Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En cellekultur model for at studere den rolle, Neuron-Glia interaktioner i Iskæmi

doi: 10.3791/61388 Published: November 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en enkel tilgang ved hjælp af specifikke kulturmedier, der gør det muligt at etablere neuron- og astrocytberigede kulturer eller neurongliakulturer fra embryonale cortex, med højt udbytte og reproducerbarhed.

Abstract

Iskæmisk slagtilfælde er en klinisk tilstand karakteriseret ved hypoperfusion af hjernevæv, fører til ilt og glukose afsavn, og den deraf følgende neuronal tab. Talrige beviser tyder på, at samspillet mellem glia og neuronal celler udøve gavnlige virkninger efter en iskæmisk begivenhed. Derfor, at udforske potentielle beskyttende mekanismer, Er det vigtigt at udvikle modeller, der tillader at studere neuron-glia interaktioner i et iskæmisk miljø. Heri præsenterer vi en enkel tilgang til at isolere astrocytter og neuroner fra rotte embryonale cortex, og at ved hjælp af specifikke kultur medier, giver mulighed for etablering af neuron- eller astrocyt-beriget kulturer eller neuron-glia kulturer med højt udbytte og reproducerbarhed.

For at studere krydstale mellem astrocytter og neuroner, foreslår vi en tilgang baseret på en co-kultur system, hvor neuroner dyrket i coverslips opretholdes i kontakt med en monolayer af astrocytter belagt i multiwell plader. De to kulturer bevares af små paraffinsfærer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for uafhængig manipulation og anvendelse af specifikke behandlinger til hver celletype, hvilket udgør en fordel i mange undersøgelser.

For at simulere, hvad der sker under en iskæmisk slagtilfælde, er kulturerne udsat for en ilt og glukose afsavn protokol. Denne protokol repræsenterer et nyttigt værktøj til at studere den rolle, neuron-glia interaktioner i iskæmisk slagtilfælde.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ifølge data fra Verdenssundhedsorganisationen, omkring 5,5 millioner mennesker dør hvert år fra iskæmisk slagtilfælde1. Denne betingelse er karakteriseret ved afbrydelse af blodgennemstrømningen til en bestemt hjerne region, hvilket resulterer i en reversibel eller irreversibel tab i udbuddet af ilt og næringsstoffer til vævet, som ændrer vævsfunktion og fører til mitokondriel dysfunktion, calcium dysregulation, glutamat excitotoxicity, betændelse og celletab2,3.

Bortset fra vaskulære celler, neuronal og gliaceller er involveret i patofysiologi af iskæmiskslagtilfælde 4. Især astrocytter er afgørende for vedligeholdelsen af neuroner og for nylig blev vist sig at spille en afgørende rolle i reaktionen på den iskæmiske læsion5. Denne type gliacelle udfører funktioner af strukturel støtte, forsvar mod oxidativstress, syntese af neurotransmittere, stabilisering af celle-celle kommunikation, blandt andre6. Sammen med neuroner, astrocytter spiller en direkte rolle i synaptisk transmission, regulerer frigivelsen af molekyler såsom adenosin tripfosfat, gamma-aminosmørsyre og glutamat7. En del af den skade, der forårsages af iskæmi er forårsaget af overdreven frigivelse af glutamat og dens akkumulering på synaptic kløft, fører til overaktivering af N-methyl-D-aspartat receptorer, aktivering downstream signalering kaskader, i sidste ende resulterer i excitotoxicity8. Da astrocytter er i stand til at fjerne glutamat fra den synaptiske kløft og omdanne det til glutamin, de er afgørende for at forsvare sig mod excitotoxicity, og dermed udøve en neuroprotektive virkning på iskæmi. Disse celler spiller også en rolle i iskæmi-induceret neuroinflammation. Efter den iskæmiske fornærmelse, aktiverede astrocytter gennemgå morfologiske ændringer (hypertrofi), formere sig, og viser en stigning i glia fibrillary sure protein (GFAP) udtryk. De kan blive reaktive (astrogliose), frigive pro-inflammatoriske cytokiner såsom tumor nekrose faktor-α, interleukin-1α og interleukin-1β, og producerer frie radikaler, herunder nitrogenoxid og superoxid, som igen kan fremkalde neuronal død9,10. I modsætning hertil kan reaktive astrocytter også spille en neuroprotektive effekt, da de frigiver anti-inflammatoriske cytokiner, såsom at omdanne vækstfaktor-β, der er upregulated efter slagtilfælde11. Desuden kan de generere et glia ar, som kan begrænse væv regenerering ved at hæmme axonal spiring; dette glia-ar kan dog isolere skadesstedet fra levedygtigt væv og dermed forhindre en kaskadebølge af ukontrolleret vævsskade12,13.

Således er det bydende nødvendigt at etablere modeller, der tillader at studere neuron-glia interaktioner under en iskæmisk skade for at finde terapeutiske strategier, der begrænser eller vende virkningerne af iskæmisk skade. Sammenlignet med andremodeller,der anvendes til at studere iskæmisk skade, nemlig in vivo modeller14,15,16, organotypic kulturer17,18,19 ogakut hjerne skiver20,21,22, primære cellekulturer er mindre komplekse, hvilket gør det muligt at undersøge individuelle bidrag af hver celletype i den iskæmiske slagtilfældes patofysiologi, og hvordan hver type celle reagerer på terapeutiske mulige mål. Typisk, for at studere samspillet mellem neuron-beriget kulturer og astrocyt-beriget kulturer, neuroner og gliaceller af postnatal oprindelse anvendes23,,24, eller postnatal gliaceller og embryonale neuroner25,26. Heri foreslås en enkel tilgang til at etablere neuron- eller astrocyt-beriget kulturer og neuron-glia kulturer fra samme væv. Disse primære celler er fremstillet af rotte embryonale cortex, en region ofte påvirket afslagtilfælde 27,28. Desuden foretages dissociationen af vævet kun ved en mekanisk procedure. Derfor giver denne protokol mulighed for at isolere celler i samme udviklingsfase, på en hurtig og billig måde og med høj ydeevne og reproducerbarhed.

Krydstale mellem astrocytter og neuroner kan udforskes ved hjælp af en co-kultur system, hvor neuroner dyrket i coverslips opretholdes i kontakt med en monolayer af astrocytter seedet i multiwell plader. Små paraffinkugler kan bruges til at sikre adskillelsen af de to cellekulturer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for uafhængig manipulation af hver celletype, før de bringes i kontakt. For eksempel er det muligt at lukke munden på et bestemt gen i astrocytter og se, hvordan det kan påvirke den neuronale sårbarhed eller beskyttelse mod iskæmisk-induceret skade. En etableret metode til at fremkalde iskæmisk-lignende forhold in vitro er ilt og glukosemangel (OGD)3, som består i at erstatte den regelmæssige atmosfære (95% luft og 5% CO2)med en anoxisk atmosfære (95% N2 og 5% CO2), forbundet med udeladelse af glukose.

Den beskrevne metode er egnet til at studere samspillet mellem neuroner og astrocytter i forbindelse med iskæmisk slagtilfælde, på en enkel, hurtig, reproducerbar og billig måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle anvendte dyr er opdrættet på CICS-UBI Health Science Research Centre i overensstemmelse med de nationale etiske krav til dyreforskning og med den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (direktiv 2010/63/EU).

1. Rotte embryo cortex primære cellekultur

  1. Kultur medium forberedelse
    1. Neurobasal Medium (NBM) klargøres ved at tilsætte følgende kosttilskud: 2% B27, 0,5 mM glutamin, 25 μM glutamat og 120 μg/ml gentamicin. Homogeniser, juster pH-automaten til 7,2, og mediet steriliseres med et vakuumfiltreringstrin ved hjælp af et 0,22 μm filter. For neuron-glia cellekultur, supplere NBM cellekultur medium med 10% af varme-inaktiveret føtal kvæg Serum (HI-FBS).
    2. Der klargør minimumsfattige mediumørn (MEM) med følgende tilskud: natriumhydrærcarbonat 2,2 g/l, insulin fra kvæg pancreas 5 mg/L, D-glucose vandhydrøs 3,4 g/l, penicillin (12 U/ml) /streptomycin (12 μg/ml) og 10% HI-FBS. Homogeniser, juster pH-3 til 7,2, og mediet steriliseres med et filtreringstrin.
  2. Klargøring af materialer og udstyr
    1. Punkter den terminaldel af en 1 ml mikropipettespids af plast fra side til side med en nål med en specifik diameter (0,5 mm for S; 0,6 mm for M; 0,8 mm for L) og forsegle spidsens åbning med en flamme.
    2. Steriliser alt glasvarer. Hold under hele dissektionen de anvendte værktøjer (f.eks. saks, pincet, skalpel) nedsænket i 70% ethanol. Spray materialerne med 70% ethanol, før de kommer ind i laminar flow kammer.
    3. Indstil vandbadets temperatur til 37 °C, og anse cellekulturmediet i vandbadet, før proceduren påbegyndes.
      BEMÆRK: For immunokytokemianalyser skal poly-D-lysinbelægning udføres i fleropgangsplader, der indeholder dækselslip.
  3. Rotte embryonale cortex kultur
    1. Fjern rotteembryonerne fra en hun-Wistar-rotte med 15-16 dages drægtighed (slutningen af parringen, som skal vare 24 timer, betragtes som1. dag i fosterudviklingen). Til dette formål bedøves hunnen med ketamin (87,5 mg/kg) og xylazin (12 mg/kg), og embryonerne fjernes. Derefter aflive den kvindelige rotte ved cervikal dislokation, efter standard protokol.
    2. Anlæt embryonerne anbringes i et 50 ml sterilt rør, tilsættes fosfatbufferalal (PBS), indtil det dækker embryonerne, og før dem hurtigt med til kulturrummet.
    3. Stadig inde i æggeblomme sæk, placere embryoner i en petriskål, der indeholder 25 ml koldt PBS. Ved hjælp af saks og pincet, bryde æggeblomme sæk, fjerne fosteret og overføre det til en anden petriskål, der også indeholder koldt PBS. PBS i petriskålen skal være nok til at dække hele fosteret.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du åbner blommesækken for at undgå at beskadige fosteret. I 1.3.3 og 1.3.4 brugte vi 90 mm petriskåle, der var placeret oven på isposer dækket med absorberende papir for at holde PBS ved lav temperatur.
    4. Ved dissektion af embryonet overføres det til en anden petriskål, der indeholder 30 ml kold PBS. Anlækningsemne under et dissekerende mikroskop og immobiliser det med en pincet. Gør det første snit parallelt med cortex, går fra det okulære hulrum til slutningen af næsepartiet og pas på ikke at halshugge dyret.
    5. Fjern forsigtigt hovedbunden og meninges ved hjælp af pincet, for ikke at beskadige det kortikale hjernevæv. Gør det næste snit til at adskille cortex. Det kortikale væv overføres til et 15 ml rør, der indeholder 5 ml PBS ved hjælp af en Pasteur-pipette.
    6. Udfør den mekaniske fordøjelse af det kortikale hjernevæv ved hjælp af de 1 ml plastspidser, der er fremstillet i 1.2.1. Triturate 10 gange med en regelmæssig pipette og gentag processen ved hjælp af pipetter med gradvist mindre huller (L, M og S), indtil stykkerne er faldet fra hinanden.
    7. Efter den mekaniske fordøjelse centrifugeres suspensionen ved 400 x g i 3 min. Supernatanten kasseres, og sedimentet skal opspørliges med det relevante cellekulturmedium, der tidligere er opvarmet ved 37 °C.
    8. Det samlede antal celler, der findes i cellesuspensionen (celletætheden), bestemmes ved hjælp af et Neubauer-kammer, og cellerne foretages med passende fortyndinger. Den oprindelige celletæthed blev defineret på grundlag af en tidligere undersøgelse5.
      1. For en neuron-beriget kultur, bruge 0,21 x 106 celler / cm2 som den oprindelige celletæthed og vedligeholde cellerne i NBM kultur medium uden HI-FBS.
      2. For neuron-glia kulturer bruge 0,14 x 106 celler/cm2 som den oprindelige celletæthed og vedligeholde cellerne i NBM kultur medium suppleret med 10% HI-FBS.
      3. For en astrocytberiget kultur skal du bruge 0,26 x 106 celler/cm2 som den oprindelige celletæthed og vedligeholde cellerne i MEM suppleret som tidligere angivet.
      4. Cellerne hældes i en inkubator, der er indstillet til 37 °C, 95% O2 og 5% CO2.
        BEMÆRK: I længere kulturperioder skal der tilsættes en anti-mitotisk anti-mitotisk som 27 μM 5-fluor-2′-deoxyuridin med 68 μM uridin for at undertrykke cellevækst.

2. Co-kultursystem

  1. Fremstilling af materialer
    1. Paraffin ved 150 °C opvarmes i en varmeblok i ca. 7 min. Opbevares ved 150 °C, indtil proceduren er afsluttet. Derefter, ved hjælp af en 1 mm diameter sterilt glas Pasteur pipette, tilsæt en lille dråbe over steriliserede og PDL-belagte dækslæber. Paraffinkuglerne er uregelmæssige, men de har en diameter på ca. 2 mm. Kuglerne vil gøre det muligt for de to kulturer at blive adskilt af ca. 1,25 mm.
    2. Da paraffin ikke er steril, placere multiwell med paraffin kugler under ultraviolet stråling i 15 min.
    3. For at etablere co-kultur, overføre coverslip med paraffin kugler ved hjælp af en pincet tidligere nedsænket i 70% ethanol i 15 min.
  2. Co-kultur
    1. Når de to kulturer er klar til brug (dvs. efter 7 dage i kultur under de betingelser, der er nævnt i trin 1.3.8), overføre neuroner seedet i coverslips med paraffin kugler til brønde, der indeholder astrocytter.
    2. 24 timer før de to kulturer bringes i kontakt, ændre kultur medium af neuroner og astrocytter til NBM suppleret, eller ej, med HI-FBS, afhængigt af formålet med forsøget.
    3. Efter at have placeret begge celletyper i kontakt, skal du vente 8-12 timer, før du starter de forskellige stimuli og procedurer.
      BEMÆRK: Den skematiske repræsentation af samkultursystemet er vist i figur 1.

3. Ilt og glukose afsavn

  1. Kultur Medium Forberedelse
    1. Til OGD-forsøgene skal du bruge Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). HbSS-mediet klargørs med følgende reagenser: 1,26 mM CaCl2,5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2POH4. Homogeniser og juster pH-3 til 7,2. Steriliser mediet ved filtrering.
      BEMÆRK: Hvis det er relevant, supplere HBSS-opløsningen med glukose (HBSSglu+), ved at tilsætte 5,56 mM glukose. For kulturer, der indsendes til OGD, suppleres ikke med HBSS-mediet med glucose (HBSSglu-).
  2. OGD-procedure
    1. 7 dage efter såning af cellerne fjernes kulturmediet og vaskes to gange med HBSSglu-. Efter vask tilsættes HBSSglu- cellekultur medium og placere multiwell i hypoxi kammer.
    2. Hypoxikammeret forsegles og der tilsættes en gasblanding, der indeholder 95% N2/5% CO2 i 4 min. med en strøm på 20 L/min. for at fjerne den ilt, der er til stede inde i kammeret. Derefter standses strømmen, og hypoxikammeret sættes i en inkubator ved 37 °C i 4 timer eller 6 timer, afhængigt af omfanget af den tilsigtede iskæmi.
    3. Efter periode med OGD erstattes HBSSglu-mediet med det relevante kulturmedium til de resterende procedurer.
      BEMÆRK: OGD-eksperimentet har til formål at simulere de in vitro-forhold, som cellerne lider under en iskæmisk hændelse, så det er vigtigt at bekræfte, at alle de medier, der tidligere blev brugt, fjernes.

4. Immunocytokemi assay

BEMÆRK: Immunocytokemianalyse udføres som tidligere beskrevet5.

  1. Kort, at karakterisere de forskellige kortikale kulturer, inkubere cellerne natten over ved 4 °C med kanin anti-GFAP (1:2000) og mus anti-mikrotubule-associeret protein 2 (MAP2; 1:500); og derefter 1 time ved stuetemperatur med følgende sekundære antistoffer: anti-kanin konjugeret til Alexa Fluor 546 og anti-mus konjugeret til Alexa Fluor 488, både på 1:1000 fortynding.
  2. Cellerekerner mærkes ved inkubation med 2 μM Hoechst 33342 i 10 min ved stuetemperatur.
  3. Mount coverslips i fluorescens montering medium og erhverve billeder på en epifluorescens mikroskop med en 63x forstørrelse.

5. Statistisk analyse

  1. Udtrykke data i procent af det samlede antal celler eller som en procentdel af kontrollen og præsenteres som middelværdien ± standardfejl i middelværdien (SEM) for mindst tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer.
  2. Udfør statistisk analyse med software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), ved hjælp af den ubeskyttede Student's t test. Resultaterne blev anset for signifikante, når værdierne p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at karakterisere de kulturer, immunocytokemi at vurdere antallet af celler, der udtrykte GFAP eller MAP2, udbredte markører for astrocytter og neuroner (Figur 2), blev udført i hver type kortikale kultur. Denne analyse viste, at astrocyteberigede kulturer præsenterede 97 % af de celler, der udtrykker GFAP (figur 2A). Med hensyn til neuronberiget kultur udtrykte 78 % af cellerne MAP2, 4 % af cellerne gfap, og 18 % af cellerne var både GFAP og MAP2-negative (Figur 2B). I forhold til den neuron-glia-kortikale kultur var 49 % af cellerne MAP2-positive, 31 % var GFAP-positive, og 20 % var negative for begge markører (Figur 2C).

Syv dage efter etableringen af den kortikale kultur blev neurongliakulturen og den neuronberigede kultur underkastet OGD-proceduren i 4 timer eller 6 timer. Efter denne procedure blev antallet af MAP2- og GFAP-positive celler vurderet ved immunokytokemi. I neuron-glia-kulturen var tabet af MAP2-positive celler henholdsvis 30 % og 60 % efter 4 timer og 6 timer af OGD (figur 3B), mens tabet af GFAP-positive celler var henholdsvis 9 % og 17 % efter 4 timer og 6 timer I OGD (figur 3C). Med hensyn til den neuronberigede kultur var der et fald på henholdsvis 41 % og 64 % i antallet af MAP2-positive celler efter henholdsvis 4 timer og 6 timer i OGD (figur 3A). Desuden var der i den neuronberigede kultur en lille stigning i skadesforlængelsen forårsaget af 4 timer af OGD sammenlignet med neuron-gliakulturen (figur 3A).

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af samkultursystemet.
(A) Astrocytter blev seedet i en multiwell indeholdende PDL-belagt coverslips og neuroner blev seedet i en multiwell med PDL-belagte coverslips indeholdende 3 paraffin kugler. (B) Når de to kulturer var klar til brug, neuroner i coverslips med kuglerne blev overført til brønde, der indeholder astrocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering af neuron-glia kortikat kultur, neuronberiget kortikale kultur og astrocytberiget kortikale kultur.
Procentdel af neuroner (MAP2-positive celler), procentdel af astrocytter (GFAP-positive celler) og procentdel af dobbelt-negative celler (MAP2-negative/GFAP-negative celler) på 7th dag i kultur i (A) astrocyt-beriget kultur (B) neuron-beriget kultur og (C) neuron-glia kultur og repræsentative billeder viser immunostaining for MAP2 (grøn) og GFAP (rød). Det samlede antal celler blev vurderet ved kvantificering af Hoechst 33342-mærkede kerner med ikke- pyknotisk morfologi (blå). På grund af det lave antal neuroner i astrocytberiget kortikale kultur viser det repræsentative billede ikke MAP2-positiv farvning. Dataene præsenteres som middelværdi ± SEM af 3 uafhængige forsøg (A) og 6 uafhængige forsøg (B, C), der udføres i tre eksemplarer. Billeder blev erhvervet med en 63x mål. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af neuronalt tab efter en OGD-periode.
(A, B) Antal neuroner/feltceller (MAP2-positive celler) i en neurongliakultur og neuronberiget kultur og(C)antal astrocytter/felt (GFAP-positive celler) og repræsentativt billede af MAP2 (grøn) og GFAP (rød) immunostaining i en neuron-gliakultur. Det samlede antal celler blev vurderet ved kvantificering af Hoechst 33342-mærkede kerner med ikke- pyknotisk morfologi (blå). De neuron-glia- og neuronberigede kulturer blev underkastet ilt- og glukosemangel (OGD) i en periode på 4 timer og 6 timer. Dataene præsenteres som middelværdi ± SEM af mindst 3 uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer. Det samlede antal celler blev vurderet ved kvantificering af Hoechst 33342-mærkede kerner. **p < 0,01, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001 sammenlignet med t OGD 0 h (ikke-pareret student's t-test) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metoden her består af astrocyt og neuron isolation fra rotte embryonale kortikale væv, så etablering af neuron- eller astrocyt-beriget kulturer eller neuron-glia kulturer. Det blev tilpasset fra en tidligere undersøgelse af voresgruppe 5, hvor den kortikale neuron-glia og neuron-beriget embryonale kulturer isolation blev beskrevet, og de to kulturer karakteriseret. Ved hjælp af disse kulturer, Roque et al. fandt, at astrocytter spiller en central rolle i at reagere på en iskæmisk skade og tyder på, at kommunikationen mellem astrocytter og neuroner er afgørende for neuroprotection5. I denne protokol, ud over fremstilling af neuron-glia og neuron-beriget kulturer, er vi også i stand til at opnå astrocytter-beriget kulturer, som giver os mulighed for at studere effekten af en iskæmisk miljø på neuroner og astrocytter isoleret eller sammen.

En analyse af immunokytokemidata viste, at 18 % af cellerne i den neuronberigede kultur og 20 % i neurongliakulturer var negative for både MAP2 og GFAP. Disse celler præsenterede kerner med ikke-pyknotisk morfologi. Da kulturerne blev fremstillet af embryonalt væv, kan en del af cellerne endnu ikke udtrykke den neuronale markør, der kræver yderligere modning. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at MAP2-udtrykket stiger med neuronal modenhed , og at antallet af MAP2-positive celler steg med tiden i kulturen og med embryonernes alder på dissektionstid29,30. Vi har tidligere vist, at i neuron-glia kultur kun 0,7% af cellerne var positive for den mikrogliale markør ioniseret calcium-bindende adapter molekyle 15. Selv om kulturmediet, der anvendes i neuron-gliakulturer, har den ernæringsmæssige støtte, der er nødvendig for gliacellevækst, reduceres mængden af mikroglia i embryonbarken med 15-16 dage, og da kulturtiden reduceres, er væksten af denne celletype begrænset. Det samme gælder for neuronberigede kulturer, men i dette tilfælde er væksten af gliaceller endnu mere begrænset på grund af fraværet af HI-FBS i kulturmediet.

Ud over at tillade forskellige typer af kulturer, der skal opnås fra samme præparat, protokollen her beskrevet har andre fordele. Encellede suspensionen opnås blot ved mekanisk fordøjelse, i modsætning til andre metoder, der anvender både enzymatisk og mekanisk fordøjelse24,25,31,32; Derfor er det hurtigere og billigere. En anden fordel er, at denne protokol også kan bruges til at forberede celler fra andre hjerneregioner, såsom hippocampus eller midbrain, så studiet af patologier, der påvirker forskellige områder af hjernen. Desuden giver den beskrevne alternative procedure, der gør det muligt at oprette samkulturer, mulighed for analyse af biokemiske og morfologiske ændringer, der forekommer i specifikke celletyper, der findes i samkulturen, ved hjælp af metoder som immunokyokemi. En fælles model for etablering af samkulturer er transwellsystemer24,25,33og34. I modsætning til hvad der sker med et co-kultur system ved hjælp af små afstandsbelægninger, såsom paraffin kugler, transwell co-kultur modeller ikke tillader at udføre immunokytokemi på begge celler typer til stede i co-kultur. Desuden er de sameksaler, der bruger afstandsuder som paraffinsfærerne, enkle og lave omkostninger.

Underkaste neuron-beriget eller neuron-glia kulturer til OGD er en almindelig in vitro model for iskæmi, ikke desto mindre andre in vitro metoder er blevet anvendt, nemlig kemiske og enzymatiske metoder eller induktion af excitotoxicity ved glutamat3,35. Sammenlignet med andre metoder, OGD tillader simulering af de to faser, der opstår under iskæmisk slagtilfælde, nemlig afsavn af ilt og glukose og reperfusion, hvilket er en fordel, fordi det efterligner, hvad der sker in vivo. Selv om kemiske og enzymatiske metoder kan være nyttige på grund af dens hurtige reaktion og brugervenlighed, er der desuden en bekymring med hensyn til relevansen for den in vivo patologiske tilstand, fordi kemisk hypoxi fører til mere frie radikaler end anoxia, overgår, hvad der er observeret in vivo35. Med hensyn til OGD-protokollen bemærkede vi, at den fører til neuronal tab, og at forlængelsen af læsionen kan justeres ved at ændre varigheden af OGD-perioden for at nå forsøgskravene. De forskelle, der observeres i neuronal tab efter OGD-perioden i neuronberigede kulturer og neurongliakulturer, kan skyldes astrocytters beskyttende rolle og mindsker dermed den neuronale død.

Som forventet var OGD-skaderne på astrocytter i neurongliakulturer lavere ved både 4 timer og 6 timer sammenlignet med neuroner. Astrocytters højere modstand mod OGD tilskrives flere aspekter. De er i stand til at opretholde ATP niveauer længere end neuroner under iskæmi, og svær ionisk dysregulering fortsætter langsommere36: for det første fordi neuroner har højere tæthed af ioniske kanaler og en deraf følgende større energiefterspørgsel for at opretholde ioniske gradienter; og for det andet fordi de fleste af de glykogen butikker i hjernen findes i astrocytter36. Derudover, astrocytter udtrykke lavere niveauer af ionotropic glutamat receptorer end neuroner og har bedre ionisk buffering og antioxidant kapacitet36. Disse egenskaber ligger formentlig til grund for det velkendte selektive tab af neuroner over astrocytter36.

Med hensyn til begrænsningerne i den protokol, der foreslås her, er den vigtigste, at den er baseret på en in vitro-model, der mangler kompleksiteten af de interaktioner, der opstår i et in vivo-system, hvilket kan forårsage spørgsmål om omsættelighed til en in vivo-situation. Men det præsenterer de fordele, der er forbundet med cellekulturer, nemlig enkelhed, nem manipulation, evnen til at give grundlæggende detaljerede oplysninger om, hvordan en bestemt cellepopulation reagerer på en vis fornærmelse3. In vitro-modeller af sygdom er mindre tidskrævende og billigere at vedligeholde end in vivo modeller. Mere specifikt, for modellering af iskæmisk slagtilfælde, en in vitro model har også den fordel, at være lettere at kontrollere glukose og ilt niveauer sammenlignet med in vivo alternativer34. Desuden foreslår vi også brug af samkulturer, som kan give en højere grad af kompleksitet, så man kan studere samspillet mellem forskellige celletyper i et væv.

Der er nogle kritiske trin, der kræver yderligere opmærksomhed, når du udfører protokollen. På grund af astrocytters ernæringsmæssige behov bør den NBM, der anvendes til at opnå neurongliakulturer, suppleres med 10 % af HI-FBS-holdige vækstfaktorer, aminosyrer og fedtsyrer. Dette tilskud er, hvad der adskiller neuron-glia kultur fra neuron-beriget kultur. For at forberede en astrocyt-beriget kultur et medium blottet for kosttilskud, der kræves for neuronal vækst, såsom B27, bør anvendes. I den nuværende protokol, var det medium for valg for astrocyte-beriget kultur MEM. Det er også meget vigtigt, at de forskellige celletypers behov sikres, når de bringes i kontakt. Til dette formål kan der anvendes et kulturmedium, der er kompatibelt med både astrocytter og neuroner, nemlig NBM suppleret med B27 og HI-FBS. Med hensyn til OGD-protokollen er de vigtigste kritiske trin fjernelsen af alle O 2 frakammeret, før ogd-perioden påbegyndes, og korrekt vask af cellerne med HBSS uden glukose for at eliminere al den glukose, der er til stede i mediet.

Afslutningsvis præsenterer vi her en in vitro-model for at studere det iskæmiske slagtilfælde, der er etableret på en enkel, hurtig, billig og reproducerbar måde. Derudover, den beskrevne metode giver også mulighed for at gennemføre neuron- og astrocyt-beriget primære kulturer, men også neuron-glia kulturer, hvilket giver en stor in vitro model for modellering flere hjernesygdomme, med et højere niveau af kompleksitet end udødeliggjorte cellelinjer og ren neuronal eller glia kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender fundação para a Ciência e a Tecnologia gennem Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 og stipendiet SFRH/BD/135936/2018 til JP, af ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" gennem projektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 og finansiering til PPBI-Portuguese Platform of BioImaging gennem projektet POCI-01-0145-FEDER-022122.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 -well culture plates Thermo Fischer Scientific 142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
B27 supplement (50x) Gibco 17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium Dako S3023
D-glucose anhydrous Fisher Scientific G/0450/60 3.4 g/L
Epifluorescence microscope Zeiss AxioObserver Z1x 63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0615 10%
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272 120 µg/mL
Glutamate Sigma-Aldrich G8415 25µM
Glutamine Sigma-Aldrich G3126 0.5 mM
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber Stemcell Technologies 27310 Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 5 mg/L
Ketamine Sigma-Aldrich K-002 87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium Sigma-Aldrich M0268 warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2 Santa Cruz Biotechnology Sc-74421 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103-049 warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology Sigma-Aldrich 1.07164 Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde Sigma -Aldrich P6148 4% in PBS
Penicilin/Streptomycin Biochrom A 2213 penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1024
Rabbit Anti-GFAP DAKO Z0334 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate Fisher Scientific S/4240/60 2.2g/L
Xylazine Sigma-Aldrich X1126 12 mg/Kg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22, (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6, (1), 11 (2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37, (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13, (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158, (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41, (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35, (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62, (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11, (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70, (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66, (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4, (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56, (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19, (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36, (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31, (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13, (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182, (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18, (1), 74 (2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8, (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393, (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2, (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852, (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36, (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47, (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10, (11), 1377-1386 (2007).
En cellekultur model for at studere den rolle, Neuron-Glia interaktioner i Iskæmi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).More

Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter