Summary
在这里，我们提出了一个简单的方法，使用特定的培养媒体，允许建立神经元和星细胞丰富的区域性，或神经元胶质培养物从胚胎皮层，具有高产量和可重复性。
Abstract
缺血性中风是一种临床疾病，其特征是脑组织灌注过低，导致缺氧和葡萄糖剥夺，并随之导致神经元丧失。许多证据表明，胶质细胞和神经元细胞之间的相互作用在缺血事件后产生有益的作用。因此，要探索潜在的保护机制，开发模型，允许在缺血环境中研究神经元-胶质相互作用是重要的。在这里，我们提出了一个简单的方法，从大鼠胚胎皮层分离星形细胞和神经元，通过使用特定的培养媒体，允许建立神经元或星细胞富培养物或神经元胶质培养物具有高产量和可重复性。
为了研究星核细胞和神经元之间的串扰，我们提出了一种基于共培养系统的方法，其中在盖玻片中培养的神经元与多孔板中镀在一体的单层星细胞保持接触。这两种文化由小石蜡球保持分离。这种方法允许对每种细胞类型进行独立操作和应用特定的治疗，这在许多研究中代表着优势。
为了模拟缺血性中风期间发生的情况，培养物受到缺氧和葡萄糖剥夺协议。该协议是研究神经元-胶质相互作用在缺血性中风中的作用的有用工具。
Introduction
根据世界卫生组织的数据，每年约有550万人死于缺血性中风。这种情况的特点是血液流向某一大脑区域中断，导致组织氧气和营养物质供应的可逆或不可逆损失，从而改变组织功能，导致线粒体功能障碍、钙失调、谷氨酸兴奋、炎症和细胞损失2，3。,3
除了血管细胞，神经元和胶质细胞也参与缺血性中风的病理生理学。特别是，星形细胞对神经元的维持至关重要，最近被证明对缺血性病变5的反应起着关键作用。这种类型的胶质细胞执行结构支持、抗氧化应激、神经递质合成、细胞细胞通信稳定等功能。与神经元一起，星形细胞在突触传递中起直接作用，调节三磷酸腺苷、伽马-氨基丁酸和谷氨酸7等分子的释放。缺血引起的部分损伤是由谷氨酸的过度释放及其在突触裂口的积累引起的，导致N-甲基-D-阿斯巴酸受体的过度激活，激活下游信号级联，最终导致兴奋8。由于星母细胞能够从突触裂口中去除谷氨酸并将其转化为谷氨酰胺，因此它们对于抵御兴奋性至关重要，从而对缺血产生神经保护作用。这些细胞在缺血引起的神经炎中也起着一定的作用。在缺血性侮辱之后，活性星形细胞发生形态变化（肥大），增殖，并表现出胶质纤维酸蛋白（GFAP）表达的增加。它们可以变成反应性（星体炎），释放亲炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α，白细胞素-1+和白细胞素-1+，并产生自由基，包括一氧化氮和超氧化物，这反过来又可以诱发神经元死亡9，10。9,相比之下，反应性星形细胞也可能起到神经保护作用，因为它们释放抗炎细胞因子，如改变生长因子-β，即中风11后上升调节。此外，它们可以产生胶质疤痕，通过抑制轴芽来限制组织再生;然而，这种胶质疤痕可以分离损伤点与可行的组织，从而防止一个级联波不受控制的组织损伤12，13。1312
因此，必须建立模型，允许研究缺血性损伤下的神经元-胶质相互作用，以找到治疗策略，限制或扭转缺血损伤的影响。与其他用于研究缺血性损伤的模型相比，in vivo,,即体内模型14、15、16、15有机细胞培养17、18、19,18,19和急性脑片1620、21、22，原细胞培养物较不复杂，这使得研究各细胞型在缺血性中风病理生理学中对个体贡献以及每种细胞类型对治疗可能靶点的反应成为可能。20,2122通常，为了研究神经元富集培养物与星细胞富集培养物之间的相互作用，使用产后起源的神经元和胶质细胞23、24,或产后胶质细胞和胚胎神经元25、26。25,26本文提出了一个简单的方法来建立神经元或星细胞富培养物和神经元胶质培养物从同一组织。这些原发性细胞是从大鼠胚胎皮层获得，这个区域经常受到中风27，28,的影响。此外，组织分离只能通过机械程序执行。因此，该协议允许以快速和廉价的方式，以高性能和可重复性的方式，在相同的开发阶段隔离细胞。
可以使用一个共培养系统来探索星母细胞和神经元之间的串扰，在这个系统中，在盖玻片中培养的神经元与多孔板中种子的星细胞的单层保持接触。小石蜡球可用于确保两个细胞培养物的分离。此方法允许在每个单元类型接触之前独立操作它们。例如，可以沉默星形细胞中的特定基因，看看它如何影响神经元脆弱或防止缺血引起的损伤。在体外诱导缺血样条件的方法是氧气和葡萄糖剥夺（OGD）3，它包括3用缺氧大气（95%的空气和5%的CO2）取代常规大气（95%N2和5%CO2），与葡萄糖的遗漏有关。2
所述方法适合以简单、快速、可重复和廉价的方式研究缺血性中风背景下神经元和星形细胞之间的相互作用。
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Protocol
所有使用的动物都是按照国家动物研究伦理要求和《欧洲用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护公约》（第2010/63/EU号指令）在CICS-UBI健康科学研究中心饲养的。
1. 大鼠胚胎皮层原细胞培养
- 培养媒介
- 通过添加以下补充剂来准备神经基础介质 （NBM）： 2% B27， 0.5 mM 谷氨酰胺， 25 μM 谷氨酸和 120 μg/mL 根霉素.均质化，将pH值调整为7.2，并使用0.22 μm过滤器用真空过滤步骤对介质进行消毒。对于神经元-胶质细胞培养，补充NBM细胞培养培养素与10%的热灭活胎儿牛血清（HI-FBS）。
- 准备最低基本中鹰（MEM）介质与以下补充剂：碳酸氢钠2.2克/升，胰岛素从牛胰5毫克/升，D-葡萄糖无水3.4克/升，青霉素（12U/mL）/链霉素（12微克/mL）和10%HI-FBS。均质化，将 pH 调整为 7.2，然后通过过滤步骤对介质进行消毒。
- 材料和设备的准备
- 从一侧穿刺 1 mL 塑料微管尖端的端子部分，使用特定直径的针头（0.5 mm 表示 S;0.6 mm 表示 M;0.8 mm 表示 L），并使用火焰密封尖端的开口。
- 消毒所有的玻璃器皿。在整个解剖过程中，将使用的工具（如剪刀、钳子、手术刀）浸入 70% 乙醇中。在进入层流室之前，先用 70% 乙醇喷洒材料。
- 将水浴温度设置为 37 °C，并在开始手术前将细胞培养基放在水浴中。
注：对于免疫细胞化学测定，应在含有盖玻片的多孔板中进行聚-D-Lysine涂层。
- 鼠胚胎皮层培养
- 从雌性威斯塔大鼠身上取出大鼠胚胎，妊娠期为15-16天（交配结束，应持续24小时，被认为是胚胎发育 的第1天）。为此，用氯胺酮（87.5毫克/千克）和西拉辛（12毫克/千克）麻醉雌性，并切除胚胎。然后按照标准程序，通过宫颈错位对雌性大鼠实施安乐死。
- 将胚胎放在50mL无菌管中，加入磷酸盐缓冲盐水（PBS），直到它覆盖胚胎，并迅速将它们带至培养室。
- 还在蛋黄囊内，将胚胎放在含有25mL冷PBS的培养皿中。在剪刀和钳子的帮助下，打破蛋黄囊，取出胚胎，并将其转移到另一个含有冷PBS的培养皿中。培养皿中的 PBS 应该足以覆盖整个胚胎。
注：打开蛋黄囊时要小心，以免损坏胚胎。在 1.3.3 和 1.3.4 中，我们使用直径为 90 mm 的 Petri 盘放在覆盖着吸水纸的冰袋顶部，以保持 PBS 的低温。 - 为了解剖胚胎，将其转移到另一个含有30mL冷PBS的培养皿中。将胚胎放在解剖显微镜下，用钳子固定。使最初的切口平行于皮层，从眼腔到枪口的末尾，小心不要斩首动物。
- 小心地取出头皮和脑筋，不要损坏皮质脑组织。做下一个切口来分离皮层。使用巴氏移液器将皮质组织转移到含有 5 mL PBS 的 15 mL 管中。
- 使用 1.2.1 中准备的 1 mL 塑料尖端对皮质脑组织进行机械消化。使用常规移液器三重奏 10 次，并使用带逐渐变小孔（L、M 和 S）的移液器重复该过程，直到块已分崩离析。
- 机械消化后，在400 x g下离 心3 分钟。丢弃上流剂，用先前在37°C加热的适当细胞培养基重新悬浮沉积物。
- 使用 Neubauer 腔室确定细胞悬浮液（细胞密度）中存在的细胞总数，进行适当的稀释并镀板细胞。初始细胞密度是根据先前的研究5定义的。
- 对于神经元丰富的培养，使用0.21 x 106细胞 /厘米2 作为初始细胞密度，并在没有HI-FBS的NBM培养培养中维持细胞。
- 对于神经元胶质培养使用0.14 x 106 细胞/厘米2 作为初始细胞密度，并保持在NBM培养培养培养的细胞辅以10%HI-FBS。
- 对于富含星细胞的培养，使用0.26 x 106细胞 /cm2 作为初始细胞密度，并维持 MEM 中的细胞，如前所述。
- 将细胞放在37°C、95%O2 和5%CO2的培养箱中。
注：对于较长的培养期，应添加抗位菌，如27μM 5-氟-2-脱氧核糖核酸和68μM尿素，以抑制细胞生长。
2. 共同文化系统
- 材料准备
- 在加热块中加热石蜡 150°C 约 7 分钟。保持150°C，直到完成程序。然后，借助直径为 1 mm 的无菌玻璃巴斯德移液器，在消毒和 PDL 涂层盖玻片上添加一小滴。石蜡球是不规则的，但它们的直径约为2毫米。球体将允许两个区域性分离约1.25毫米。
- 由于石蜡不是无菌的，因此将多井与石蜡球放在紫外线辐射下15分钟。
- 为了建立共培养物，使用以前浸入70%乙醇的钳子将盖玻片与石蜡球球转移15分钟。
- 共同文化
- 当这两种培养物准备好使用时（即，在步骤1.3.8所述条件下培养7天后），将带石蜡球的盖玻片中播种的神经元转移到含有星形细胞的孔中。
- 在两种培养物接触前24小时，根据实验的目的，将神经元和星细胞的培养培养培养本更改为NBM补充或不与HI-FBS。
- 将两种细胞类型置于接触中后，等待 8-12 小时，然后开始不同的刺激和过程。
注：图1显示了共培养系统的示意 图。
3. 缺氧和葡萄糖
- 文化媒介准备
- 对于 OGD 实验，请使用汉克的平衡盐溶液 （HBSS）。准备HSS介质与以下试剂： 1.26 mM CaCl2，5.36 mM KCl， 0.44 mM KH2PO4，0.49 mM MgCl2， 139.9 mM NaCl， 4.17 mM NaHCO3， 3.38 mM NaHPO4.均质并调整pH到7.2。通过过滤对介质进行消毒。
注：如果合适，通过加入5.56 mM葡萄糖，补充HSSS溶液和葡萄糖（HBSSGLU+）。对于提交给OGD的培养物，不补充HSSS培养基葡萄糖（HBSSglu-）。
- 对于 OGD 实验，请使用汉克的平衡盐溶液 （HBSS）。准备HSS介质与以下试剂： 1.26 mM CaCl2，5.36 mM KCl， 0.44 mM KH2PO4，0.49 mM MgCl2， 139.9 mM NaCl， 4.17 mM NaHCO3， 3.38 mM NaHPO4.均质并调整pH到7.2。通过过滤对介质进行消毒。
- OGD 程序
- 播种细胞后7天，取出培养基，用HSSGLU-洗涤两次。洗涤后加入HSSGLU细胞培养基，将多井放在缺氧室中。
- 密封缺氧室，加入含有 95% N 2 /5% CO2的气体混合物4 分钟，流量为 20 L/min，以去除腔室内的氧气。在此之后，停止流动，将缺氧室放在37°C的培养箱中4小时或6小时，具体取决于预期缺血的程度。
- 在 OGD 期后，将 HBSSglu 培养基替换为适当的培养基，以用于其余程序。
注：OGD 实验旨在模拟 细胞 在缺血事件期间遭受的体外条件，因此必须证明以前使用的所有介质都已移除。
4. 免疫细胞化学测定
注：执行免疫细胞化学测定，如前所述5。
- 简言之，为了描述不同的皮质培养物，用兔子抗GFAP（1：2000）和小鼠抗微管相关蛋白2（MAP2;1：500）在4°C孵育细胞过夜;然后在室温下1小时与以下二次抗体：抗兔结合亚历克萨氟尔546和抗小鼠结合到亚历克萨氟488，均在1：1000稀释。
- 在室温下，用2μM Hoechst 33342对细胞核进行孵育，10分钟。
- 在荧光安装介质中安装盖玻片，并在荧光显微镜上以 63 倍的放大倍率获取图像。
5. 统计分析
- 以细胞总数的百分比或对照百分比表示数据，并按至少 ± 3 个独立实验的均值 （SEM） 的均值 （SEM） 的均值 （SEM） 表示。
- 使用软件（GraphPad 软件公司，加利福尼亚州圣地亚哥）使用未配对的学生 t 测试 执行统计分析 。当值 p < 0.05 时，结果被认为很重要。
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Representative Results
为了描述培养物的特征，免疫细胞化学评估表达GFAP或 MAP2的细胞数量，广泛使用的星形细胞和神经元的标记物（图2），在每种类型的皮质培养物中执行。这一分析显示，富含星细胞的培养物呈现了97%的表达GFAP的细胞（图2A）。关于神经元富集培养，78%的细胞表示 MAP2，4% 的细胞表示 GFAP，18% 的细胞同时表示 GFAP 和 MAP2 阴性（图 2B）。关于神经元-胶质皮质培养，49%的细胞为 MAP2 阳性，31% 的 GFAP 阳性，20% 的细胞对两个标记呈阴性（图 2C）。
在建立皮质培养七天后，神经元-胶质培养和神经元富集培养接受OGD手术，为期4小时或6小时。在这个程序之后，通过免疫细胞化学评估 MAP2 和 GFAP 阳性细胞的数量。在神经元胶质培养中，OGD 4小时和6小时后，MAP2阳性细胞损失分别为30%和60%（图3B），而OGD4小时和6小时后，GFAP阳性细胞的损耗为9%和17%（图3C）。关于神经元富集培养，在OGD的4小时和6小时之后，MAP2阳性细胞的数量分别减少了41%和64%（图3A）。此外，在神经元富集培养中，与神经元胶质培养相比，OGD 4小时引起的损伤延长略有增加（图3A）。
图1：共培养系统的示意图。
（A） 星形细胞在含有PDL涂层盖玻片的多井中播种，神经元在含有3个石蜡球的多井中播种。（B） 当两种培养物准备好使用时，带球体的盖玻片中的神经元被转移到含有星形细胞的井中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：神经元-胶质皮质培养、神经元富皮质培养和星细胞富皮质培养的特征。
神经元（MAP2阳性细胞）的百分比，星细胞（GFAP阳性细胞）的百分比，以及双阴性细胞（MAP2阴性/GFAP-阴性细胞）百分比，在培养（A）星细胞富文化（B）神经元富集培养和（C）神经元-胶质培养和代表性图像显示CMAP2（绿色）和GFAP（红色）的免疫维持。通过量化 Hoechst 33342 标记的核与非 pyknotic 形态（蓝色）来评估细胞总数。由于富含星细胞的皮质培养中神经元数量较低，代表性图像不显示 MAP2 阳性染色。数据以3个独立实验±（A）和6个独立实验（B、C）的均值显示。图像以 63 倍的目标获得。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：OGD周期后神经元损失的评估。
（A ， B）神经元-胶质培养和神经元富集培养中的神经元/场（MAP2阳性细胞）数量和（C）编号星细胞/场（GFAP阳性细胞）和在神经元胶质培养物中具有代表性的 MAP2（绿色）和GFAP（红色）免疫保持。通过量化 Hoechst 33342 标记的核与非 pyknotic 形态（蓝色）来评估细胞总数。神经元胶质和神经元富集培养物被提交给缺氧和葡萄糖（OGD），时间为4小时和6小时。数据作为在三±中至少进行3项独立实验的SEM的均值显示。通过量化 Hoechst 33342 标记的核评估细胞总数。**p < 0.01， ***p < 0.001 和 ***p < 0.0001 与 OGD 0 h（未配对的学生 t 测试） 相比，请单击此处查看此数字 的较大版本。
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Discussion
这里描述的方法包括从大鼠胚胎皮质组织分离星细胞和神经元，允许建立神经元或星细胞富培养物或神经元胶质培养。它改编自我们小组5的先前研究，其中皮质神经元和神经元丰富的胚胎培养物分离被描述，并描述两种培养物的特点。利用这些培养物，Roque等人发现星形细胞在应对缺血性损伤方面起着关键作用，并表明星形细胞和神经元之间的交流对神经保护5至关重要。在目前的协议中，除了制备神经元和神经元丰富的培养物外，我们还能够获得富星细胞丰富的培养物，这使我们能够研究缺血环境对分离或分离或结合的神经元和星形细胞的影响。
对免疫细胞化学数据的分析表明，神经元富集培养物中的18%和神经元胶质培养物中的20%对 MAP2 和 GFAP 均呈阴性。这些细胞呈现具有非皮克诺蒂形态的核。鉴于培养物是由胚胎组织培养的，部分细胞可能尚未表达神经元标记，需要进一步成熟。这与先前的研究表明，MAP2表达随着神经元成熟度的增加而增加，MAP2阳性细胞的数量随着培养时间的增加和胚胎在解剖时29、30,岁时的胚胎年龄而增加。我们之前已经证明，在神经元胶质培养中，只有0.7%的细胞对微胶质标记电离钙结合适配器分子15呈阳性。虽然神经元-胶质培养中使用的培养培养媒介具有胶质细胞生长所需的营养支持，但胚胎皮层中15-16天的微胶质量减少，随着培养时间缩短，这种细胞类型的生长是有限的。这同样适用于神经元丰富的培养物，但在这种情况下，胶质细胞的生长更加有限，因为培养培养媒介中缺乏HI-FBS。
除了允许从相同的准备中获得不同类型的区域性之外，此处描述的协议还有其他优点。单细胞悬浮液只是通过机械消化获得的，不像其他同时使用酶和机械消化的方法24、25、31、32;24,25,31,32因此，它更快，更便宜。另一个优点是，该协议也可用于准备来自其他大脑区域的细胞，如海马或中脑，允许研究影响大脑不同区域的病理学。此外，所述的替代程序允许建立共培养物，允许通过使用免疫细胞化学等方法分析联合培养物中特定细胞类型中发生的生化和形态变化。建立共培养物的一个常见模式是跨井系统24、25、33、34。24,25,33,34与使用小空间（如石蜡球）的共培养系统的情况相反，转井共培养模型不允许对共培养中的两种细胞类型进行免疫细胞化学。此外，使用石蜡球等空间器的共同培养简单且成本低。
将神经元富集或神经元胶质培养物接受OGD是缺血症常见的体外in vitro模型，尽管如此，还使用了其他体外方法，in vitro即化学和酶方法，即谷氨酸3，35,35诱导兴奋。与其他方法相比，OGD允许模拟缺血性中风期间发生的两个阶段，即缺氧和葡萄糖的剥夺和再灌注，这是一个优势，因为它模仿体内发生的情况。此外，虽然化学和酶方法可能有用，因为它的快速反应和易于应用，有一个问题与体内病理状态的相关性，因为化学缺氧导致更多的自由基生成比厌氧，超过所观察到的in vivo体内35。关于OGD协议，我们观察到它会导致神经元损失，病变的延伸可以通过改变OGD周期的持续时间来调整，以达到实验要求。在神经元富集培养物和神经元胶质培养物的OGD期后神经元损失观察到的差异可能是由于星细胞所起的保护作用，从而衰减神经元死亡。
不出所料，与神经元相比，4小时和6小时中，OGD对星细胞在神经胶质培养中的损伤较低。星细胞对OGD的抗性较高，归因于多个方面。在缺血期间，他们能够比神经元保持ATP水平更长的时间，严重的离子失调进展缓慢36：首先因为神经元具有更高的离子通道密度，因此对维持离子梯度的能量需求更大;其次，因为大脑中大多数糖原储存物都存在于星核细胞36中。此外，星核细胞表达的离子谷氨酸受体水平低于神经元，并具有更好的离子缓冲和抗氧化能力36。这些属性大概是众所周知的神经元在星细胞36上选择性丧失的根据。
关于此处提议的协议的限制，最重要的是，它基于一个体外模型，该模型缺乏体内系统中发生的相互作用的复杂性，这可导致体内情况的可翻译性问题。然而，它提出了与细胞培养相关的优势，即简单性、易于操作性、提供特定细胞群体如何回应某种侮辱的基本详细信息的能力。与体内模型不同，体外疾病模型的维护成本更低，成本更低。更具体地说，对于缺血性中风的建模，体外模型in vitro还具有与体内替代品34相比更容易控制葡萄糖和氧气水平的优点。此外，我们还建议使用共培养物，这可以给更高的复杂性，允许研究不同细胞类型之间的相互作用存在于组织。
执行协议时，有一些关键步骤需要进一步注意。由于星细胞的营养需求，用于获得神经元胶质培养物的NBM应补充10%的HI-FBS含量生长因子、氨基酸和脂肪酸。这种补充是神经元-胶质培养与神经元丰富培养的区分。为了准备一个富含星细胞的培养，应使用缺乏神经元生长所需的补充剂的媒介，如B27。在目前的议定书中，对富含星细胞的区域性的选集是M MEM。同样重要的是，当不同细胞类型被接触时，确保它们的需求。为此，可以使用一种与星母细胞和神经元相容的培养基，即与B27和HI-FBS相辅的NBM。关于OGD协议，主要的关键步骤是，在开始OGD期之前从腔室中去除所有O 2， 用没有葡萄糖的HSS进行适当的清洗，以消除介质中存在的所有葡萄糖。
最后，我们在此提出一 个体外模型 ，以研究以简单、快速、廉价和可重复的方式建立的缺血性中风。此外，所述方法还允许实现神经元和星细胞丰富的初级培养物，但也实现神经元-胶质培养，从而为模拟 几种脑部 疾病提供了一个很好的体外模型，其复杂程度高于不朽的细胞系和纯神经元或胶质培养。
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Disclosures
提交人声明，他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢通过UIDB/00709/2020项目、POCI-01-0145-FEDER-029311和研究金SFRH/BD/135936/2018向JP提供的资金支持， 通过"2020年中分部"项目 CENTRO-01-0145-FEDER-000013，并通过项目 POCI-01-01-0145-FEDER-022122 向PPBI-葡萄牙生物成像平台提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
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