Summary
כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.
Abstract
שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין בתת-פרה-דם של רקמת המוח, המובילה למחסור בחמצן וגלוקוז, ולאובדן עצבי כתוצאה מכך. ראיות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין תאי גליה ונוירונאליים מפעילה השפעות מועילות לאחר אירוע איסכמי. לכן, כדי לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית. בזאת אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוקיטים ונוירונים מקליפת המוח העוברית חולדה, כי באמצעות מדיה תרבותית ספציפית, מאפשר הקמת תרבויות נוירון- או אסטרוקיטים מועשר או תרבויות neuron-glia עם תשואה גבוהה ושחזור.
כדי ללמוד את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים, אנו מציעים גישה המבוססת על מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבת של אסטרוציטים מצופה צלחות multiwell. שתי התרבויות נשמרות זו מזו על ידי ספירות פרפין קטנות. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפולים ספציפיים לכל סוג תא, המייצג יתרון במחקרים רבים.
כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות נתונות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה בשבץ איסכמי.
Introduction
על פי נתוני ארגון הבריאות העולמי, כ-5.5 מיליון בני אדם מתים מדי שנה משבץ איסכמי1. מצב זה מאופיין על ידי ההפרעה של זרימת הדם לאזור מוח מסוים, וכתוצאה מכך אובדן הפיך או בלתי הפיך באספקת חמצן וחומרים מזינים לרקמות, אשר משנה את תפקוד הרקמות ומוביל תפקוד מיטוכונדריאלי, dysregulation סידן, excitotoxicity גלוטמט, דלקת ואובדןתאים 2,,3.
מלבד תאי כלי דם, תאי עצביים וגליה מעורבים פתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי4. בפרט, אסטרוציטים חיוניים לתחזוקה של נוירונים ולאחרונה הוצגו לשחק תפקיד קריטי בתגובה נגע איסכמי5. סוג זה של תא גליה מבצע פונקציות של תמיכה מבנית, הגנה מפני סטרס חמצוני, סינתזה של נוירוטרנסמיטורים, ייצוב של תקשורת תא תא, ביןהיתר 6. יחד עם נוירונים, אסטרוציטים לשחק תפקיד ישיר שידור סינפטי, ויסות השחרור של מולקולות כגון אדנוסין טריפוספט, חומצה גמא אמינו בוטירית גלוטמט7. חלק מהפציעה המושרה על ידי איסכמיה נגרמת על ידי שחרור מוגזם של גלוטמט והצטברותו על שסוע סינפטי, המוביל להפעלת יתר של קולטני N-מתיל-D-אספרטט, הפעלת מפלים איתות במורד הזרם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך excitotoxicity8. מאז אסטרוציטים מסוגלים להסיר גלוטמט מן הסוע הסינפטי ולהמיר אותו גלוטמין, הם חיוניים בהגנה מפני excitotoxicity, ובכך להפעיל השפעה neuroprotective על איסכמיה. תאים אלה גם לשחק תפקיד בדלקת עצבית איסכמיה המושרה. לאחר העלבון האיסכמי, אסטרוציטים מופעלים עוברים שינויים מורפולוגיים (היפרטרופיה), להתרבות, ולהראות עלייה בביטוי חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP). הם יכולים להיות תגובתיים (אסטרוגליוזיס), שחרור ציטוקינות פרו דלקתיות כגון גורם נמק גידול-α, interleukin-1α ו interleukin-1β, והפקת רדיקלים חופשיים, כולל תחמוצת החנקן וסופרתחמוצת, אשר בתורו יכול לגרוםלמוות עצבי 9,,10. לעומת זאת, אסטרוציטים תגובתיים עשויים גם לשחק אפקט neuroprotective, מאז הם משחררים ציטוקינות אנטי דלקתיות, כגון שינוי גורם גדילה-β, כי הוא upregulated לאחרשבץ 11. יתר על כן, הם יכולים ליצור צלקת גליה, אשר יכול להגביל את התחדשות רקמות על ידי עיכוב נבטים סקסוניים; עם זאת, צלקת גליה זו יכולה לבודד את אתר הפציעה מרקמות קיימא, ובכך למנוע גל מדורג של נזק לרקמות בלתימבוקרות 12,13.
לכן, זה הכרחי כדי לבסס מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה תחת פציעה איסכמית על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות להגביל או להפוך את ההשפעות של פגיעה איסכמית. בהשוואה למודלים אחרים המשמשים לחקר פגיעה איסכמית, כל שם במודלים vivo 14,15,16, תרבויות organotypic17,18,19 ופרוסות מוחחריפה 20,21,22, תרביות תאים ראשיות הן פחות מורכבות, מה שהופך את המחקר של תרומות בודדות של כל סוג תא בפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי ואיך כל סוג תא מגיב למטרות טיפוליות אפשריות. בדרך כלל, על מנת ללמוד את האינטראקציות בין תרבויות מועשר נוירון ותרבויות מועשר אסטרוציט, נוירונים ותאי גליה ממוצא לאחר הלידהמשמשים 23,24, או תאי גליה שלאחר הלידה ונוירוניםעובריים 25,26. בזאת מוצעת גישה פשוטה כדי לבסס נוירון- או אסטרוציט מועשר תרבויות ותרביות נוירון-גליה מאותה רקמה. תאים ראשיים אלה מתקבלים קליפת המוח העוברית חולדה, אזור המושפע לעתים קרובותמשבץ 27,28. יתר על כן, ניתקה של הרקמה מבוצעת רק על ידי הליך מכני. לכן, פרוטוקול זה מאפשר בידוד תאים באותו שלב של התפתחות, באופן מהיר ולא יקר, ועם ביצועים גבוהים ושחזור.
את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים ניתן לחקור באמצעות מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבתית של אסטרוציטים נזרעים צלחות multiwell. ניתן להשתמש בספירות פרפין קטנות כדי להבטיח את ההפרדה של שתי תרביות התא. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית של כל סוג תא לפני שהם מובאים במגע. לדוגמה, ניתן להשתיק גן מסוים באסטרוציטים ולראות כיצד הוא יכול להשפיע על הפגיעות העצבית או הגנה מפני נזק איסכמי המושרה. שיטה מבוססת כדי לגרום לתנאים כמו איסכמי במבחנה היא חמצן ומניעת גלוקוז (OGD)3, אשר מורכב החלפת האטמוספירה הרגילה (95% אוויר ו 5% CO2)על ידי אטמוספרה אנוקסית (95% N2 ו 5% CO2),הקשורים השמטה של גלוקוז.
השיטה המתוארת מתאימה ללימוד האינטראקציות בין תאי עצב ואסטרוציטים בהקשר של שבץ איסכמי, בצורה פשוטה, מהירה, ניתנת לשחזור ולא יקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים בהם נעשה שימוש גודלו במרכז לחקר מדעי הבריאות CICS-UBI בהתאם לדרישות האתיות הלאומיות לחקר בעלי חיים ועם האמנה האירופית להגנה על בעלי חיים בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסיוניות ומדעיות אחרות (הנחיה 2010/63/EU).
1. תרבות תא ראשי קליפת המוח העובר חולדה
- הכנה בינונית לתרבות
- להכין את המדיום Neurobasal (NBM) על ידי הוספת התוספים הבאים: 2% B27, 0.5 mM גלוטמין, 25 גלוטמט μM ו 120 μg / מ"ל ג'נטמיצין. Homogenize, להתאים את ה-pH ל 7.2 ולחטא את המדיום עם שלב סינון ואקום, באמצעות מסנן 0.22 μm. עבור תרבות התא נוירון-גליה, להשלים את אמצעי תרבות תא NBM עם 10% של סרום חום-לא פעילות של פר העובר (HI-FBS).
- להכין את המינימום חיוני בינוני נשר (MEM) בינוני עם התוספים הבאים: נתרן מימן קרבונט 2.2 g/L, אינסולין מלבלב הורן 5 מ"ג / L, D-גלוקוז anhydrous 3.4 g/L, פניצילין (12 U /mL) / סטרפטומיצין (12 μg/ mL) ו 10% HI-FBS. הומוגניזציה, להתאים את ה-pH ל 7.2 ולחטא את המדיום עם שלב סינון.
- הכנת חומרים וציוד
- לנקב את החלק המסוף של קצה מיקרופיפט פלסטיק 1 מ"ל מצד לצד, באמצעות מחט בקוטר מסוים (0.5 מ"מ עבור S; 0.6 מ"מ עבור M; 0.8 מ"מ עבור L) ולאטום את פתיחת הקצה באמצעות להבה.
- לחטא את כל כלי הזכוכית. לאורך כל הדיסטוריה יש לשמור על הכלים המשמשים (למשל, מספריים, פינצטה, אזמל) שקועים ב-70% אתנול. מרססים את החומרים ב-70% אתנול לפני הכניסה לתא זרימת ה למינאר.
- קבעו את טמפרטורת אמבט המים ל-37°C והניחתו את תא תרבית התא באמבט המים לפני תחילת ההליך.
הערה: עבור בדיקות אימונוציטוכימיה, ציפוי פולי-D-לינזין צריך להתבצע לוחות multiwell המכילים כיסויים.
- תרבות קליפת המוח העוברית חולדה
- הסר את עוברי החולדה מנקבה Wistar חולדה עם 15-16 ימים של הריון (סוף ההזדווגות, אשר אמור להימשך 24 שעות, נחשב היום הראשון של ההתפתחות העוברית).st לשם כך, להרדים את הנקבה עם קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג) וxylazine (12 מ"ג/ ק"ג) ולהסיר את העוברים. ואז להמתת את העכברוש הנשי על ידי נקע צוואר הרחם, בעקבות פרוטוקול סטנדרטי.
- מניחים את העוברים בצינור סטרילי של 50 מ"ל, מוסיפים תמיסת מלח של מאגר פוספט (PBS) עד שהיא מכסה את העוברים ואקח אותם במהירות לחדר התרבות.
- עדיין בתוך שאק החלמון, מניחים את העוברים בצלחת פטרי המכילה 25 מ"ל של PBS קר. בעזרת מספריים פינצטה, לשבור את שאק החלמון, להסיר את העובר ולהעביר אותו לצלחת פטרי אחרת המכילה גם PBS קר. PBS בצלחת פטרי צריך להיות מספיק כדי לכסות את העובר כולו.
הערה: היזהר בעת פתיחת שאק החלמון כדי למנוע פגיעה בעובר. ב 1.3.3 ו 1.3.4 השתמשנו 90 מ"מ מנות פטרי קוטר הניח על גבי חבילות קרח מכוסה נייר סופג כדי לשמור על PBS בטמפרטורה נמוכה. - עבור פירוק העובר, להעביר אותו לצלחת פטרי אחרת המכילה 30 מ"ל של PBS קר. מניחים את העובר מתחת למיקרוסקופ לנתח ולשתק אותו באמצעות פינצטה. הפוך את החתך הראשוני במקביל לקליפת המוח, עובר מהחלל עינית לסוף הלוע ולהיות זהיר לא לערוף את החיה.
- בזהירות להסיר את הקרקפת ואת קרום המוח באמצעות פינצטה, על מנת לא לפגוע ברקמת המוח קליפתית. תעשה את החתך הבא כדי להפריד את קליפת המוח. להעביר את הרקמה הקליפתית לצינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS באמצעות פיפטה פסטר.
- לבצע את העיכול המכני של רקמת המוח הקליפתי באמצעות 1 מ"ל טיפים פלסטיק שהוכנו ב 1.2.1. לתלת 10 פעמים עם פיפטה רגילה ולחזור על התהליך באמצעות pipettes עם חורים קטנים יותר בהדרגה (L, M ו-S), עד הנתחים מתפרקים.
- לאחר העיכול המכני, צנטריפוגה המתלים ב 400 x g במשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את המשקע עם מדיום תרבות התא המתאים שהתחממו בעבר ב-37°C.
- לקבוע את המספר הכולל של תאים הנוכחיים מתלה התא (צפיפות התא) באמצעות תא Neubauer, לעשות את דילול המתאים וצלחת התאים. צפיפות התא הראשונית הוגדרה בהתבסס על מחקר קודם5.
- עבור תרבות מועשרת בנוירון, השתמש 0.21 x 106 תאים /ס"מ2 כצפיפות התא הראשונית ולשמור על התאים במדיום תרבות NBM ללא HI-FBS.
- עבור תרבויות נוירון-גליה להשתמש 0.14 x 106 תאים / ס"מ2 כמו צפיפות התא הראשונית ולשמור על התאים במדיום תרבות NBM בתוספת 10% HI-FBS.
- עבור תרבות מועשר אסטרוציט, להשתמש 0.26 x10 6 תאים / ס"מ2 כמו צפיפות התא הראשונית ולשמור על התאים MEM בתוספת כפי שצוין קודם לכן.
- מקם את התאים בדגמה ב- 37 °C, 95% O2 ו- 5% CO2.
הערה: לתקופות תרבות ארוכות יותר, אנטי מיטוטי כגון 27 μM 5-fluoro-2′-deoxyuridine עם 68 μM uridine יש להוסיף כדי לדכא את צמיחת התא.
2. מערכת שיתוף תרבות
- הכנת חומרים
- מחממים את הפרפין ב-150 מעלות צלזיוס בבלוק חימום למשך כ-7 דקות. לשמור על 150 מעלות צלזיוס עד לסיום ההליך. לאחר מכן, בעזרת זכוכית סטרילית בקוטר 1 מ"מ פסטר פיפטה, להוסיף טיפה קטנה מעל כיסויים מצופים PDL. ספירות הפרפין לא סדירות, אבל יש להן קוטר של כ-2 מ"מ. הספירות יאפשרו להפריד בין שתי התרבויות בכ-1.25 מ"מ.
- מכיוון שהפרפין אינו סטרילי, מניחים את הנפח עם ספירות הפרפין תחת קרינה אולטרה סגולה למשך 15 דקות.
- כדי לבסס את התרבות ההתאמה, מעבירים את הסיכות עם ספירות הפרפין באמצעות פינצטה ששקעה בעבר ב-70% אתנול במשך 15 דקות.
- תרבות שותף
- כאשר שתי התרבויות מוכנות לשימוש (כלומר, לאחר 7 ימים בתרבות בתנאים המוזכרים בשלב 1.3.8), להעביר את הנוירונים שנזרעו בכיסויים עם ספירות פרפין לבארות המכילות את האסטרוציטים.
- 24 שעות לפני שתי התרבויות מובאות במגע, לשנות את מדיום התרבות של נוירונים ואסטרוקיטים NBM בתוספת, או לא, עם HI-FBS, בהתאם למטרת הניסוי.
- לאחר הצבת שני סוגי התאים במגע, המתן 8-12 שעות לפני הפעלת הגירויים וההליכים השונים.
הערה: הייצוג השרטוטי של מערכת התרבות ההתקוטפת מוצג באות 1.
3. מחסור בחמצן וגלוקוז
- תרבות הכנה בינונית
- לניסווי OGD, השתמש בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS). הכן את המדיום HBSS עם הריגנטים הבאים: 1.26 מ"מ CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.44 מ'מ KH2PO4, 0.49 מ"מ MgCl2, 139.9 מ"מ NaCl, 4.17 מ"מ NaHCO3, 3.38 מ"מ Na2HPO4. המגן והתאם את ה-pH ל- 7.2. לחטא את המדיום על ידי סינון.
הערה: במידת הצורך, להשלים את פתרון HBSS עם גלוקוז (HBSSglu +), על ידי הוספת גלוקוז 5.56 mM. עבור תרבויות שהוגשו OGD לא להשלים את המדיום HBSS עם גלוקוז (HBSSglu-).
- לניסווי OGD, השתמש בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS). הכן את המדיום HBSS עם הריגנטים הבאים: 1.26 מ"מ CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.44 מ'מ KH2PO4, 0.49 מ"מ MgCl2, 139.9 מ"מ NaCl, 4.17 מ"מ NaHCO3, 3.38 מ"מ Na2HPO4. המגן והתאם את ה-pH ל- 7.2. לחטא את המדיום על ידי סינון.
- הליך OGD
- 7 ימים לאחר זריעת התאים, להסיר את מדיום התרבות ולשטוף פעמיים עם HBSSglu-. לאחר הכביסה מוסיפים את מדיום תרבות תאי HBSSglu ומניאים את הנפח בתא ההיפוקסיה.
- לאטום את תא היפוקסיה ולהוסיף תערובת גז המכילה 95% N2/5% CO2 במשך 4 דקות עם זרימה של 20 L/min כדי להסיר את החמצן הנוכחי בתוך התא. לאחר מכן, לעצור את הזרימה ולמקם את תא היפוקסיה באינקובטור ב 37 ° C עבור 4 שעות או 6 שעות, בהתאם להיקף של איסכמיה המיועדת.
- לאחר תקופת OGD, להחליף את HBSSglu- בינוני עם מדיום התרבות המתאימה עבור ההליכים הנותרים.
הערה: הניסוי OGD שמטרתו לדמות את התנאים במבחנה כי התאים סובלים במהלך אירוע איסכמי, ולכן חשוב לאשר כי כל המדיה בשימוש בעבר מוסר.
4. תסרוקת אימונוציטו
הערה: בצע את ההסכמה החיסונית כפי שתואר קודם לכן5.
- בקצרה, כדי לאפיין את תרבויות קליפת המוח השונות, דגירה התאים לילה ב 4 ° C עם ארנב anti-GFAP (1:2000) ועכבר נגד microtubule הקשורים חלבון 2 (MAP2; 1:500); ואז שעה אחת בטמפרטורת החדר עם הנוגדנים המשניים הבאים: אנטי-ארנב ביחיד אלקסה פלור 546 ואנטי-עכברים התווסתו לאלכסה פלור 488, שניהם ב-1:1000 דילול.
- לתייג את גרעין התא על ידי דגירה עם 2 μM Hoechst 33342 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הר מכסה את הפלואורסצנת הרכבה בינונית ולרכוש תמונות על מיקרוסקופ epifluorescence עם הגדלה 63x.
5. ניתוח סטטיסטי
- נתונים אקספרס כאחוז מהמספר הכולל של תאים או כאחוז שליטה ומוצגים כשגיאה סטנדרטית ממוצעת ± של ממוצע (SEM) של לפחות 3 ניסויים עצמאיים שבוצעו בשלושה רישיות.
- בצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנה (GraphPad Software Inc., סן דייגו, קליפורניה), באמצעות מבחן T של סטודנט שלא שולם. התוצאות נחשבו משמעותיות כאשר ערכים של p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאפיין את התרבויות, אימונוציטוכימיה כדי להעריך את מספר התאים שהביעו GFAP או MAP2, סמנים בשימוש נרחב של אסטרוציטיםונוירונים (איור 2), בוצעבכל סוג של תרבות קליפתית. ניתוח זה גילה כי תרבויות מועשר אסטרוציט הציגו 97% של התאים המביעים GFAP (איור 2A). לגבי התרבות המועשרת בנוירון 78% מהתאים הביעו MAP2, 4% מהתאים הביעו GFAP, ו 18% מהתאים היו גם GFAP ו MAP2 שלילי(איור 2B). ביחס לתרבות הקליפתית נוירון-גליה, 49% מהתאים היו MAP2 חיובי, 31% היו GFAP חיובי 20% היו שליליים עבור שני סמנים(איור 2C).
שבעה ימים לאחר הקמת התרבות הקליפתית, תרבות הנוירון-גליה והתרבות המועשרת בנוירון היו נתונים להליך OGD, במשך 4 שעות או 6 שעות. לאחר הליך זה, מספר תאי MAP2 ו GFAP חיובי הוערך על ידי אימונוציטוכימיה. בתרבות הנוירון-גליה, אובדן התאים החיוביים MAP2 היה 30% ו 60% לאחר 4 שעות ו 6 שעות של OGD, בהתאמה(איור 3B),בעוד אובדן של תאים חיוביים GFAP היה 9% ו 17% לאחר 4 שעות ו 6 שעות של OGD, בהתאמה(איור 3C). לגבי התרבות המועשרת בנוירון, הייתה ירידה של 41% ו 64% במספר התאים MAP2 חיוביים לאחר 4 שעות ו 6 שעות של OGD, בהתאמה(איור 3A). יתר על כן, בתרבות מועשר נוירון, הייתה עלייה קלה בהארכת הפציעה המושרה על ידי 4 שעות של OGD בהשוואה לתרבות נוירון-גליה(איור 3A).
איור 1: ייצוג סכמטי של מערכת התרבות ההתקוטטית.
(א)Astrocytes נזרעו multiwell המכיל כיסויים מצופה PDL ונוירונים נזרעו multiwell עם כיסויים מצופה PDL המכילים 3 ספירות פרפין. (ב)כאשר שתי התרבויות היו מוכנות לשימוש, הנוירונים בספלי הכיסוי עם הספירות הועברו לבארות המכילות את האסטרוציטים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אפיון של תרבות קליפתית נוירון-גליה, תרבות קליפתית מועשרת בנוירון ותרבות קליפתית מועשרת אסטרוציט.
אחוז תאי העצב (תאים חיוביים MAP2), אחוז אסטרוציטים (תאים חיוביים GFAP), ואחוז של תאים שליליים כפולים (MAP2 שלילי / GFAP שלילי תאים) ביום7 ב תרבות ב (A) תרבות מועשר אסטרוציט (ב) נוירון מועשר תרבות (ג) נוירון-גליה ותמונות מייצגות המציגות את immunostaining עבור MAP2 (ירוק) ו GFAP (אדום). המספר הכולל של תאים הוערך על ידי כימות Hoechst 33342 תווי גרעין עם מורפולוגיה שאינה פיקנוטית (כחול). בשל המספר הנמוך של נוירונים בתרבות הקליפתית מועשר אסטרוציט, התמונה המייצגת אינה מראה MAP2 כתמים חיוביים. הנתונים מוצגים כ-SEM ממוצע ± SEM של 3 ניסויים עצמאיים(A)ו-6 ניסויים עצמאיים(B, C)המבוצעים בשלושה ניסויים. התמונות נרכשו עם יעד של 63x. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הערכה של אובדן עצבי לאחר תקופת OGD.
(א,ב) מה אתה עושה? מספר נוירונים / שדה (MAP2-תאים חיוביים) בתרבות נוירון-גליה ותרבות מועשר נוירון ו -(ג)מספר astrocytes / שדה (GFAP חיובי תאים) ותמונה מייצגת של MAP2 (ירוק) ו GFAP (אדום) אימונוסטיציה בתרבות נוירון-גליה. המספר הכולל של תאים הוערך על ידי כימות Hoechst 33342 תווי גרעין עם מורפולוגיה שאינה פיקנוטית (כחול). התרביות המועשרות בנוירון-גליה ונוירון הוגשו למחסור בחמצן וגלוקוז (OGD) לתקופה של 4 שעות ו-6 שעות. הנתונים מוצגים כ-SEM ± של לפחות 3 ניסויים עצמאיים המבוצעים בשלושה ניסויים. המספר הכולל של תאים הוערך על ידי כימות Hoechst 33342 תווי גרעין. **p < 0.01, ***p < 0.001 ו- ****p < 0.0001 בהשוואה ל- OGD 0 h (לא מבחן לא של תלמיד שלא שולם) לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מורכבת בידוד אסטרוציט ונוירון מרקמות קליפתיות עובריות חולדה, המאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציט מועשר או תרבויות נוירון-גליה. הוא הותאם ממחקרקודם של הקבוצה 5שלנו , שבו תוארו הבידוד של התרביות העובריות הקליפתיות והנוירון ושתי התרבויות התאפיינו. באמצעות תרבויות אלה, רוק ואח ' מצא כי אסטרוציטים לשחק תפקיד מפתח בתגובה לנזק איסכמי, מציע כי תקשורת בין אסטרוציטים ונוירונים חיונית לגניחותעצבית 5. בפרוטוקול הנוכחי, בנוסף להכנת תרבויות נוירון-גליה ונוירון מועשר, אנו יכולים גם להשיג תרביות מועשר אסטרוציטים, אשר מאפשר לנו ללמוד את ההשפעה של סביבה איסכמית על הנוירונים ואסטרוציטים מבודדים או יחד.
ניתוח של נתוני immunocytochemistry הראה כי 18% של התאים בתרבות מועשר נוירון ו 20% בתרבויות נוירון-גליה היו שליליים הן MAP2 ו GFAP. תאים אלה הציגו גרעין עם מורפולוגיה שאינה פיקנוטית. בהתחשב בכך שהתרבויות הוכנו מרקמה עוברית, חלק מהתאים עדיין לא יכול לבטא את הסמן העצבי, צורך התבגרות נוספת. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים המציין כי ביטוי MAP2 גדל עם בגרות עצבית, כי מספר התאים MAP2 חיובי גדל עם הזמן בתרבות עם גיל העוברים בזמן של29,30. הוכחנו בעבר כי בתרבות נוירון-גליה רק 0.7% מהתאים היו חיוביים עבור מולקולת מתאם מיונן סמן סידן מיונן15. למרות מדיום התרבות בשימוש בתרביות נוירון-גליה יש את התמיכה התזונתית הדרושה לצמיחת תאי גליה, כמות microglia בקליפת המוח של עוברים עם 15-16 ימים מצטמצמת כמו זמן התרבות מצטמצם, הצמיחה של סוג תא זה מוגבלת. אותו הדבר חל על תרבויות מועשרנוירונים, אבל במקרה זה הצמיחה של תאי גליה מוגבלת עוד יותר בשל היעדר HI-FBS במדיום התרבות.
בנוסף לאפשר סוגים שונים של תרבויות כדי לקבל מאותה הכנה, הפרוטוקול כאן המתואר יש יתרונות אחרים. המתלים חד-תאיים מתקבלים פשוט על ידי עיכול מכני, בניגוד לשיטות אחרות המשתמשות הן בעיכולאנזימטיוהן בעיכול מכני 24,25,31,32; לכן, זה מהיר יותר וזול יותר. יתרון נוסף הוא כי פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להכין תאים מאזורים אחרים במוח, כגון ההיפוקמפוס או המוח האמצעי, המאפשר את המחקר של פתולוגיות המשפיעות על אזורים שונים במוח. יתר על כן, ההליך החלופי המתואר, המאפשר הקמת תרבויות מדוקות, מאפשר ניתוח של שינויים ביוכימיים ומורפולוגיים המתרחשים בסוגי תאים ספציפיים הנוכחים בתרבות ההפוכנית באמצעות שיטות כגון אימונוציטוכימיה. מודל נפוץ להקמת תרבויות משותפות הוא מערכות טרנסוול24,,25,,33,,34. בניגוד למה שקורה עם מערכת תרבות משותף באמצעות spacers קטן, כגון ספירות פרפין, מודלים טרנסוול שיתוף תרבות אינם מאפשרים לבצע אימונוציטוכימיה בשני סוגי התאים הנוכחיים בתרבות השותפות. בנוסף, התרבויות הותקות המשתמשות בחללים כגון ספירות הפרפין הן פשוטות בעלות נמוכה.
חשיפת תרביות נוירון מועשר או נוירון-גליה OGD הוא נפוץ במודל חוץית עבור איסכמיה, בכל זאת שיטות אחרות במבחנה שימשו, כלים כימיים ואנזימטיים שיטות או אינדוקציה של excitotoxicity על ידיגלוטמט 3,35. בהשוואה לשיטות אחרות, OGD מאפשר סימולציה של שני השלבים המתרחשים במהלך שבץ איסכמי, כל שם מניעת חמצן וגלוקוז ואת ההתרככות, וזה יתרון כי הוא מחקה את מה שקורה vivo. יתר על כן, למרות שיטות כימיות אנזימטיות עשוי להיות שימושי בשל התגובה המהירה שלה וקלות היישום, יש חשש עם הרלוונטיות למצב פתולוגי vivo, כי היפוקסיה כימית מובילה יותר דור רדיקלים חופשיים מאשר אנוקסיה, עולה על מה שנצפה vivo35. לגבי פרוטוקול OGD, הבחנו כי זה מוביל לאובדן עצבי, כי ההרחבה של הנגע ניתן להתאים על ידי שינוי משך תקופת OGD, על מנת להגיע לדרישות ניסיוניות. ההבדלים שנצפו באובדן עצבי לאחר תקופת OGD בתרבויות מועשרנוירון ותרבויות נוירון-גליה עשוי להיות בשל התפקיד המגן שיחק על ידי אסטרוקיטים, ובכך להחכיר את המוות העצבי.
כצפוי, נזק OGD אסטרוקיטים בתרביות נוירון-גליה היה נמוך יותר הן 4 שעות ו 6 שעות בהשוואה לנוירונים. ההתנגדות הגבוהה יותר של אסטרוציטים OGD מיוחסת להיבטים מרובים. הם מסוגלים לשמור על רמות ATP ארוך יותר מאשר נוירונים במהלך איסכמיה, וdysregulation יוני חמור ממשיך לאט יותר36: ראשית כי נוירונים יש צפיפות גבוהה יותר של ערוצים יוניים וכתוצאה מכך ביקוש אנרגיה גדול יותר כדי לשמור על מעברי צבע יוניים; ושנית, כי רוב חנויות גלוקוגן במוח נמצא אסטרוציטים36. בנוסף, אסטרוקיטים לבטא רמות נמוכות יותר של קולטני גלוטמט יונוטרופי מאשר נוירונים ויש להם אגירה יונית טובה יותר וקיבולת נוגדתחמצון 36. תכונות אלה כנראה בבסיס אובדן סלקטיבי ידוע של נוירונים על אסטרוציטים36.
לגבי המגבלות של הפרוטוקול המוצע כאן, המשמעותי ביותר הוא שהוא מבוסס על מודל במבחנה כי חסר את המורכבות של האינטראקציות המתרחשות במערכת vivo, אשר יכול לגרום לבעיות תרגום למצב vivo. עם זאת, הוא מציג את היתרונות הקשורים תרביות תאים, כלים, קלות מניפולציה, היכולת לספק מידע מפורט בסיסי על איך אוכלוסיית תאים ספציפיים מגיב העלבוןמסוים 3. במודלים מבחנה של מחלה הם פחות זמן רב ופחות יקר לתחזק מאשר במודלים vivo. ליתר דיוק, עבור הדוגמנות של שבץ איסכמי, מודל במבחנה גם בעל היתרון של להיות קל יותר לשלוט על רמות הגלוקוז והחמצן בהשוואה חלופות vivo 34. יתר על כן, אנו מציעים גם את השימוש בתרבויות מפעולה, אשר יכול לתת רמה גבוהה יותר של מורכבות, המאפשר ללמוד את האינטראקציה בין סוגי תאים שונים הנוכחי ברקמה.
קיימים מספר שלבים קריטיים הדורשים תשומת לב נוספת בעת ביצוע הפרוטוקול. בשל הדרישה התזונתית של אסטרוציטים, NBM המשמש להשגת תרביות נוירון-גליה צריך להיות בתוספת עם 10% של גורמי גדילה המכילים HI-FBS, חומצות אמינו וחומצות שומן. תוספים זה הוא מה מבדיל את תרבות הנוירון-גליה מהתרבות המועשרת בנוירון. כדי להכין תרבות מועשר אסטרוציט בינוני ללא תוספי מזון הנדרשים לצמיחה עצבית, כגון B27, יש להשתמש. בפרוטוקול הנוכחי, המדיום של הבחירות לתרבות המועשרת באסטרוציט היה MEM. זה גם מאוד חשוב כי הצרכים של סוגי תאים שונים מובטחים כאשר הם מובאים במגע. למטרה זו, ניתן להשתמש במדיום תרבות התואם הן אסטרוציטים והן לנוירונים, כל כך NBM בתוספת B27 ו- HI-FBS. לגבי פרוטוקול OGD, הצעדים הקריטיים העיקריים הם הסרת כל O2 מהתא לפני תחילת תקופת OGD, ושטיפה נכונה של התאים עם HBSS ללא גלוקוז, על מנת לחסל את כל הגלוקוז הנוכחי במדיום.
לסיכום, כאן אנו מציגים מודל במבחנה כדי ללמוד את השבץ האיסכמי שנקבע בדרך פשוטה, מהירה, זולה וניתנת לשחזור. בנוסף, השיטה המתוארת מאפשרת גם ליישם תרבויות עיקריות מועשרות בנוירון ואסטרוציט, אך גם תרבויות נוירון-גליה, ובכך מספקת מודל נהדר במבחנה למודל מספר מחלות מוח, עם רמה גבוהה יותר של מורכבות מאשר קווי תאים מונצחים ותרבויות עצביות או גליה טהורות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מכירים בתמיכה במימון של Fundação para a Ciência e Tecnologia באמצעות פרויקטים UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 והמחווה SFRH/BD/135936/2018 ל-JP, על ידי 'Programa Operacional do Centro, Centro 2020" באמצעות הפרויקט CENTRO-01-0145-FEDER-000013 ומימון לפלטפורמה PPBI-פורטוגזית של BioImaging באמצעות פרויקט POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
