Summary
ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。
Abstract
虚血性脳卒中は、脳組織の低灌流、酸素およびグルコース欠乏、および結果的な神経喪失を特徴とする臨床状態である。多くの証拠は、グリアと神経細胞の相互作用が虚血性事象の後に有益な効果を発揮することを示唆しています。そのため、潜在的な保護機構を探索するためには、虚血環境におけるニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを開発することが重要です。ここでは、ラット胚性皮質からアストロサイトおよびニューロンを単離する簡単なアプローチを提示し、特定の培養培地を用いて、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養を高収率および再現性で確立することを可能にする。
アストロサイトとニューロンのクロストークを研究するために、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートにメッキされたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムに基づくアプローチを提案する。2つの培養物は、小さなパラフィン球によって離れて維持される。このアプローチは、独立した操作と各細胞タイプへの特定の治療法の適用を可能にし、多くの研究において利点を表している。
虚血性脳卒中中に何が起こるかをシミュレートするために、培養物は酸素およびグルコース剥奪プロトコルに供される。このプロトコルは虚血性脳卒中におけるニューロンとグリア相互作用の役割を研究するのに有用なツールを表す。
Introduction
世界保健機関(WHO)のデータによると、毎年約550万人が虚血性脳卒中で死亡しています。この状態は、ある脳領域への血流の中断によって特徴付けられるが、組織への酸素および栄養素の供給において可逆的または不可逆的な損失をもたらし、組織機能を変化させ、ミトコンドリア機能不全、カルシウム調節障害、グルタミン酸興奮性、炎症および細胞損失22、33を引き起こす。
血管細胞とは別に、神経細胞およびグリア細胞は虚血性脳卒中4の病態生理学に関与している。特に、アストロサイトはニューロンの維持に必須であり、最近では虚血病変5に対する応答において重要な役割を果たすることが示された。このタイプのグリア細胞は、構造的支持の機能を果たす、酸化ストレスに対する防御、神経伝達物質の合成、細胞間通信の安定化、とりわけ6。ニューロンと並んで、アストロサイトはシナプス伝達において直接的な役割を果たし、アデノシン三リン酸、γ-アミノ酪酸およびグルタミン酸7などの分子の放出を調節する。虚血によって引き起こされる傷害の一部は、シナプス裂切れにおけるグルタミン酸の過剰放出およびその蓄積によって引き起こされ、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体の過剰活性化につながり、下流シグナル伝達カスケードを活性化し、最終的に興奮性障害をもたらす8を生じる。アストロサイトはシナプス裂膜からグルタミン酸を除去し、グルタミンに変換することができるので、興奮毒性に対する防御に重要であり、それによって虚血に対する神経保護効果を発揮する。これらの細胞はまた、虚血誘発性神経炎症の役割を果たす。虚血性侮辱の後、活性化されたアストロサイトは形態学的変化(肥大)を受け、増殖し、そしてグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)発現の増加を示す。それらは反応性(アストログリオーシス)になり、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1αおよびインターロイキン-1βなどの炎症性サイトカインを放出し、一酸化窒素およびスーパーオキシドを含むフリーラジカルを産生し、神経死9,1010を誘導することができる。対照的に、反応性アストロサイトはまた、神経保護作用を果たして、脳卒中11後にアップレギュレートされる成長因子βの転換などの抗炎症性サイトカインを放出するのでである。さらに、彼らは、軸索発芽を阻害することによって組織の再生を制限することができるグリア瘢痕を生成することができます。しかし、このグリア瘢痕は、損傷部位を生存可能な組織から隔離することができ、従って制御されていない組織損傷12、13,13のカスケード波を防ぐ。
したがって、虚血性損傷の影響を制限または逆転させる治療戦略を見つけるために、虚血性傷害下でのニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを確立することが不可欠です。虚血性損傷を研究するために使用される他のモデル、すなわち生体内モデル,14、15、16、,15,16オルガノスティック培養17、18、1918および17急性脳スライス20、21、22,21と比較して、一次細胞培養は複雑性が低く、これは虚血性脳卒中の病態生理学における各細胞型の個々の寄与の研究を可能にする。,2219典型的には、ニューロンエンリッチ培養とアストロサイトエンリッチ培養との相互作用を研究するために、出生後起源のニューロンおよびグリア細胞は、23、24、,24または出生後グリア細胞および胚性ニューロン25、26,26を使用する。本明細書では、同じ組織からニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物およびニューロングリア培養を確立するための簡単なアプローチが提案される。これらの初細胞はラット胚性皮質から得られ、脳卒中27、28,28によって頻繁に影響を受ける領域である。また、組織の解離は機械的な手順によってのみ行われる。したがって、このプロトコルは、開発の同じ段階で、高速かつ安価な方法で、高い性能と再現性で細胞を単離することができます。
アストロサイトとニューロンのクロストークは、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートに播種されたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムを使用して探索することができる。小さなパラフィン球体は、2つの細胞培養物の分離を確実にするために使用することができる。この方法では、各セル型が接触する前に、独立した操作が可能になります。例えば、アストロサイトの特定の遺伝子を沈黙させ、それが虚血性損傷に対する神経の脆弱性または保護にどのような影響を与えるかを見ることができます。インビトロで虚血性様条件を誘導する確立された方法は、酸素およびグルコース欠乏(OGD)3であり、これはグルコースの省略に関連するアノキシック雰囲気(95%N2および5%CO2)によって通常の雰囲気(95%空気および5%CO2)を置き換えることから成る。322 2
記載された方法は、虚血性脳卒中の文脈におけるニューロンとアストロサイト間の相互作用を、簡単で、速く、再現可能で安価な方法で研究するのに適している。
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Protocol
使用されるすべての動物は、動物研究のための国家倫理要件に従って、および実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(指令2010/63/EU)に従って、CICS-UBI健康科学研究センターで飼育されました。
1. ラット胚皮質一次細胞培養
- 培地製剤
- 次のサプリメントを追加して神経基底培地 (NBM) を準備します: 2% B27, 0.5 mM グルタミン, 25 μM グルタミン酸および 120 μg/mL ゲンタマイシン.均質化し、pHを7.2に調整し、0.22 μmのフィルターを使用して真空濾過ステップで培地を殺菌します。ニューロングリア細胞培養の場合、 10% 熱不活性化胎児胎児血清 (HI FBS) で NBM 細胞培地を補う.
- 以下のサプリメントで最小必須培地イーグル(MEM)培地を調製:炭酸水素ナトリウム2.2 g/L、牛膵臓からのインスリン5mg/L、Dグルコース無水3.4g/L、ペニシリン(12 U/mL)/ストレプトマイシン(12 μg/mL)および10%HI-FBS。均質化し、pHを7.2に調整し、濾過工程で培地を殺菌します。
- 材料・設備の準備
- 1 mLプラスチックマイクロピペットチップの端子部分を左右に穿刺し、特定の直径の針(Sの場合は0.5 mm、Mは0.6 mm、Lは0.8mm)を使用して、炎を使用して先端の開口部を密封します。
- すべてのガラス製品を殺菌します。解剖全体を通して使用される用具(例えば、はさみ、ピンセット、メス)を70%エタノールに浸し続ける。薄層流れチャンバに入る前に、70%エタノールで材料をスプレーします。
- 水浴温度を37°Cに設定し、手順を開始する前に、水浴に細胞培養培地を入れます。
注:免疫細胞化学のアッセイの場合、ポリD-リジンコーティングはカバーリップを含むマルチウェルプレートで行う必要があります。
- ラット胚性皮質培養
- 15-16日の妊娠を伴う雌のウィスターラットからラット胚を取り除く(交配の終わりは24時間続くはずであり、胚発生の1日目 と考えられる)。そのために、ケタミン(87.5mg/kg)とキシラジン(12mg/kg)でメスを麻酔し、胚を取り除きます。次に、標準的なプロトコルに従って、子宮頸部脱臼によって雌ラットを安楽死させる。
- 胚を50 mLの滅菌チューブに入れ、胚を覆うまでリン酸緩衝液生理食塩分(PBS)を加え、すぐに培養室に持ち込みます。
- それでも黄身嚢の中に、25mLの冷たいPBSを含むペトリ皿に胚を入れます。はさみとピンセットの助けを借りて、黄身嚢を壊し、胚を取り除き、冷たいPBSも含む別のペトリ皿に移します。ペトリ皿のPBSは、胚全体をカバーするのに十分でなければなりません。
注意:卵黄嚢を開くときは、胚に損傷を与えないように注意してください。1.3.3と1.3.4では、吸収性紙で覆われたアイスパックの上に置かれた直径90mmのペトリ皿を使用してPBSを低温に保った。 - 胚の解剖のために、冷たいPBSの30 mLを含む別のペトリ皿にそれを移す。胚を解剖顕微鏡の下に置き、トゥイーザーを使用して固定化します。最初の切開を皮質と平行にし、眼腔から銃口の端まで行き、動物を切断しないように注意してください。
- 皮質の脳組織に損傷を与えないために、ピンセットを使用して慎重に頭皮と髄を取り除きます。皮質を分離するために次の切開を行います。低温殺菌ピペットを用いて、皮質組織をPBSの5 mLを含む15 mLチューブに移します。
- 1.2.1で調製した1 mLプラスチックチップを使用して、皮質脳組織の機械的消化を行います。通常のピペットで10回トリチュレートし、チャンクがばらばらになるまで、徐々に小さな穴(L、M、S)のピペットを使用してプロセスを繰り返します。
- 機械的消化後、懸濁液を400xgで3分間遠心g分離する。上清を捨て、37°Cで温めた適切な細胞培養培地で沈降液を再懸濁する。
- Neubauerチャンバーを用いて細胞懸濁液中に存在する細胞の総数(細胞密度)を決定し、適切な希釈液を作り、細胞をプレートする。初期細胞密度は、以前の研究5に基づいて定義された。
- ニューロンを豊富に培養する場合は、初期細胞密度として 0.21 x 106 細胞/cm2 を使用し、HI-FBS を使用せずに NBM 培地内の細胞を維持します。
- ニューロングリア培養では、初期細胞密度として0.14 x 106 細胞/cm2 を使用し、10%HI-FBSを添加したNBM培地中の細胞を維持する。
- アストロサイトを豊富に含む培養の場合、初期細胞密度として0.26 x 106 細胞/cm2 を使用し、前述のように補充されたMEM内の細胞を維持します。
- 細胞を37°C、95%O2、5%CO2に設定した2インキュベーターに2入れる。
注意:培養期間が長い場合、68 μM ウリジンを含む27 μM 5-fluoro-2′-deoxyuridine などの抗ミトティックを添加して細胞の増殖を抑制する必要があります。
2. コカルチャーシステム
- 材料の準備
- 150°Cのパラフィンを加熱ブロックで約7分間加熱します。手順が終了するまで150°Cに保ちます。次に、1 mmの直径の無菌ガラスパスツールピペットの助けを借りて、滅菌およびPDLコーティングカバースリップの上に小さな滴を加える。パラフィン球は不規則であるが、直径は約2mmである。球体は、2つの培養物を約1.25mmで分離することができます。
- パラフィンは無菌ではないため、パラフィン球体を紫外線の下に15分間置きます。
- 共培養を確立するために、15分間70%エタノールに浸漬したトゥイザーを使用してパラフィン球体でカバースリップを移す。
- コカルチャー
- 2つの培養物を使用する準備ができたら(すなわち、ステップ1.3.8で述べた条件下で培養で7日後)、パラフィン球でカバーリップに播種したニューロンをアストロサイトを含むウェルに移します。
- 24 hの培養物が接触する前に、実験の目的に応じて、HI-FBSを添加したNBMにニューロンおよびアストロサイトの培養培地を変更する。
- 両方の細胞タイプを接触に置いた後、8-12時間待ってから、異なる刺激および手順を開始する。
注: 共培養システムの概略図を 図 1に示します。
3. 酸素とブドウ糖の欠乏
- 培養培地調製
- OGD実験では、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を使用してください。HBSS培地に以下の試薬を用意します: 1.26 mM CaCl2,5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,0.49 mM MgCl2,139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3,3.38 mM Na2HPO4.pHを均質化し、7.2に調整します。ろ過により培地を殺菌する。
注:適切な場合は、5.56 mMのグルコースを追加して、グルコース(HBSSglu+)でHBSS溶液を補います。OGDに提出された培養物の場合、HBSS培地をグルコース(HBSSglu-)で補うものではありません。
- OGD実験では、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を使用してください。HBSS培地に以下の試薬を用意します: 1.26 mM CaCl2,5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,0.49 mM MgCl2,139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3,3.38 mM Na2HPO4.pHを均質化し、7.2に調整します。ろ過により培地を殺菌する。
- OGD 手順
- 細胞を播種してから7日後、培養培地を取り除き、HBSSglu-で2回洗浄する。洗浄後HBSSglu-細胞培養培地を添加し、低酸素室にマルチウェルを配置する。
- 低酸素室を密封し、チャンバー内に存在する酸素を除去するために20 L/minの流れで4分間の95%N2/5%CO2を含むガスミックスを加えます。2この後、フローを停止し、意図する虚血の程度に応じて、37°Cのインキュベーターに低酸素室を4時間または6時間置きます。
- OGDの期間後、HBSSglu-培地を残りの手順に適した培養培地に交換する。
注: OGD 実験は、虚血性イベント中に細胞が被る インビトロ 状態をシミュレートすることを目的としているので、以前に使用したすべてのメディアが除去されることを証明することが重要です。
4. 免疫細胞化学測定
注:免疫細胞化学のアッセイを、前述の5.
- 簡単に言えば、異なる皮質培養を特徴付けるために、ウサギの抗GFAP(1:2000)とマウス抗微小管関連タンパク質2(MAP2;1:500)で細胞を4°Cで一晩インキュベートします。次の二次抗体を用いて室温で1時間:抗ウサギはアレクサFluor 546に共役し、抗マウスはアレクサFluor 488に共役し、いずれも1:1000希釈で。
- 2 μM Hoechst 33342 で室温で 10 分間インキュベーションして細胞核にラベルを付けます。
- 蛍光実装媒体のカバーリップを取り付け、63倍の拡大率で蛍光顕微鏡で画像を取得します。
5. 統計分析
- 細胞総数に対するパーセンテージまたは制御の割合としてデータを表現し、三重で行われた少なくとも3回の独立した実験の平均±平均(SEM)の平均標準誤差として提示した。
- 非対の学生の t テストを使用して、ソフトウェア(GraphPadソフトウェア社、サンディエゴ、CA)で統計分析を実行します。結果は、p < 0.05 の値の場合に有意であると考えられました。
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Representative Results
培養物を特徴付けるために、GFAPまたはMAP2を発現した細胞の数を評価する免疫細胞化学、アストロサイトおよびニューロンのマーカー(図2)を広く使用し、各タイプの皮質培養で行った。この分析により、アストロサイトを豊富に含む培養物がGFAPを発現する細胞の97%を示す(図2A)。MAP2を発現した細胞の78%のニューロンエンリッチ培養について、GFAPを発現した細胞の4%、および18%の細胞がGFAPとMAP2-陰性の両方であった(図2B)。ニューロングリア皮質培養に関連して、細胞の49%がMAP2陽性、31%がGFAP陽性、20%が両方のマーカーに対して陰性であった(図2C)。
皮質培養を確立してから7日後、ニューロングリア培養およびニューロンエンリッチ培養をOGD処置に行い、4時間または6時間行った。この手順の後、MAP2およびGFAP陽性細胞の数を免疫細胞化学によって評価した。ニューロングリア培養では、MAP2陽性細胞の損失は、OGDの4時間および6時間後にそれぞれ30%および60%であった(図3B)、一方、GFAP陽性細胞の損失はOGDの4時間および6時間後にそれぞれ9%および17%であった(図3C)。ニューロンエンリッチ培養に関しては、OGDの4時間及び6時間後のMAP2陽性細胞の数はそれぞれ41%と64%の減少があった(図3A)。また、ニューロンエンリッチ培養では、ニューロングリア培養と比較した場合にOGDの4時間によって誘発される傷害延長のわずかな増加があった(図3A)。
図1:コカルチャーシステムの概略表現。
(A)アストロサイトをPDLコーティングされたカバーリップを含むマルチウェルに播種し、ニューロンを3つのパラフィン球を含むPDLコーティングされたカバーリップを含むマルチウェルに播種した。(B) 2つの培養物を使用する準備が整ったとき、球体を持つカバーリップ内のニューロンは、アストロサイトを含むウェルに移された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ニューロングリア皮質培養、ニューロンエンリッチ皮質培養、アストロサイト濃縮皮質培養の特徴付け
(A)アストロサイトエンリッチ培養(B)の培養7日目におけるニューロン(MAP2陽性細胞)、アストロサイト(GFAP陽性細胞)の割合、二重陰性細胞(MAP2陰性/GFAP陰性細胞)の割合(B)ニューロンエンリッチ培養および(C)ニューロングリア培養およびMAP2(緑色および赤)の免疫染色を示す代表的な画像(GFAP)細胞の総数は、Hoechst 33342標識核を非ピノスティック形態(青)で定量することによって評価した。アストロサイトを豊富に含む皮質培養におけるニューロンの数が少ないため、代表的な画像はMAP2陽性染色を示さない。データは、3 ±つの独立した実験(A)と6つの独立した実験(B、C)の平均sEMとして提示される( B, C)三重で行う。画像は63倍の目的で取得されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:OGD期間後の神経喪失の評価
(A, B)ニューロングリア培養およびニューロングリア培養におけるニューロン/フィールド(MAP2陽性細胞)の数および(C)数アストロサイト/フィールド(GFAP陽性細胞)およびMAP2(緑色)およびGFAP(赤色)の免疫染色の代表的な画像細胞の総数は、Hoechst 33342標識核を非ピノスティック形態(青)で定量することによって評価した。ニューロングリアおよびニューロンエンリッチ培養物を、酸素およびグルコース欠乏(OGD)に4時間および6時間の期間提出した。データは三重で行われた少なくとも3つの独立した実験の平均±SEMとして提示される。細胞の総数を、Hoechst 33342標識核を定量化して評価した。**p < 0.01, ***p < 0.001 および ****p < 0.0001 OGD 0 h (ペアになっていない学生の t テスト) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する方法は、ラット胚性皮質組織からのアストロサイトおよびニューロン分離からなり、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養物の確立を可能にする。これは、皮質ニューロングリアとニューロンエンリッチ胚培養が単離され、2つの培養が特徴付けられるグループ5の以前の研究から適応されました。これらの培養を用いて、Roqueらは、アストロサイトが虚血性損傷に対応する上で重要な役割を果たしていることを発見し、アストロサイトとニューロン間のコミュニケーションが神経保護に不可欠であることを示唆した5。本プロトコルでは、ニューロングリアやニューロンを豊かにした培養物の作製に加え、アストロサイトを豊富に含む培養物を得ることができ、虚血環境が孤立した、あるいは一緒に神経細胞に及ぼす影響を研究することができます。
免疫細胞化学データの分析によると、ニューロンエンリッチ培養中の細胞の18%、ニューロングリア培養における20%がMAP2およびGFAPの両方で陰性であった。これらの細胞は、非ピノスティック形態を有する核を提示した。胚組織から培養物を調製したことを考えると、細胞の一部はニューロンマーカーをまだ発現しておらず、さらなる成熟を必要とする。これは、MAP2発現が神経成熟とともに増加し、MAP2陽性細胞の数が培養時および解剖時の胚の年齢とともに増加したことを示す以前の研究と一致している。我々は、ニューロングリア培養において、微小グリアマーカーイオン化カルシウム結合アダプタ分子15に対して0.7%の細胞のみが陽性であることを以前に実証した。神経グリア培養に用いられる培養培地はグリア細胞増殖に必要な栄養補助を有するが、15〜16日の胚皮質中のミクログリアの量が減少し、培養時間が短縮されるにつれて、この細胞型の増殖は制限される。ニューロンを豊富に含む培養物についても同様であるが、この場合、グリア細胞の増殖は、培養培地中にHI-FBSが存在しないため、さらに限定的である。
同じ調製物から異なるタイプの培養物を得ることを可能にすることに加えて、ここで述べるプロトコルは他の利点を有する。単細胞懸濁液,は、酵素および機械的消化24、25、31、32の両方を使用する他24,25の方法とは異なり31、32単に機械的消化によって得られる。したがって、それはより速く、より安価です。もう一つの利点は、このプロトコルはまた、海馬や中脳などの他の脳領域からの細胞を調製するために使用することができ、脳の異なる領域に影響を与える病理の研究を可能にすることです。さらに、説明する代替手順は、共培養の確立を可能にし、免疫細胞化学などの方法を用いて共培養中に存在する特定の細胞型において生化学的および形態学的変化の解析を可能にする。共同文化の確立のための一般的なモデルは、トランスウェルシステム24、25、33、3425,33,34です。24パラフィン球体のような小さなスペーサーを用いた共培養系とは対照的に、トランスウェル共培養モデルは共培養に存在する両方の細胞タイプに対して免疫細胞化学を行うことを許さない。また、パラフィン球などのスペーサーを用いた共培養は、シンプルで低コストです。
OGDにニューロンエンリッチ化またはニューロングリア培養物を供与することは虚血に対する一般的なin vitroモデルであり、それにもかかわらず、他のインビトロ法が使用されている、すなわち化学的および酵素的方法またはグルタミン酸3、35,35による興奮毒性の誘導である。他の方法と比較して、OGDは虚血性脳卒中、すなわち酸素およびグルコースの剥奪および再灌流の間に起こる2つの相のシミュレーションを可能にし、これは生体内で起こることを模倣するので利点である。また、化学的および酵素的な方法は、その迅速な応答と適用の容易さのために有用であるかもしれないが、生体内の病理学的状態との関連性に関する懸念があるが、化学低酸素症は、アノクシアよりも多くのフリーラジカル生成につながるので、生体内35で観察されるものを上回る。OGDプロトコルに関しては、実験的要件に達するために、ニューロン喪失につながり、OGD期間の持続時間を変更することによって病変の延長を調整できることを観察した。ニューロンエンリッチ培養およびニューロングリア培養におけるOGD期間後の神経喪失の違いは、アストロサイトが果たす保護的役割によるものと考えられ、それによって神経細胞死を減少させる。
予想通り、ニューロングリア培養におけるアストロサイトへのOGD損傷は、ニューロンと比較して4時間および6時間とも低かった。OGDに対するアストロサイトの抵抗が高いのは、複数の側面に起因する。彼らは虚血の間にニューロンよりも長くATPレベルを維持することができ、重度のイオン調節不全はよりゆっくりと進行する36:まずニューロンはイオンチャネルの密度が高く、その結果、イオン勾配を維持するためのより大きなエネルギー需要を有するため。第二に、脳内のグリコーゲンの店のほとんどがアストロサイト36に見られるので。さらに、アストロサイトはニューロンよりも低レベルの電離性グルタミン酸受容体を発現し、より良いイオン緩衝および抗酸化能36を有する。これらの属性は、おそらくアストロサイト上のニューロンのよく知られた選択的損失の根源である 36.
ここで提案されるプロトコルの限界に関しては、最も重要なのは、in vivoシステムで発生する相互作用の複雑さを欠くインビトロモデルに基づいているため、インビボの状況に対する翻訳性の問題を引き起こす可能性があることです。しかし、細胞培養に関連する利点、すなわち単純性、操作の容易さ、特定の細胞集団が特定の侮辱に対してどのように反応するかについての基本的な詳細な情報を提供する能力を提示する3。病気のin vitroモデルは、インビボモデルよりも時間がかかり、維持コストが低い。より具体的には、虚血性脳卒中のモデリングに関しては、in vitroモデルは、インビボ代替34と比較した場合にグルコースおよび酸素レベルを制御しやすくなるという利点も有する。さらに、より高いレベルの複雑さを与える共培養の使用を提案し、組織に存在する異なる細胞型間の相互作用を研究することを可能にする。
プロトコルを実行する際に、さらに注意が必要な重要な手順がいくつかあります。アストロサイトの栄養要件のために、ニューロングリア培養を得るために使用されるNBMは、HI-FBS含有成長因子、アミノ酸および脂肪酸の10%を補うべきである。この補充はニューロングリア培養とニューロンエンリッチ培養を区別するものです。.アストロサイトを豊富に含む培養物を調製するには、B27などの神経細胞の成長に必要なサプリメントを欠いた培地を使用する必要があります。現在の議定書では、アストロサイトを豊富に含む文化の選挙の媒体はMEMであった。また、異なる細胞タイプのニーズが接触したときに確実に行うことが非常に重要です。この目的のために、アストロサイトおよびニューロンの両方と互換性のある培地、すなわちB27およびHI−FBSを添加したNBMが使用され得る。OGDプロトコルに関しては、主な重要なステップは、OGD期間を開始する前にチャンバーからすべてのO2 を除去し、かつ、培地中に存在するすべてのグルコースを排除するために、グルコースを伴うHBSSを用いた細胞の適切な洗浄である。
結論として、ここでは、簡単で高速で安価で再現可能な方法で確立された虚血性脳卒中を研究するための in vitro モデルを提示します。さらに、記載された方法はまた、ニューロンおよびアストロサイトを豊富に含む一次培養物だけでなく、ニューロングリア培養物を実装することを可能にし、不死化細胞株および純粋な神経細胞またはグリア培養よりも高いレベルの複雑性を有するいくつかの脳疾患をモデル化するための素晴らしい インビトロ モデルを提供する。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、プロジェクトUIDB/00709/2020、POCI-01-0145-FEDER-029311およびフェローシップSFRH/BD/135936/2018を通じて、ファンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジアによる資金援助を認めている。 「プログラム・オペラシオナル・ド・セントロ、セントロ2020」によるプロジェクトCENTRO-01-0145-FEDER-000013、およびプロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-022122を通じてバイオイメージングのPPBI-ポルトガルプラットフォームへの資金提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
