Summary
Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt med hjälp av specifika kulturmedier som möjliggör inrättandet av neuron- och astrocyter-berikade kulturer, eller neuron-glia kulturer från den embryonala cortex, med hög avkastning och reproducerbarhet.
Abstract
Ischemisk stroke är ett kliniskt tillstånd som kännetecknas av hypoperfusion av hjärnvävnad, vilket leder till syre och glukos deprivation, och den därav följande neuronal förlust. Många bevis tyder på att samspelet mellan stödjeceller och neuronala celler utöva positiva effekter efter en ischemisk händelse. Därför, att utforska potentiella skyddsmekanismer, Det är viktigt att utveckla modeller som gör det möjligt att studera neuron-glia interaktioner i en ischemisk miljö. Häri presenterar vi en enkel strategi för att isolera astrocyter och nervceller från råtta embryonala cortex, och att genom att använda specifika kultur media, möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer med hög avkastning och reproducerbarhet.
För att studera överhörning mellan astrocyter och nervceller föreslår vi ett tillvägagångssätt baserat på ett samkultursystem där nervceller odlade i täckliner upprätthålls i kontakt med ett monolayer av astrocyter pläterade i multiwell plattor. De två kulturerna underhålls ifrån varandra av små paraffinsfärer. Detta tillvägagångssätt möjliggör oberoende manipulation och tillämpning av specifika behandlingar på varje celltyp, vilket utgör en fördel i många studier.
För att simulera vad som sker under en ischemisk stroke utsätts kulturerna för ett protokoll för syre- och glukosbrist. Detta protokoll representerar ett användbart verktyg för att studera rollen av neuron-glia interaktioner i ischemisk stroke.
Introduction
Enligt uppgifter från Världshälsoorganisationen, cirka 5,5 miljoner människor dör varje år från ischemisk stroke1. Detta tillstånd kännetecknas av avbrott i blodflödet till en viss hjärnregion, vilket resulterar i en reversibel eller irreversibel förlust i tillförseln av syre och näringsämnen till vävnaden, vilket förändrar vävnadsfunktionen och leder till mitokondriell dysfunktion, kalciumdysreglering, glutamat excitotoxicitet, inflammation och cellförlust2,3.
Bortsett från vaskulära celler, neuronala och gliaceller är inblandade i patofysiologi av den ischemiska stroke4. I synnerhet är astrocyter väsentliga för underhåll av nervceller och nyligen visades spela en avgörande roll i svaret på den ischemiska lesion5. Denna typ av gliacell utför funktioner av strukturellt stöd, försvar mot oxidativ stress, syntes av signalsubstanser, stabilisering av cell-cell kommunikation, bland annat6. Tillsammans med nervceller, astrocyter spelar en direkt roll i synaptisk överföring, reglera frisättningen av molekyler såsom adenosintrifosfat, gamma-aminosmörsyra och glutamat7. En del av den skada som induceras av ischemi orsakas av den överdrivna frisättningen av glutamat och dess ackumulering vid den synaptiska spalten, vilket leder till överaktivering av N-metyl-D-aspartatreceptorer, aktiverande nedströms signalerande kaskader, vilket slutligen resulterar i excitotoxicitet8. Eftersom astrocyter har möjlighet att ta bort glutamat från den synaptiska spalten och omvandla den till glutamin, de är avgörande för att försvara sig mot excitotoxicitet, och därigenom utövar en nervskyddande effekt på ischemi. Dessa celler spelar också en roll i ischemi-inducerad neuroinflammation. Efter den ischemiska förolämpning, aktiverade astrocyterna genomgå morphologic förändringar (hypertrofi), proliferera, och visa en ökning av stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP) uttryck. De kan bli reaktiva (astrogliosis), släppa proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekros faktor-α, interleukin-1α och interleukin-1β, och producerar fria radikaler, inklusive kväveoxid och superoxid, som i sin tur kan framkalla neuronal död9,10. Däremot kan reaktiva astrocyter också spela en nervskyddande effekt, eftersom de släpper antiinflammatoriska cytokiner, såsom omvandla tillväxtfaktor-β, som är uppreglerad efter stroke11. Dessutom kan de generera ett gliavärde ärr, som kan begränsa vävnadsregenerering genom att hämma axonal groning; emellertid kan detta glia ärr isolera skadestället från livskraftig vävnad, vilket förhindrar en kaskadvåg av okontrollerad vävnadsskada12,13.
Således är det absolut nödvändigt att fastställa modeller som tillåter att studera neuron-glia interaktioner under en ischemisk skada i syfte att hitta terapeutiska strategier som begränsar eller vända effekterna av ischemisk skada. Jämfört med andra modeller som används för att studera ischemisk skada, nämligen in vivo modeller 14,15,16, organotypiska kulturer17,18,19 och akut hjärnskivor20,21,22, primära cellkulturer är mindre komplexa, vilket gör det möjligt att studera individuella bidrag av varje celltyp i patofysiologin i ischemisk stroke och hur varje celltyp svarar på möjliga terapeutiska mål. Typiskt, för att studera interaktioner mellan neuron-berikade kulturer och astrocyter-berikade kulturer, nervceller och gliaceller av postnatalt ursprung används23,24, eller postnatala gliaceller och embryonala nervceller25,26. Häri föreslås en enkel metod för att etablera neuron- eller astrocyte-berikade kulturer och neuron-glia kulturer från samma vävnad. Dessa primära celler erhålls från råtta embryonala cortex, en region som ofta påverkas av stroke27,28. Dessutom utförs dissociationen av vävnaden endast genom ett mekaniskt förfarande. Därför tillåter detta protokoll isolera celler i samma utvecklingsstadium, på ett snabbt och billigt sätt, och med hög prestanda och reproducerbarhet.
Överhörningen mellan astrocyter och nervceller kan utforskas med hjälp av en co-kultur system där nervceller odlade i täckplattor upprätthålls i kontakt med ett monolager av astrocyter seedade i multiwell plattor. Små paraffinsfärer kan användas för att säkerställa separationen av de två cellkulturerna. Detta tillvägagångssätt tillåter oberoende manipulation av varje celltyp innan de bringas i kontakt. Det är till exempel möjligt att tysta en specifik gen i astrocyter och se hur den kan påverka den neuronala sårbarheten eller skyddet mot ischemisk-inducerad skada. En etablerad metod för att inducera ischemisk-liknande förhållanden in vitro är syre och glukos deprivation (OGD)3, som består i att ersätta den regelbundna atmosfären (95% luft och 5% CO2) med en anoxic atmosfär (95% N2 och 5% CO2), samband med utelämnandet av glukos.
Den beskrivna metoden är lämplig för att studera interaktionerna mellan nervceller och astrocyter i samband med ischemisk stroke, på ett enkelt, snabbt, reproducerbart och billigt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som användes föddes upp vid CICS-UBI Health Science Research Centre i enlighet med de nationella etiska kraven för djurforskning och med Europeiska konventionen om skydd av ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål (direktiv 2010/63/EU).
1. Råtta embryo cortex primära cell kultur
- Förberedelse för kulturmedium
- Förbered Neurobasal Medium (NBM) genom att tillsätta följande kosttillskott: 2% B27, 0,5 mM glutamin, 25 μM glutamat och 120 μg/mL gentamicin. Homogenisera, justera pH-värdet till 7,2 och sterilisera mediet med ett vakuumfiltreringssteg, med hjälp av ett 0,22 μm-filter. För cellkulturen neuron-glia, komplettera NBM-cellodlingsmediet med 10% av Heat-Inactivated Fetalt bovint serum (HI-FBS).
- Bered mem-mediet (Minimum Essential Medium Eagle) med följande kosttillskott: natriumvätekarbonat 2,2 g/L, insulin från bukspottkörteln hos nötkreatur 5 mg/L, D-glukos vattenfri 3,4 g/L, penicillin (12 U/mL) /streptomycin (12 μg/mL) och 10% HI-FBS. Homogenisera, justera pH-värdet till 7.2 och sterilisera mediet med ett filtreringssteg.
- Beredning av material och utrustning
- Punktera plintdelen av en 1 mL-mikropipettsspets av plast från sida till sida, med hjälp av en nål med en specifik diameter (0,5 mm för S; 0,6 mm för M; 0,8 mm för L) och försegla spetsens öppning med hjälp av en låga.
- Sterilisera alla glas. Under hela dissekering hålla de verktyg som används (t.ex., sax, pincett, skalpell) nedsänkt i 70% etanol. Spraya materialen med 70% etanol innan du går in i dem i laminär flödeskammaren.
- Ställ in vattenbadtemperaturen till 37 °C och placera cellodlingsmediet i vattenbadet innan proceduren påbörjas.
OBS: För immunocytokemi analyser, poly-D-lysinbeläggning bör utföras i multiwell plattor som innehåller täckliner.
- Råtta embryonala cortex kultur
- Ta bort råttembryonen från en wistarråtta hona med 15–16 dagar av dräktigheten (parningens, som bör vara 24 h, anses vara den1:e dagen av den embryonala utvecklingen). För det ändamålet, bedöva honan med ketamin (87,5 mg/kg) och xylazin (12 mg/kg) och ta bort embryona. Sedan avliva honråtta genom livmoderhalscancer störning, efter standardprotokoll.
- Placera embryona i ett 50 mL sterilt rör, tillsätt fosfatbuffertlösning (PBS) tills den täcker embryona och ta dem snabbt till kulturrummet.
- Fortfarande inne i gulesäcken, placera embryona i en Petri-rätt som innehåller 25 mL kall PBS. Med hjälp av sax och pincett, bryta gulesäcken, ta bort embryot och överföra det till en annan Petri-skålen som innehåller också kall PBS. PBS i petriskålen bör räcka för att täcka hela embryot.
OBS: Var försiktig när du öppnar gulesäcken för att undvika att skada embryot. I 1.3.3 och 1.3.4 använde vi 90 mm diameter Petris rätter placerade ovanpå isförpackningar täckta med absorberande papper för att hålla PBS vid låg temperatur. - För dissekering av embryot, överför den till en annan Petri-rätt som innehåller 30 mL kall PBS. Placera embryot under ett dissekerande mikroskop och immobilisera det med hjälp av en pincett. Gör det initiala snittet parallellt med cortex, går från okulär hålighet till slutet av nospartiet och var noga med att inte halshugga djuret.
- Avlägsna försiktigt hårbotten och hjärnhinnorna med hjälp av pincett, för att inte skada den kortikala hjärnvävnaden. Gör nästa snitt för att separera cortex. Överför kortikala vävnaden till ett 15 mL-rör som innehåller 5 mL PBS med hjälp av en Pasteurpipett.
- Utför den mekaniska matsmältningen av den kortikala hjärnvävnaden med hjälp av 1 mL plastspetsar som är förberedda i 1.2.1. Triturate 10 gånger med en vanlig pipett och upprepa processen med hjälp av pipetter med successivt mindre hål (L, M och S), tills bitarna har fallit isär.
- Efter den mekaniska matsmältningen centrifugera fjädringen vid 400 x g i 3 min. Kassera supernatanten och resuspend sedimentet med det lämpliga cellodlingsmediet som tidigare värmts vid 37 °C.
- Bestäm det totala antalet celler som förekommer i cellupphängningen (celltätheten) med hjälp av en Neubauer-kammare, gör lämpliga utspädningar och pläterar cellerna. Den initiala celltätheten definierades baserat på en tidigare studie5.
- För en neuronberikad kultur, använd 0,21 x 106 celler/cm2 som den initiala celltätheten och bibehålla cellerna i NBM odlingsmedium utan HI-FBS.
- För de neuron-glia kulturer använda 0,14 x 106 celler/cm2 som den inledande cellen densitet och underhålla cellerna i NBM odlingsmedium kompletteras med 10% HI-FBS.
- För en astrocyteberikad odling, använd 0,26 x 106 celler/cm2 som den initiala celltätheten och bibehålla cellerna i MEM kompletterat som tidigare angivits.
- Placera cellerna i en inkubator som är satt till 37 °C, 95% O2 och 5% CO2.
OBS: Under längre odlingsperioder ska ett anti-mitotiskt läkemedel såsom 27 μM 5-fluoro-2′-deoxyuridin med 68 μM uridin tillsättas för att dämpa celltillväxten.
2. Samkultursystemet
- Beredning av material
- Värm paraffinet i 150 °C i ett värmeblock i cirka 7 min. Håll vid 150 °C tills förfarandet avslutas. Sedan, med hjälp av en 1 mm diameter sterilt glas Pasteur pipett, lägga till en liten droppe över steriliserade och PDL-belagda täcken. Paraffinsfärerna är oregelbundna, men de har ungefär 2 mm diameter. Sfärerna kommer att göra det möjligt att skilja de två kulturerna åt med ungefär 1,25 mm.
- Eftersom paraffinen inte är steril, placera multiwell med paraffinsfärerna under ultraviolett strålning i 15 min.
- För att etablera samkulturen, överför täckslåen med paraffinsfärerna med hjälp av en pincett som tidigare nedsänkt i 70% etanol i 15 min.
- Samkultur
- När de två kulturerna är klara att använda (dvs. efter 7 dagar i kultur under de förhållanden som nämns i steg 1.3.8), överför nervcellerna seedade i täcksliparna med paraffinsfärer till brunnarna som innehåller astrocyterna.
- 24 h innan de två kulturerna bringas i kontakt, ändra odlingsmediet av nervceller och astrocyter till NBM kompletteras, eller inte, med HI-FBS, beroende på syftet med experimentet.
- Efter att ha placerat båda celltyperna i kontakt, vänta 8-12 h innan du startar de olika stimuli och förfaranden.
OBS: Den schematiska representationen av samkultursystemet visas i figur 1.
3. Syre och glukos deprivation
- Kultur Medium Förberedelse
- För OGD-experimenten, använd Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Förbered HBSS-mediet med följande reagenser: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogenisera och justera pH-värdet till 7.2. Sterilisera mediet genom filtrering.
OBS: Komplettera i förekommande fall HBSS-lösningen med glukos (HBSSglu+), genom att tillsätta 5,56 mM glukos. För kulturer som lämnas till OGD inte komplettera HBSS-mediet med glukos (HBSSglu-).
- För OGD-experimenten, använd Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Förbered HBSS-mediet med följande reagenser: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogenisera och justera pH-värdet till 7.2. Sterilisera mediet genom filtrering.
- OGD-förfarande
- 7 dagar efter sådd cellerna, ta bort odlingsmediet och tvätta två gånger med HBSSglu-. Efter tvätt lägga till HBSSglu- cell odlingsmedium och placera multiwell i hypoxi kammaren.
- Försegla hypoxikammaren och tillsätt en gasmix som innehåller 95% N2/5% CO2 i 4 min med ett flöde av 20 L/min för att avlägsna syret som finns inuti kammaren. Efter detta, stoppa flödet och placera hypoxikammaren i en inkubator vid 37 °C i 4 h eller 6 h, beroende på omfattningen av den avsedda ischemi.
- Efter perioden med OGD, ersätt HBSSglu- medium med lämpligt odlingsmedium för de återstående förfarandena.
OBS: OGD-experimentet syftar till att simulera de in vitro-tillstånd som cellerna lider under en ischemisk händelse, så det är viktigt att intyga att alla medier som använts tidigare tas bort.
4. Immuncytokemi analys
OBS: Utför immunocytokemianalysen enligt tidigare beskriven5.
- Kortfattat, för att karakterisera de olika närkulturerna, inkubera cellerna över natten vid 4 °C med kanin anti-GFAP (1:2000) och mus anti-microtubule-associerat protein 2 (MAP2; 1:500); och därefter 1 h vid rumstemperatur med följande sekundära antikroppar: anti-kanin konjugerad till Alexa Fluor 546 och anti-mus konjugerad till Alexa Fluor 488, båda vid 1:1000 utspädning.
- Märk cellkärnorna genom inkubation med 2 μM Hoechst 33342 i 10 min vid rumstemperatur.
- Mount coverslips i fluorescens monteringsmedium och förvärva bilder på en epifluorescens mikroskop med en 63x förstoring.
5. Statistisk analys
- Expressdata i procent av det totala antalet celler eller i procent av kontrollen och presenteras som medelvärdet ± standardfel för medelvärdet (SEM) för minst 3 oberoende experiment som utförts i tre exemplar.
- Utför statistisk analys med programvara (GraphPad Software Inc., San Diego, t CA), med hjälp av oparade Student's t-test. Resultaten ansågs betydande när värden på p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att karakterisera de kulturer, immuncytokemi för att bedöma antalet celler som uttryckt GFAP eller MAP2, allmänt använda markörer av astrocyter och nervceller (Figur 2), utfördes i varje typ av när kultur. Denna analys visade att astrocyteberikade kulturer presenterade 97% av de celler som uttrycker GFAP (Figur 2A). Angående den neuron-berikade kulturen 78% av cellerna uttryckta MAP2, 4% av cellerna uttryckt GFAP, och 18% av cellerna var både GFAP och MAP2-negativa (Figur 2B). I förhållande till den neuron-glia närkulturen var 49% av cellerna MAP2-positiva, 31% var GFAP-positiva och 20% var negativa för båda markörerna (Figur 2C).
Sju dagar efter upprättandet av den kortikala kulturen, neuron-glia kultur och den neuron-berikade kulturen utsattes för OGD förfarandet, för 4 h eller 6 h. Efter detta förfarande bedömdes antalet MAP2 och GFAP-positiva celler av immunocytochemistry. I neuron-glia-kulturen var förlusten av MAP2-positiva celler 30% och 60% efter 4 h och 6 h av OGD, respektive (Figur 3B), medan förlusten av GFAP-positiva celler var 9% och 17% efter 4 h och 6 h av OGD, respektive (Figur 3C). Angående den neuron-berikade kulturen, var det en minskning med 41% och 64% i antalet MAP2-positiva celler efter 4 h och 6 h av OGD, respektive (Figur 3A). I den neuron-berikade kulturen var dessutom en liten ökning av den skadeförlängning som inducerades av 4 h ogd vid jämförelse med neuron-glia-kulturen (Figur 3A).
Figur 1: Schematisk representation av samkultursystemet.
(A) Astrocyterna var seedade i en multiwell som innehåller PDL-belagda täcks täcken och nervceller var seedade i en multiwell med PDL-belagda täcken som innehåller 3 paraffin sfärer. (B) När de två kulturerna var färdiga att använda, överfördes nervcellerna i täcken med sfärerna till brunnarna som innehåller astrocyterna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av neuron-glia kortikala kultur, neuron-berikad kortikal kultur och astrocyter-berikad kortikala kultur.
Procent av nervceller (MAP2-positiva celler), procent av astrocyter (GFAP-positiva celler), och andel av dubbelnegativa celler (MAP2-negativa/GFAP-negativa celler) vid den7: e dagen i kultur i (A) astrocyte-berikad kultur (B) neuron-berikad kultur och (C) neuron-glia kultur och representativa bilder som visar immunstaining för MAP2 (grön) och GFAP (röd). Det totala antalet celler bedömdes genom att hoechst 33342-märkta atomkärnor kvantifierades med icke- pyknotisk morfologi (blå). På grund av det låga antalet nervceller i den astrocyte-berikade närkulturen, visar den representativa bilden inte MAP2-positiv färgning. Uppgifterna presenteras som medelvärde för ± av 3 oberoende experiment (A) och 6 oberoende experiment (B, C) som utförs i tre exemplar. Bilder förvärvades med en 63x mål. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av neuronal förlust efter en OGD-period.
(A, B) Antal neuroner/fält (MAP2-positiva celler) i en neuron-glia kultur och neuron-berikade kultur och (C) antal astrocyter/fält (GFAP-positiva celler) och representativ bild av MAP2 (grön) och GFAP (röd) immunfärgning i en neuron-glia kultur. Det totala antalet celler bedömdes genom att hoechst 33342-märkta atomkärnor kvantifierades med icke- pyknotisk morfologi (blå). Den neuron-glia och neuron-berikade kulturer lämnades in till syre och glukos deprivation (OGD) under en period av 4 h och 6 h. Uppgifterna presenteras som medelvärde för ± av minst 3 oberoende experiment utförda i tre exemplar. Det totala antalet celler bedömdes genom att hoechst 33342-märkta kärnor kvantifierades. **p < 0.01, ***p < 0.001 och ****p < 0.0001 jämfört med OGD 0 h (unpaired Student's t test) Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden här beskrivs består av astrocyten och neuron isolering från råtta embryonal kortikal vävnad, vilket möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer. Den var anpassad från en tidigare studie av vår grupp5, där kortikala neuronen–glia och neuron-berikade embryonala kulturer isolering beskrevs och de två kulturerna kännetecknas. Använda dessa kulturer, Roque et al. fann att astrocyter spelar en nyckelroll i att svara på en ischemisk skada och föreslår att kommunikationen mellan astrocyter och nervceller är avgörande för neuroprotektion5. I det föreliggande protokollet, förutom beredning av neuron–glia och neuron-berikade kulturer, har vi också möjlighet att få astrocyter-berikade kulturer, som tillåter oss att studera effekten av en ischemisk miljö på de nervceller och astrocyter isolerade eller tillsammans.
Analys av immunocytokemi data visade att 18% av cellerna i den neuron-berikade kulturen och 20% i neuron-glia kulturer var negativa för både MAP2 och GFAP. Dessa celler presenteras atomkärnor med icke-pyknotic morfologi. Med tanke på att kulturerna var beredda från embryonal vävnad, en del av cellerna kan ännu inte uttrycka neuronala markör, behöver ytterligare mognad. Detta är i linje med tidigare studier som visar att MAP2 uttryck ökar med neuronal mognad och att antalet MAP2-positiva celler ökade med tiden i kultur och med åldern på embryona vid tidpunkten för dissekering29,30. Vi har tidigare visat att i neuron-glia kultur endast 0,7% av cellerna var positiva för mikroglial markör joniserad kalcium-bindande adapter molekyl 15. Även om odlingsmediet som används i neuron-glia kulturer har det näringsmässiga stöd som är nödvändiga för glial celltillväxt, är mängden mikroglia i hjärnbarken av embryon med 15-16 dagar minskas och som kulturtiden minskas, är tillväxten av denna celltyp begränsad. Detsamma gäller för neuron-berikade kulturer, men i detta fall tillväxten av gliaceller är ännu mer begränsad på grund av frånvaron av HI-FBS i odlingsmediet.
Förutom att olika typer av kulturer kan erhållas från samma beredning, har protokollet här beskrivs andra fördelar. Den encelliga fjädringen erhålls helt enkelt genom mekanisk rötning, till skillnad från andra metoder som använder både enzymatisk och mekaniskrötning 24,25,31,32; därför är det snabbare och billigare. En annan fördel är att detta protokoll också kan användas för att förbereda celler från andra hjärnregioner, såsom hippocampus eller mellanhjärnan, vilket möjliggör studiet av patologier som påverkar olika områden i hjärnan. Det alternativa förfarande som beskrivs, som tillåter upprättande av samkulturer, möjliggör dessutom analys av biokemiska och morfologiska förändringar som förekommer i specifika celltyper som förekommer i samkulturen genom att använda metoder som immuncytokemi. En vanlig modell för upprättande av samkulturer är transwellsystem24,25,33,34. I motsats till vad som sker med ett samkultursystem med hjälp av små distanser, såsom paraffinsfärerna, tillåter inte transwell-samkulturmodeller att utföra immuncytokemi på båda cellers typer som finns i samkulturen. Dessutom är de samkulturer som använder distanser som paraffinsfärerna enkla och låga kostnader.
Att utsätta neuron-berikade eller neuron-glia kulturer ogd är en vanlig in vitro-modell för ischemi, icke desto mindre andra in vitro-metoder har använts, nämligen kemiska och enzymatiska metoder eller induktion av excitotoxicitet av glutamat3,35. Jämfört med andra metoder tillåter OGD simulering av de två faser som sker under den ischemiska stroke, nämligen berövande av syre och glukos och reperfusion, vilket är en fördel eftersom det härmar vad som sker in vivo. Dessutom, även om kemiska och enzymatiska metoder kan vara användbara på grund av dess snabba svar och enkel tillämpning, det finns en oro med relevansen för in vivo patologiska tillstånd, eftersom kemisk hypoxi leder till mer fria radikaler generation än anoxi, överträffar vad som observeras in vivo35. Angående OGD-protokollet observerade vi att det leder till neuronal förlust och att förlängningen av lesionen kan justeras genom att ändra varaktigheten av OGD-perioden, för att nå de experimentella kraven. De skillnader som observerats i neuronal förlust efter OGD perioden i neuron-berikade kulturer och neuron-glia kulturer kan bero på den skyddande roll som spelas av astrocyter, vilket dämpar neuronal död.
Som väntat, OGD skador på astrocyter i neuron-glia kulturer var lägre vid både 4 h och 6 h när man jämför med nervceller. Den högre resistensen av astrocyter till OGD tillskrivs flera aspekter. De har möjlighet att upprätthålla ATP-nivåer längre än nervceller under ischemi, och svår jonisk dysreglering fortsätter långsammare36: för det första eftersom nervceller har högre densitet av joniska kanaler och en därav större energi efterfrågan att upprätthålla joniska lutningar; och för det andra eftersom de flesta av glykogen butikerna i hjärnan finns i astrocyter36. Dessutom, astrocyter uttrycka lägre nivåer av jonomtropiska glutamatreceptorer än nervceller och har bättre joniska buffring och antioxidant kapacitet36. Dessa attribut ligger förmodligen till grund för den välkända selektiva förlusten av nervceller över astrocyter36.
När det gäller begränsningarna i det protokoll som föreslås här är det mest betydelsefulla att det bygger på en in vitro-modell som saknar komplexiteten i de interaktioner som uppstår i ett in vivo-system, vilket kan orsaka omräkningsproblem till en in vivo-situation. Det presenterar dock fördelar i samband med cellkulturer, nämligen enkelhet, enkel manipulation, förmågan att ge grundläggande detaljerad information om hur en specifik cellpopulation svarar på en viss förolämpning3. In vitro-modeller av sjukdom är mindre tidskrävande och billigare att underhålla än in vivo modeller. Mer specifikt, för modellering av ischemisk stroke, en in vitro-modell har också fördelen av att vara lättare att kontrollera glukos och syre nivåer jämfört med in vivo alternativ34. Vidare föreslår vi också användning av samkulturer, vilket kan ge en högre nivå av komplexitet, vilket gör det möjligt att studera samspelet mellan olika celltyper som finns i en vävnad.
Det finns några kritiska steg som kräver ytterligare uppmärksamhet vid körning av protokollet. På grund av det näringsmässiga kravet på astrocyter, bör NBM som används för att erhålla neuron-glia kulturer kompletteras med 10% av HI-FBS-innehållande tillväxtfaktorer, aminosyror och fettsyror. Detta tillskott är vad som skiljer neuron-glia kulturen från den neuron-berikade kulturen. För att förbereda en astrocyte-berikad kultur ett medium saknar kosttillskott som krävs för neuronal tillväxt, såsom B27, bör användas. I det nuvarande protokollet var det medium för val för astrocyte-berikade kulturen MEM. Det är också mycket viktigt att de olika celltypernas behov säkerställs när de tas i kontakt. För detta ändamål kan ett odlingsmedium som är kompatibelt med både astrocyter och nervceller, nämligen NBM kompletterat med B27 och HI-FBS, användas. Angående OGD-protokollet är de viktigaste kritiska stegen avlägsnandet av alla O2 från kammaren innan ogd-perioden påbörjas, och korrekt tvättning av cellerna med HBSS utan glukos, för att eliminera all glukos som finns i mediet.
Sammanfattningsvis, här presenterar vi en in vitro-modell för att studera den ischemiska stroke som fastställts på ett enkelt, snabbt, billigt och reproducerbart sätt. Dessutom, den metod som beskrivs gör det också möjligt att genomföra neuron- och astrocyter-berikade primära kulturer men också neuron-glia kulturer, vilket ger en stor in vitro-modell för modellering av flera hjärnsjukdomar, med en högre nivå av komplexitet än förevigade cellinjer och ren neuronala eller glial kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansieringsstödet genom Fundação para a Ciência e a Tecnologia through Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 och stipendium SFRH/BD/135936/2018 till JP, genom ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" genom projektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 och finansiering till PPBI-Portugisiska plattformen för bioimaging genom projektet POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
