Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الهيكل العظمي تحليل النمط الظاهري لنموذج ماوس حذف Stat3 الشرطي

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة قانونية لفهم الجينات الحرجة التي تتحكم في نشاط العظام في الجسم الحي. يستخدم هذا الأسلوب نموذج الماوس المعدلة وراثيا وبعض التقنيات الكنسي لتحليل النمط الظاهري الهيكل العظمي.

Abstract

نماذج الماوس المعدلة وراثيا قوية لفهم الجينات الحرجة التي تتحكم في التمايز والنشاط العظمي، ولدراسة الآليات والعلاجات الصيدلانية لهشاشة العظام. وقد استخدمت الفئران كاثيبسين K (Ctsk) - كري على نطاق واسع للدراسات الوظيفية من العظام. محول الإشارة والمفعل للنسخ 3 (STAT3) وثيق الصلة في التوازن العظمي ، ولكن دوره في العظام في الجسم الحي لا يزال غير محدد بشكل جيد. لتوفير الأدلة في الجسم الحي أن STAT3 يشارك في التمايز العظام والتمثيل الغذائي العظام, نحن ولدت نموذج الماوس حذف Osteoclast محددة Stat3 (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre)وتحليل النمط الظاهري الهيكل العظمي. المسح المقطعي الدقيق وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد يعني زيادة كتلة العظام في الفئران بالضربة القاضية المشروطة. تم إجراء تلطيخ H & E ، كالسين و alizarin الأحمر تلطيخ مزدوج ، و تلطيخ حمض مقاوم للطرطرات (TRAP) للكشف عن استقلاب العظام. باختصار، يصف هذا البروتوكول بعض الأساليب والتقنيات الكنسية لتحليل النمط الظاهري الهيكلي ودراسة الجينات الحرجة التي تتحكم في نشاط العظام في الجسم الحي.

Introduction

عظم الهيكل العظمي هو الجهاز الرئيسي الحامل لجسم الإنسان وتحت ضغط من كل من البيئة الداخلية والخارجية أثناء المشي وممارسةالرياضة 1. طوال حياة المرء، تمر العظام باستمرار من خلال التجديد الذاتي، الذي يوازنه العظام والعظام. عملية osteoclasts تطهير العظام القديمة والعظام تشكيل العظام الجديدة يحافظ على التوازن والوظيفة الميكانيكية للنظام الهيكل العظمي2. اضطراب في التوازن قد تحفز أمراض التمثيل الغذائي العظام, مثل هشاشة العظام. هشاشة العظام، التي تسببها النشاط العظمي الزائد، هو السائد عالميا ويسبب خسائر اقتصادية كبيرة للمجتمع2،3،4. وفقا لعدد محدود من الأدوية المتاحة لعلاج هشاشة العظام وخطر الآثار السلبية4، من المهم الكشف عن تفاصيل تكوين وأنشطة العظام.

والعظام المستمدة من النسب أحادية / الضامة الدموية لها نواة متعددة (قد يكون 2-50 نواة) وكبيرة (عادة أكبر من 100 ميكرومتر في القطر)2. على الرغم من أن استكشاف الآليات وفحص الأدوية لاضطرابات العظام قد تحسنت على نطاق واسع عن طريق ثقافة العظام في المختبر، وردود الفعل العضوية المعقدة تجعل في الأدلة الحية لا غنى عنه للعلاج المستهدف. نظرا لأوجه التشابه الجينية والفيزيولوجية المرضية بين الفئران والبشر ، تستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا بشكل شائع لدراسة الآليات والعلاجات الصيدلانية للأمراض البشرية في الجسم الحي6. نظام Cre-loxP هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحرير جينات الماوس ومكن الباحثين من التحقيق في وظائف الجينات بطريقة خاصة بالأنسجة / الخلايا5. كاثيبسين K (CSTK) هو بروتياز السيستين التي تفرزها osteoclasts التي يمكن أن تتحلل الكولاجين العظام8. ومن المقبول جيدا أن CTSK يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في العظام الناضجة. لذلك ، تعتبر فئران Ctsk-Cre أداة مفيدة للدراسات الوظيفية لأجهزة تقويم العظام وقد تم استخدامها6.

محول الإشارة والمفعل للنسخ (STAT) الأسرة الكلاسيكية وكبيرة للغاية في الحصانة وتطور السرطان والتنمية7،8. من بين سبعة STATs ، STAT3 أفيد أن تكون الأكثر صلة التوازن العظام9،10. وأفادت عدة دراسات في الجسم الحي أن تعطيل محددة من STAT3 في العظام يقلل من تكوين العظام9،10. ومع ذلك، لا تزال الأدلة الصلبة المتعلقة بمشاركة STAT3 في تشكيل العظام واستقلاب العظام في الجسم الحي محدودة. في الآونة الأخيرة، قدمنا في الأدلة في الجسم الحي مع نموذج الماوس حذف Osteoclast محددة Stat3 (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, فيما يلي يسمى Stat3Ctsk) أن STAT3 يشارك في التمايز العظام والتمثيل الغذائي العظام11. في هذه الدراسة، ونحن نصف الأساليب والبروتوكولات التي استخدمناها لتحليل التغيرات في كتلة العظام، وأنسجة العظام، واستقلاب العظام وحفز الفئران Stat3Ctsk من أجل دراسة تأثير حذف STAT3 العظام محددة على التوازن العظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الطرق المتعلقة بالحيوانات الموصوفة هنا وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة لكلية الطب بجامعة جياوتونغ في شنغهاي.

1. تربية الفئران حذف Osteoclast محددة Stat3

ملاحظة: تم الحصول على فئران ستات3fl/fl تجاريا. تم توفير فئران Ctsk-Cre من قبل س. كاتو (جامعة طوكيو، طوكيو، اليابان12). وقد ولدت الفئران وحافظت عليها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في المرفق الحيواني المؤسسي في ظل ظروف موحدة.

  1. إقران فأر ذكر ناضج جنسيا مع فأرين من نفس العمر. بعد 18 يوما، تحقق من الفحوص اليومية للمواليد الجدد. فصل الفئران الإناث الحوامل والاحتفاظ بها وحدها إذا لزم الأمر. تغيير الفئران الذكور بين أقفاص تربية مختلفة إذا الفئران الإناث لم تكن حاملا في غضون 1 شهر من الاقتران.
  2. عبر Stat3فلوريدا / فلوريدا الفئران إلى الفئران Ctsk - كري (F0). قص ذيول ل genotyping والحفاظ على الذكور Stat3fl /+؛ فئران Ctsk-Cre حتى تصبح ناضجة جنسيا ، والتي تبلغ حوالي 6 أسابيع من العمر (F1). استخدم التمهيديات التالية: Stat3 F-TTGACCTGTGCCTACAAAAA; ستات3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; (كتسك-كر ر-جكاتاكاكغغتتك)88
  3. عبر 6 أسابيع من العمر Stat3الذكورfl/+; فئران Ctsk-Cre مع فئران ستات3fl/fl الأنثوية. قص ذيول ل genotyping والحفاظ على الذكور Stat3 fl/fl; فئران Ctsk-Cre حتى تصبح ناضجة جنسيا ، والتي تبلغ حوالي 6 أسابيع من العمر (F2).
  4. عبر 6 أسابيع من العمر Stat3 الذكور fl/fl; فئران Ctsk-Cre مع فئران ستات3fl/fl أنثى (F3). قص ذيول ل genotyping واستبدال الفئران تربية القديمة مع الفئران الأصغر سنا في الوقت المناسب (F3 + N).

2. جمع العينات

  1. القتل الرحيم ستة أزواج من الذكور 8 أسابيع من العمر Stat3fl/fl وStat3Ctsk الفئران littermate بشكل منفصل مع اختناق ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: معدل تدفق ثاني أكسيد الكربونيزيح 30٪ من حجم القفص في الدقيقة (على سبيل المثال، لمدة 45 سم × 30 سم × 30 سم قفص معدل تدفق CO2 هو 40 لتر/دقيقة).
  2. ضع الفئران في وضعية غير نازعة. خلع المفاصل الورك الثنائية بلطف باليد. استخدم مقص العيون لقطع الجلد عموديا عن الساق البعيدة ثم تشريح الجلد بأكمله من الطرف الخلفي.
  3. قطع الرباط المفصلي لمفصل الورك الأيمن ومفصل الركبة بمقص لفصل الطرف الخلفي. قطع trochanter وتقاطع الشظية ومن ثم تزج الطرف الخلفي في 4٪ paraformaldehyde. احتفظ بالأطراف الخلفية اليمنى للخطوة 3. قطع العظام بشكل مناسب في كلا الطرفين لتزج تماما وإصلاح نخاع العظام مع 4٪ بارافورمالديهايد.
  4. قطع الرباط المفصلي مفصل الورك الأيسر ومفصل الركبة مع مقص، وإزالة بلطف الأنسجة الرخوة، وفصل بعناية الساق وعظم الفخذ. تزج الساق وعظم الفخذ بشكل منفصل في الإيثانول 75٪. الحفاظ على femora للخطوة 4 وtibiae للخطوة 6. تأكد من الحفاظ على trochanter سليمة.

3. إعداد قسم البارافين

  1. إصلاح الطرف الخلفي الأيمن في 4٪ بارافورمالديهايد في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. الشارات: غسل بلطف العينات مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 10 دقيقة 3 مرات. تشارات العينات في EDTA 15٪ (150 ز EDTA في 800 مل من DDH2O و 100 مل من 10x PBS) مع الشارات بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 إلى 4 أسابيع حتى يمكن أن تكون عازمة العظام. استبدال مع السوائل الشارات الطازجة كل يومين.
  3. غسل بلطف العينات 3x مع برنامج تلفزيوني 1x ومن ثم تزج بها في الإيثانول 75٪ في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. الجفاف: في اليوم الثاني، تزج عينات بالتسلسل في الإيثانول 95٪، الإيثانول 100٪، والزيلين، كل لمدة 1 ساعة مرتين.
  5. تزج العينات في 1/2 xylene 1/2 البارافين لمدة 30 دقيقة. تزج العينات في البارافين في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  6. تضمين: حدد خزان تضمين مناسب لتضمينه. ضع الساق بشكل موحد تحتها. ضع عظم الفخذ والساق بزاوية 90 درجة. بعد أن يبرد البارافين ويتماسك تماما ، قم بإزالتها من خزان التضمين. قم بإعادة العينات وتخزينها عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  7. قطع 5 ميكرومتر أقسام سميكة باستمرار باستخدام microtome. قطع 20-40 أقسام. نشر المقاطع على 37 درجة مئوية من المياه، والتمسك بها إلى الشرائح المجهر، وخبز في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

4. التصوير المقطعي الدقيق والتحليل

  1. مسح femora الأيسر مع الماسح الضوئي المقطعي الدقيق. القرار: 10 ميكرومتر؛ الجهد: 70 كيلو فولت؛ الحالي: 114 ميكروا؛ فليتر: 0.5 ملم آل؛ خطوة الدوران: 0.5 درجة.
  2. إعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد للعظم القشري والعظام الطرية باستخدام برنامج دعم الماسح الضوئي بناء على تعليمات الشركة المصنعة. ROIs هي في مجموع 1 مم عرض العظام trabecular قريبة من لوحة نمو النعزال وفي قسم إجمالي 1 ملم واسعة من العظام القشرية في منتصف femora.
  3. حساب المعلمات الميكروبيكتات الكمية: كثافة المعادن العظام (BMD)، كسر حجم العظام (BV/TV)، سمك trabecular (Tb.Th)،رقم trabecular (Tb.N.)، فصل ترابيكي (Tb.Sp.)، وسماكة العظام القشرية (Ct.Th. ).

5. TRAP تلطيخ

  1. خبز أقسام البارافين في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. Dewax: تزج المقاطع في إكسيلين لمدة 10 دقيقة. تنفيذ هذه الخطوة 3x مع xylene الطازجة.
  3. ريهيدرات: تزج المقاطع بالتسلسل في الإيثانول 100٪، 95٪ الإيثانول، 70٪ الإيثانول، وDDH2O، كل لمدة 5 دقائق مرتين.
  4. قم بإعداد محلول التلطيخ باستخدام مجموعة تلطيخ TRAP باتباع تعليمات الشركة المصنعة ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب إعداد حل تلطيخ TRAP طازجا قبل كل فحص مباشرة.
  5. أضف محلول تلطيخ 50-100 ميكرولتر لكل عينة واحتضنها في غرفة رطبة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تحقق من حالة تلطيخ العظام تحت المجهر الخفيف كل 5 دقائق حتى يمكن رؤية العظام الحمراء متعددة النوى. إنهاء رد الفعل مع DDH2O.
  6. مضادة في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 30 s. خلق لون أزرق مستقر عن طريق الغمر في محلول الأمونيا 1٪ لمدة 1 دقيقة. شطف في مياه الصنبور الجارية ببطء.
  7. جبل المقاطع مع coverlips باستخدام البلسم محايدة وجافة بين عشية وضحاها.
  8. التقاط 3-5 مجالات الاهتمام عن طريق المجهر. تحليل محيط trabecular بواسطة صورة J: قياس طول شريط مقياس (Ls) باستخدام'خط مستقيم'أداة كما L1، ثم قياس طول محيط trabecular باستخدام 'خط مجزأ' أداة كما L2، وطول المادية (Lp)= Ls * L2 / L1). عد عدد الخلايا الإيجابية TRAP مع أكثر من ثلاث نواة.

6. Calcein و alizarin الأحمر المزدوج وضع العلامات

  1. إعداد العينة: حقن Intraperitoneally 20 ملغ / كجم كالسين (1 ملغ / مل في 2٪ NaHCO3 الحل) في اليوم 0، و 25 ملغ / كجم alizarin الأحمر S (AL، 2 ملغم / مل في H2O) في اليوم 4. تضحية الفئران في اليوم السابع فصل بعناية الساق وإصلاح في 4٪ بارافورمالديهايد في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. الجفاف: بعد التثبيت، اغسل الساق بلطف 3x مع برنامج تلفزيوني 1x. تزج بشكل متتابع العينات في الإيثانول 95٪ ، الإيثانول 100 ٪ ، والزيلين لمدة 5 دقائق مرتين على حدة.
  3. تزج العينات في الأسيتون لمدة 12 ساعة، في 1/2 الأسيتون راتنج لمدة 2 ساعة، وفي الراتنج النقي في فرن التجفيف بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تم إعداد الراتنج بواسطة الراتنج المتاح تجاريا (على سبيل المثال، تضمين 812 Resin) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. تضمين: إضافة الراتنج النقي في خزان السيليكا هلام مناسبة تضمين ووضع العينات بلطف لتجنب فقاعات. بلمرة الراتنج في فرن التجفيف في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  5. قطع العينات إلى أقسام سميكة 5 ميكرومتر باستمرار مع microtome الدوارة. تخزين بقية العينات مع المجففة في درجة حرارة الغرفة.
  6. الالتزام المقاطع مع ملاقط في انخفاض الكحول 75٪. قم بتركيب المقاطع ذات الأغطية باستخدام البلسم المحايد. التقط ملصقات الفلورسينس الحمراء والخضراء باستخدام مجهر مضان.
  7. قياس العرض بين خطين وضع العلامات (Ir.L.Wi) ، ومحيط trabecular واحد المسمى (sL.Pm) ، محيط trabecular مزدوج المسمى (dL.Pm) ، ومحيط trabecular الكلي (Tb.Pm). حساب معدل التجاور المعدني (MAR) ومعدل تكوين العظام (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/أيام الفاصل الزمني. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.pm*100٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول ، تم إنشاء فئران حذف Stat3 محددة لدراسة تأثير حذف STAT3 على تمايز العظام. تم تربية فئران Stat3Ctsk وزميلات القمامة الخاصة بهم (WT) والاحتفاظ بها بعد الكتابة الجينية. تم عزل الضامة نخاع العظم ومثقفة في osteoclasts، وأظهر حذف STAT3 في الفئران Ctsk Stat3 (الشكل 1).

وأشار فيمورا إعادة الإعمار والتحليل الكمي من قبل الأشعة المقطعية الدقيقة إلى أن كتلة العظام من الفئران Ctsk Stat3 تمت زيادة مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2).

تم فحص Histomorphology من femora من WT و Stat3Ctsk الفئران عن طريق تلطيخ H &؛ E (الشكل 3).

تم الكشف عن النشاط العظمي في الفئران عن طريق تلطيخ TRAP. وكانت Osteoclasts TRAP+ (النبيذ الأحمر أو الأرجواني) الخلايا مع نواة متعددة وحجم ضخم(الشكل 4A). كان عدد TRAP+ osteoclasts أقل في فئران Stat3Ctsk مقارنة لفئران WT (الشكل 4B) ، مما يشير إلى أن نقص STAT3 يضعف تكوين العظام.

ويمثل تكوين العظام في الفئران من قبل معدل apposition المعدنية (MAR) وكان يقاس من قبل calcein وalizarin الأحمر المزدوج وضع العلامات(الشكل 5). كالسين واليزارين الأحمر تم حقنها بشكل متسلسل intraperitoneally. لذلك ، فإن المنطقة بين خطوط الفلورسين الحمراء (الخضراء) والعليزارين تمثل العظام التي تشكلت حديثا على مدى أربعة أيام. كما هو مبين في الشكل 5, حذف STAT3 في osteoclasts لم يؤثر على استقلاب العظام.

Figure 1
الشكل 1: توضيح من osteoclast محددة Stat3 حذف نموذج الماوس جيل والفئران المعدلة وراثيا. (أ)مخطط تخطيطي لحذف Stat3 في الكاثيبسين K (Ctsk) - التعبير عن osteoclasts عبر نظام Cre-loxP. (ب) تقدم تربية الفئران حذف Osteoclast محددة Stat3. Stat3fl/fl تم عبور الفئران إلى فئران Ctsk-Cre (F0) لتوليد heterozygous Stat3fl/+; فئران Ctsk-Cre (F1). ذكر Stat3fl/+; تم الاحتفاظ Ctsk-Cre الفئران وعبرت إلى أنثى Stat3فلوريدا / فلوريدا الفئران لتوليد homozygous Stat3fl/fl; فئران Ctsk-Cre (F2). ذكر Stat3fl/fl; تم الاحتفاظ Ctsk- كري الفئران وعبرت إلى الفئران الإناث Stat3fl/fl لتوليد Stat3fl/fl; فئران Ctsk-Cre والفئران Fl/fl Stat3. (ج) Genotyping لمختلف الأنماط الجينية للفئران. Stat3 متحولة: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) لطخة غربية من STAT3 في osteoclasts المستزرعة مع الضامة نخاع العظم من Stat3fl/fl وStat3Ctsk الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعادة البناء ثلاثي الأبعاد وتحليل المعلمات الميكروبيرشيتيتور الكمي في فيمورا للفئران باستخدام المسح المقطعي الدقيق. أ)ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤها صور الأشعة المقطعية الدقيقة من العظام trabecular من femora من 8 أسابيع من العمر WT وStat3Ctsk الفئران. كانت منطقة الاهتمام (ROI) في عرض إجمالي 1 مم من العظام التربيكية بالقرب من لوحة نمو النعزال. (ب) 3D أعيد بناؤها الصور المقطعية الدقيقة من العظام القشرية من femora من 8 أسابيع من العمر WT وStat3Ctsk الفئران. وكان العائد على الاستثمار في قسم إجمالي 1 ملم واسعة من العظام القشرية من منتصف femora. (C-H) معلمات الميكروبيكتات الكمية للمجهر المحوسب: كثافة المعادن في العظام (BMD)، كسر حجم العظام (BV/TV)، سمك التربيكي (Tb.Th)، الرقم التربيكي (Tb.N.)، الفصل التربيكي (Tb.Sp.)، وسماكة العظام القشرية (Ct.Th). تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± SD، n= 4، *P<0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: علم الأشكال من femora من WT والفئرانCtsk Stat3عرضت عن طريق تلطيخ H &؛ E. يشير منحنى منقط على شكل حرف M إلى طبقة غضروف. حقل عالي الطاقة نسبيا من العظام القشرية محاصر بخطوط منقطة ويظهر أدناه. ويدور حقل عالي الطاقة النسبي للعظم الطري مع خطوط منقط وعرضها في الجزء السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تكوين العظام في femora من الفئران ممثلة عن طريق تلطيخ TRAP. (أ) TRAP تلطيخ femora من الفئران WT وCtt3Ctsk 8 أسابيع. يشار TRAP+ osteoclasts متعددة النوى من قبل مثلثات سوداء. يتم عرض حقل عالي الطاقة نسبيا من أجهزة تقويم العظام محاطة بخطوط منقطة أدناه ، مما يدل على نواة متعددة وحجم ضخم. (ب)تم حساب أعداد TRAP+ osteoclasts متعددة النوى. تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± SD، n= 5، *P<0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تكوين العظام في femora من الفئران ممثلة عن طريق كالسين واليزارين الأحمر المزدوج وضع العلامات. (أ)تم حقن الفئران التي يبلغ عمرها سبعة أسابيع بالتتابع بالكالسين في اليوم 0 ، مع أحمر أليسارين في اليوم الرابع ، ثم تم التضحية بها في اليوم السابع. تمثل المنطقة الواقعة بين الكالسين (الأخضر) وخطوط الفلوريس الأحمر (الأحمر) التي تشكلت حديثا العظام القشرية على مدى أربعة أيام. (ب) معدل التباعد المعدني (MAR) ومعدل تكوين العظام (BFR / BS) المحسوبة على مسافة الخطين تمثل النشاط العظمي للعظم القشري. (ج)تمثل المنطقة الواقعة بين خطوط الفلورسين (الأخضر) والعليزارين الأحمر (الأحمر) العظام الترابية التي تم تشكيلها حديثا في أربعة أيام. (D) MAR و BFR / BS تمثل النشاط العظمي للعظم الطري. تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± SD، n= 5، *P<0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا عادة لدراسة آلية والعلاج الصيدلاني للمرض البشري13. وقد استخدمت على نطاق واسع Ctsk-Cre الفئران للدراسات الوظيفية من osteoclasts6. وصفت هذه الدراسة بروتوكولات طرق تحليل النمط الظاهري الهيكلي ودراسة الجينات الحرجة التي تتحكم في نشاط العظام في الجسم الحي.

التحليل النسيجي هو أفضل طريقة بديهية للكشف عن استقلاب العظام. ونوعية أقسام البارافين هي قاعدة التحليل النسيجي. الوقت الكافي لتثبيت كامل وشارات من أنسجة العظام أمر ضروري للغاية لأن أنسجة العظام يمكن أن تكون مجزأة. يجب على الباحثين الذين يركزون على عظم الفخذ والساق وضع عظم الفخذ والساق بزاوية 90 درجة في خطوة التضمين. من أجل إجراء تحليل النسيج موثوقة وعالية الجودة، اخترنا أقسام البارافين القوس التي كانت طبقة الغضاريف متناظرة وأظهرت خط واضح على شكل M في تلطيخ H &؛ E، والذي يمثل زاوية مناسبة وعمق تلك المقاطع المستمرة. من ناحية أخرى، إذا كنت بحاجة إلى مراقبة مفاصل الركبة والرباط المفصلي المجاور، يجب وضع عظم الفخذ والساق بزاوية 120 درجة.

وقد خدم TRAP لعقود كعلامة بيوكيميائية لوظيفة osteoclast14، لأنه يعبر عنه في الغالب في osteoclasts15،16. وعادة ما تستخدم اثنين من الركائز لتقييم نشاط الفوسفاتاز الحمضي. نابيثول-ASBI فوسفات (N-ASBI-P) هو ركيزة ممتازة لISOFORM TRAP 5b الخاصة بالعظام. ومع ذلك، يمكن أيضا أن يكون الفوسفات شبه نيتروفينيل (pNPP) متحللة من قبل غير نوع 5 TRAPs17. ولذلك، فإن طريقة naphthol-ASBI حمض الفوسفوريك-باراروسانيلين للمظاهرة الهستوكيميائية من TRAP محددة للغاية في أقسام الأنسجة17،18،19. الفوسفاتاز الضام (حمض فوسفاتاز) لديه درجة الحموضة الأمثل من 5.0-6.0، والتي هي في الغالب مقاومة طرطرات20. وهكذا، نوصي بأن في بروتوكول الفحص TRAP تلطيخ، وأقسام الأنسجة إعادة ملطخة بالهيماتوكسيلين لا ينبغي أن يكون decolored مع حمض الهيدروكلوريك. الأهم من ذلك، على الرغم من أن osteoblasts وخلايا العظام قريبة من مناطق إعادة عرض العظام تعبر أيضا TRAP21،فقط الخلايا الإيجابية TRAP ضخمة مع أكثر من ثلاثة نواة اعتبرت كما osteoclasts. في هذه الدراسة، أظهرت الفئران Stat3Ctsk نشاط osteoclast تثبيط (الشكل 4).

كالسين هو الفلوروشروم (الفلورسينس الأخضر) الذي يستخدم على نطاق واسع للإشارة إلى نمو الهيكل العظمي أثناء التكلس. يمكن ربط الكالسيوم ودمجها في بلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت حديثا22. وبالمثل ، تم بناء كالسين ، أليزارين الأحمر (مضان أحمر) ، والتتراسيكلين (الفلورسينس الأصفر) في العظام لتقدير النمو من وقت التعرض23،24. وقد استخدمت العديد من الدراسات في الماضي الفلوروشرومات واحدة (عادة كالسين) لتسمية العظام، ولكن يمكن بسهولة الخلط بين المراقبين العظام التي تشكلت حديثا والعظام القديمة، وخاصة في العظام trabecular غير النظامية. لذلك، نقترح أن يقوم الباحثون بحقن نوعين مختلفين من الفلوروشروم في الفئران لتمييز العظام الأحدث عن العظام القديمة. وفقا لاختباراتنا، قد كالسين مقرونة أليسارين تحقيق التباين الأكثر كفاية ودائمة. في هذه الدراسة، تم استخدام الوسم الأحمر كالسين-أليزارين للكشف عن معدل العظام من أنسجة العظام واتضح أن نشاط العظام لم يتأثر في الفئران ستات3Ctsk (الشكل 5).

باختصار، لفهم الجينات الحرجة التي تتحكم في نشاط العظام، يصف هذا البروتوكول طريقة قانونية لتوليد نموذج فأرة معدل وراثيا. يصف هذا البروتوكول أيضا بعض التقنيات النموذجية لتحليل النمط الظاهري الهيكلي. في هذه الدراسة، وحذف STAT3 ضعف تشكيل العظام وزيادة كتلة العظام. قد تكون هذه التقنيات مثيرة للاهتمام بالنسبة لأولئك الذين هم جديدة على أبحاث الأنسجة الهيكلية. ومع ذلك ، فإن المزيد من خصائص نظام الهيكل العظمي تهتم بمزيد من الدراسة ، مثل الممتلكات الميكانيكية25. ونحن دائما بحاجة إلى إبقاء العين على تطوير تقنيات جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر البروفيسور ويغو زو و س. كاتو على الكواشف والفئران وأعضاء مختبر زو على المناقشات المفيدة. كما نشكر مختبر أمراض الفم الرقمية ومركز البحوث للتشوهات القحفية الوجهية في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي على المساعدة. وقد دعم هذا العمل جزئيا بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [81570950,81870740,81800949], شنغهاي قمة وهضبة التخصصات، صندوق SHIPM-mu من معهد شنغهاي للطب الدقيق، شنغهاي مستشفى الشعب التاسع، شنغهاي جياو تونغ كلية الطب جامعة [JC201809]، المشروع الحافز لفريق الابتكار رفيع المستوى لكلية الطب في جامعة جياو تونغ شنغهاي ، صندوق البحوث متعددة التخصصات في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ [JYJC201902]. و ل. ج. هو باحث في برنامج تنمية الشباب المتميز للمواهب الطبية للشباب، وبرنامج شنغهاي "النجوم الصاعدة للمواهب الطبية" لتنمية الشباب، ومشروع "تشن شينغ" من جامعة جياوتونغ في شنغهاي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  4. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
  5. Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
  6. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  7. Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
  8. Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
  9. Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
  10. Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
  11. Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
  12. Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
  13. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
  14. Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
  15. Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
  16. Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
  17. Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
  18. Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
  19. Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
  20. Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
  21. Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
  22. Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
  23. Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
  24. Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
  25. Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 161، النمط الظاهري الهيكلي، استقلاب العظام، وضع العلامات، أوستيوكلاستس، STAT3، الفئران المعدلة وراثيا
الهيكل العظمي تحليل النمط الظاهري لنموذج ماوس حذف <em>Stat3</em> الشرطي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,… More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter