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
- لإقامة ثقافة المشاركة، نقل الغطاء مع مجالات البارافين باستخدام ملاقط مغمورة سابقا في الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة.
- الثقافة المشتركة
- عندما تكون الثقافتان جاهزتين للاستخدام (أي بعد 7 أيام في الثقافة في ظل الظروف المذكورة في الخطوة 1.3.8)، قم بنقل الخلايا العصبية المصنفة في الأغطية مع مجالات البارافين إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا الفلكية.
- 24 ساعة قبل أن يتم جلب الثقافتين في الاتصال، وتغيير ثقافة المتوسطة من الخلايا العصبية والخلايا الفلكية إلى NBM تستكمل، أو لا، مع مرحبا-FBS، اعتمادا على الغرض من التجربة.
- بعد وضع كلا النوعين الخلية في الاتصال، والانتظار 8-12 ساعة قبل البدء في المحفزات المختلفة والإجراءات.
ملاحظة: يتم عرض التمثيل التخطيطي لنظام الثقافة المشتركة في الشكل 1.
3- الحرمان من الأكسجين والجلوكوز
- إعداد متوسط الثقافة
- لتجارب OGD، استخدم حل الملح المتوازن من هانك (HBSS). إعداد متوسط HBSS مع الكواشف التالية: 1.26 mM CaCl2, 5.36 mM KCl , 0.44 mM KH2PO4, 0.49 mM MgCl2, 139.9 mM NaCl , 4.17 mM NaHCO3, 3.38 mM Na2HPO4. التجانس وضبط درجة اله pH إلى 7.2. تعقيم المتوسطة عن طريق الترشيح.
ملاحظة: إذا كان ذلك مناسبا، تكملة حل HBSS مع الجلوكوز (HBSSglu+)، عن طريق إضافة 5.56 mM الجلوكوز. بالنسبة للثقافات المقدمة إلى OGD لا تكمل وسيط HBSS مع الجلوكوز (HBSSglu-).
- لتجارب OGD، استخدم حل الملح المتوازن من هانك (HBSS). إعداد متوسط HBSS مع الكواشف التالية: 1.26 mM CaCl2, 5.36 mM KCl , 0.44 mM KH2PO4, 0.49 mM MgCl2, 139.9 mM NaCl , 4.17 mM NaHCO3, 3.38 mM Na2HPO4. التجانس وضبط درجة اله pH إلى 7.2. تعقيم المتوسطة عن طريق الترشيح.
- إجراء OGD
- بعد 7 أيام من بذر الخلايا، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسل مرتين مع HBSSglu-. بعد الغسيل إضافة HBSSglu- خلية ثقافة المتوسطة ووضع متعدد في غرفة نقص الأكسجة.
- ختم غرفة نقص الأكسجة وإضافة مزيج الغاز التي تحتوي على 95٪ N2/5٪ CO2 لمدة 4 دقائق مع تدفق 20 لتر / دقيقة لإزالة الأكسجين الموجود داخل الغرفة. بعد ذلك، وقف تدفق ووضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو 6 ح، اعتمادا على مدى الإقفار المقصود.
- بعد فترة OGD، استبدال واسطة HBSSglu - مع الوسط الثقافة المناسبة للإجراءات المتبقية.
ملاحظة: تهدف تجربة OGD إلى محاكاة الظروف في المختبر التي تعاني منها الخلايا أثناء حدث إقفاري، لذا من المهم أن يشهد أن جميع الوسائط المستخدمة سابقاً تتم إزالتها.
4. فحص الكيمياء المناعية
ملاحظة: إجراء فحص مناعي للكيمياء كما هو موضح سابقا5.
- بإيجاز, لتوصيف مختلفة [كرتيكل] ثقافات, ينبس الخلايا بين عشية وضحاها في 4 [ك] مع أرنب [أنتي-يفب] (1:2000) وماوس مضادّة [ميكروتومّي] بروتين 2 ([م2]؛ 1:500); ثم 1 ح في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية التالية: المضادة للأرنب مترافق إلى فلور اليكسا 546 ومكافحة الماوس مترافقة إلى فلور اليكسا 488، وكلاهما في 1:1000 تخفيف.
- تسمية نواة الخلية عن طريق الحضانة مع 2 μM Hoechst 33342 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- جبل يغطي في الفلوريسنس تصاعد المتوسطة والحصول على الصور على مجهر epifluorescence مع التكبير 63x.
5 - التحليل الإحصائي
- التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من العدد الإجمالي للخلايا أو كنسبة مئوية من السيطرة وعرضها على أنها متوسط الخطأ القياسي ± المتوسط (SEM) من 3 تجارب مستقلة على الأقل أجريت في ثلاث 3333333333.
- إجراء تحليل إحصائي مع البرمجيات (شركة البرمجيات GraphPad، سان دييغو، كاليفورنيا)، وذلك باستخدام اختبار الطالب ر غير مفجّر. واعتبرت النتائج هامة عندما قيم p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوصيف الثقافات، تم تنفيذ الكيمياء المناعية لتقييم عدد الخلايا التي أعربت عن GFAP أو MAP2، علامات تستخدم على نطاق واسع من الخلايا الفلكية والخلايا العصبية(الشكل 2)،في كل نوع من الثقافة القشرية. وكشف هذا التحليل أن الثقافات المخصبة الفلكية قدمت 97٪ من الخلايا التي تعبر عن GFAP (الشكل 2A). فيما يتعلق بالخلايا العصبية المخصب الثقافة 78٪ من الخلايا أعرب MAP2، 4٪ من الخلايا أعرب GFAP، و 18٪ من الخلايا كانت على حد سواء GFAP و MAP2-السلبية(الشكل 2B). فيما يتعلق بالخلايا العصبية-glia القشرية الثقافة, 49% من الخلايا كانت MAP2 إيجابية, 31% كانت GFAP إيجابية و 20% كانت سلبية لكلا علامات(الشكل 2C).
سبعة أيام بعد تأسيس الثقافة القشرية, والخلايا العصبية- ثقافة glia والخلايا العصبية المخصب الثقافة تعرضت لإجراء OGD, لمدة 4 ح أو 6 ح. بعد هذا الإجراء، تم تقييم عدد الخلايا الإيجابية MAP2 و GFAP بواسطة الكيمياء المناعية. في ثقافة الخلايا العصبية-glia، كان فقدان الخلايا الإيجابية MAP2 30٪ و 60٪ بعد 4 ح و 6 ح من OGD، على التوالي (الشكل 3B)، في حين أن فقدان الخلايا إيجابية GFAP كان 9٪ و 17٪ بعد 4 ح و 6 ح من OGD، على التوالي (الشكل 3C). فيما يتعلق بالخلايا العصبية المخصب الثقافة, كان هناك انخفاض 41% و 64% في عدد الخلايا الإيجابي MAP2 بعد 4 ح و 6 ح من OGD, على التوالي (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، في الثقافة المخصب بالخلايا العصبية، كان هناك زيادة طفيفة في تمديد الإصابة الناجمة عن 4 ح من OGD بالمقارنة مع ثقافة الخلايا العصبية-غليا(الشكل 3A).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لنظام الثقافة المشتركة.
(أ) تم بذر الخلايا الفلكية في عدة كويل يحتوي على أغطية مغلفة PDL والخلايا العصبية كانت مبذرة في عدة أغطية مغلفة PDL تحتوي على 3 مجالات البارافين. (B) عندما كانت الثقافتان جاهزتين للاستخدام ، تم نقل الخلايا العصبية في الأغطية مع المجالات إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا الفلكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف الثقافة القشرية العصبية- غليا، والثقافة القشرية الغنية بالخلايا العصبية، والثقافة القشرية المثرية بالخلايا الفلكية.
النسبة المئوية للخلايا العصبية (الخلايا الإيجابية MAP2)، النسبة المئوية للخلايا الفلكية (الخلايا الإيجابية GFAP)، والنسبة المئوية للخلايا السلبية المزدوجة (الخلايا السلبية MAP2-سالبة/GFAP-السلبية) في اليومالسابع في الثقافة في (A) الثقافة المخصبة في الخلايا الفلكية (B) الثقافة المخصب بالخلايا العصبية و(C)ثقافة الخلايا العصبية-glia والصور التمثيلية التي تظهر الكبت المناعي لـ MAP2 (الأخضر) وGFAP (أحمر). تم تقييم العدد الإجمالي للخلايا عن طريق تحديد كمية خلايا Hoechst 33342 ذات العلامات النووية مع مورفولوجيا غير pyknotic (الأزرق). بسبب انخفاض عدد الخلايا العصبية في الثقافة القشرية المستروى الفلكية ، لا تظهر الصورة التمثيلية تلطيخ MAP2 الإيجابي. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM من 3 تجارب مستقلة (A) و 6 تجارب مستقلة (B, C) أجريت في ثلاث ية. تم الحصول على الصور بهدف 63x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم فقدان الخلايا العصبية بعد فترة OGD.
(أ، ب) عدد الخلايا العصبية / الحقل (الخلايا الإيجابية MAP2) في ثقافة الخلايا العصبية-غليا و الثقافة المخصب بالخلايا العصبية و (C) عدد الخلايا الفلكية / الحقل (الخلايا الإيجابية GFAP) وصورة تمثيلية لـ MAP2 (الأخضر) وGFAP (أحمر) مناعة في ثقافة الخلايا العصبية-غليا. تم تقييم العدد الإجمالي للخلايا عن طريق تحديد كمية خلايا Hoechst 33342 ذات العلامات النووية مع مورفولوجيا غير pyknotic (الأزرق). تم تقديم الثقافات العصبية والخلايا العصبية المخصب إلى الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD) لفترة 4 ح و 6 ح. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM من 3 تجارب مستقلة على الأقل تم إجراؤها في ثلاث تجارب. تم تقييم العدد الإجمالي للخلايا من خلال تحديد كمية النيات ذات العلامات 33342 Hoechst. ** ف < 0.01، *** ف < 0.001 و ****p < 0.0001 مقارنة مع OGD 0 ح (غير المدفوعة بـ اختبار الطالب) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا تتكون من العزلة الفلكية والخلايا العصبية من الأنسجة القشرية الجنينية الفئران، مما يسمح بإنشاء الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية أو الخلايا الفلكية أو الثقافات العصبية غليا. وقد تم تكييفها من دراسة سابقة لمجموعتنا5, حيث وصفت الخلايا العصبية القشرية - glia والخلايا العصبية المخصب عزل الثقافات الجنينية واثنين من الثقافات التي تتميز. وباستخدام هذه الثقافات، وجد روكي وآخرون أن الخلايا الفلكية تلعب دورًا رئيسيًا في الاستجابة لتلف إقفاري ويشير إلى أن التواصل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية ضروري للبروتين العصبي5. في هذا البروتوكول، بالإضافة إلى إعداد الثقافات العصبية-glia والخلايا العصبية المخصب، ونحن أيضا قادرة على الحصول على الثقافات المخصب استربيث، والذي يسمح لنا لدراسة تأثير بيئة نقص تروية على الخلايا العصبية والخلايا الفلكية معزولة أو معا.
أظهر تحليل بيانات الكيمياء المناعية أن 18٪ من الخلايا في الثقافة الغنية بالخلايا العصبية و 20٪ في ثقافات الخلايا العصبية-غليا كانت سلبية لكل من MAP2 و GFAP. قدمت هذه الخلايا النوى مع مورفولوجيا غير pyknotic. وبالنظر إلى أن الثقافات كانت معدة من الأنسجة الجنينية، قد لا يعبر جزء من الخلايا بعد عن علامة الخلايا العصبية، مما يتطلب المزيد من النضج. وهذا يتماشى مع الدراسات السابقة التي تشير إلى أن التعبير MAP2 يزيد مع نضج الخلايا العصبية وأن عدد الخلايا الإيجابية MAP2 زادت مع الوقت في الثقافة ومع عمر الأجنة في وقت تشريح29,30. لقد أثبتنا سابقا أن في العصبية- glia الثقافة فقط 0.7٪ من الخلايا كانت إيجابية لعلامة ميكروجليال المتأينة الكالسيوم ملزم جزيء محول 15. على الرغم من أن الوسيلة المستخدمة في الاستزراع العصبي-glia لديها الدعم الغذائي اللازم لنمو الخلايا الدغلية، فإن كمية الميكروفليا في قشرة الأجنة مع 15-16 يوماً تنخفض، ومع انخفاض وقت الثقافة، فإن نمو هذا النوع من الخلايا محدود. وينطبق الشيء نفسه على الثقافات المخصب بالخلايا العصبية ، ولكن في هذه الحالة فإن نمو الخلايا الدبقية محدود أكثر بسبب غياب HI-FBS في الوسط الثقافي.
وبالإضافة إلى السماح بالحصول على أنواع مختلفة من الثقافات من نفس الإعداد، فإن البروتوكول الموصوف هنا له مزايا أخرى. يتم الحصول على تعليق وحيد الخلية ببساطة عن طريق الهضم الميكانيكية, على عكس الطرق الأخرى التي تستخدم كلا من الهضم الأنزيمي والميكانيكية24,25,31,32; لذلك، فمن أسرع وأرخص. ميزة أخرى هي أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه أيضًا لإعداد خلايا من مناطق الدماغ الأخرى ، مثل قرن آمون أو منتصف النهر ، مما يسمح بدراسة الأمراض التي تؤثر على مناطق مختلفة من الدماغ. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء البديل الموصوف، الذي يسمح بإنشاء الثقافات المشتركة، يسمح بتحليل التغيرات الكيميائية الحيوية والمورفولوجية التي تحدث في أنواع محددة من الخلايا الموجودة في الثقافة المشتركة باستخدام أساليب مثل الكيمياء المناعية. نموذج مشترك لإنشاء الثقافات المشتركة هو نظم transwell24،25،33،34. على عكس ما يحدث مع نظام ثقافة المشاركة باستخدام الفواصل الصغيرة، مثل مجالات البارافين، نماذج الثقافة المشتركة عبرويل لا تسمح لأداء الكيمياء المناعية على كلا أنواع الخلايا الموجودة في الثقافة المشتركة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافات المشتركة التي تستخدم الفواصل مثل مجالات البارافين بسيطة ومنخفضة التكلفة.
إخضاع الخلايا العصبية المخصب أو الخلايا العصبية- الثقافات glia لGOGD هو نموذج مشترك في المختبر لاقفيميا, ومع ذلك تم استخدام طرق أخرى في المختبر, وهي الطرق الكيميائية والانزيمية أو تحريض على السمية من قبل الغلوتامات3,35. وبالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن OGD تسمح بمحاكاة المرحلتين اللتين تحدثان أثناء السكتة الدماغية، وهما الحرمان من الأكسجين والجلوكوز والتسريب، وهي ميزة لأنها تحاكي ما يحدث في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الأساليب الكيميائية والإزيمية قد تكون مفيدة نظرا لاستجابة سريعة وسهولة التطبيق، وهناك قلق مع أهمية في الحالة المرضية في الجسم الحي، لأن نقص الأكسجة الكيميائية يؤدي إلى جيل أكثر حرية الراديكالية من أنوكسيا، متجاوزا ما لوحظ في الجسم الحي35. فيما يتعلق ببروتوكول OGD ، لاحظنا أنه يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية وأنه يمكن تعديل تمديد الآفة عن طريق تغيير مدة فترة OGD ، من أجل الوصول إلى المتطلبات التجريبية. الاختلافات التي لوحظت في فقدان الخلايا العصبية بعد فترة OGD في الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية والثقافات العصبية-غليا قد يكون بسبب الدور الوقائي الذي لعبته الخلايا الفلكية، وبالتالي تخفيف الموت العصبي.
كما هو متوقع, تلف OGD إلى الخلايا الفلكية في الثقافات الخلايا العصبية-glia كان أقل في كل من 4 ح و 6 ح بالمقارنة مع الخلايا العصبية. ويعزى المقاومة العليا من الخلايا الفلكية إلى OGD جوانب متعددة. هم يمكن أن يحافظ [أتب] مستويات طويلة من خلايا عصبيّة أثناء [إإكسيميا], وشدّة [ديسكتروغ] قاسية يستمرّ أكثر ببطء36: أولى لأنّ [نيونس] يتلقّى كثافة أعلى من قنوات أيونية ويترتب على زيادة طاقة طلب أن يحافظ تدرجات [أيونيك]; وثانيا لأن معظم مخازن الجليكوجين في المخ وجدت في الخلايا الفلكية36. بالإضافة إلى ذلك, astrocytes التعبير عن مستويات أقل من مستقبلات الغلوتامات ionotropic من الخلايا العصبية ولها أفضل التخزين المؤقت الأيونية ومضادات الأكسدةقدرة 36. هذه الصفات يفترض أن تكمن وراء فقدان انتقائية معروفة من الخلايا العصبية على الخلايا الفلكية36.
فيما يتعلق بالقيود المفروضة على البروتوكول المقترح هنا ، فإن أهمها هو أنه يستند إلى نموذج في المختبر يفتقر إلى تعقيد التفاعلات التي تحدث في نظام vivo ، والذي يمكن أن يسبب مشكلات في الترجمة إلى حالة في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإنه يعرض المزايا المرتبطة بثقافات الخلايا ، وهي البساطة ، وسهولة التلاعب ، والقدرة على توفير معلومات مفصلة أساسية حول كيفية استجابة مجموعة خلايا محددة لإهانة معينة3. في المختبر نماذج من المرض هي أقل استهلاكا للوقت وأقل تكلفة للحفاظ على مما كانت عليه في نماذج الجسم الحي. وبشكل أكثر تحديدا، لنمذجة السكتة الدماغية، ونموذج في المختبر أيضا تمتلك ميزة كونها أسهل للسيطرة على مستويات الجلوكوز والأكسجين بالمقارنة مع البدائل في الجسم الحي 34. وعلاوة على ذلك، نقترح أيضا استخدام الثقافات المشتركة، والتي يمكن أن تعطي مستوى أعلى من التعقيد، مما يسمح لدراسة التفاعل بين أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في الأنسجة.
هناك بعض الخطوات الهامة التي تتطلب المزيد من الاهتمام عند تنفيذ البروتوكول. نظرا للاحتياجات الغذائية من الخلايا الفلكية, وNM المستخدمة للحصول على الثقافات العصبية-غليا ينبغي أن تستكمل مع 10% من عوامل النمو التي تحتوي على HI-FBS, الأحماض الأمينية والأحماض الدهنية. هذا المكمل هو ما يميز ثقافة الخلايا العصبية-غليا من الثقافة المخصب بالخلايا العصبية. لإعداد ثقافة استرويتي المخصب وسيلة خالية من المكملات الغذائية اللازمة لنمو الخلايا العصبية, مثل B27, ينبغي أن تستخدم. في البروتوكول الحالي، كانت واسطة الانتخاب للثقافة الثرية في علم الدراجات الفلكية هي MEM. ومن المهم جدا أيضا أن يتم ضمان احتياجات أنواع الخلايا المختلفة عندما يتم الاتصال بها. لهذا الغرض، يمكن استخدام وسيلة ثقافية متوافقة مع كل من الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، أي NBM تكملها B27 و HI-FBS. فيما يتعلق ببروتوكول OGD، فإن الخطوات الأساسية هي إزالة جميع الـ O2 من الغرفة قبل بدء فترة OGD، والغسيل السليم للخلايا مع HBSS بدون جلوكوز، من أجل القضاء على جميع الجلوكوز الموجود في الوسط.
في الختام، هنا نقدم نموذجا في المختبر لدراسة السكتة الدماغية الإقفاري المنشأة بطريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة وقابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك، الطريقة الموصوفة تسمح أيضا لتنفيذ العصبية و الثقافات الأساسية المخصبة الخلايا الفلكية ولكن أيضا الثقافات العصبية-غليا، وبالتالي توفير نموذج كبير في المختبر لنمذجة العديد من أمراض الدماغ، مع مستوى أعلى من التعقيد من خطوط الخلايا الخالدة والخلايا العصبية النقية أو الثقافات الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس هناك تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي الذي قدمته Fundação para a Ciência e a Tecnologia من خلال المشاريع UIDB/00709/2020 و POCI-01-0145-FEDER-029311 والزمالة SFRH/BD/135936/2018 إلى JP، بواسطة ''Programa Operacional do Centro، Centro 2020" من خلال مشروع CENTRO-01-0145-FEDER-000013 والتمويل إلى منصة PPBI البرتغالية ل BioImaging من خلال مشروع POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
