Summary
このプロトコルは、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を理解するための正規的方法を記述する。この方法は、トランスジェニックマウスモデルといくつかの正規の手法を用いて骨格表現型を分析する。
Abstract
トランスジェニックマウスモデルは、破骨細胞の分化と活性を制御する重要な遺伝子を理解し、骨粗鬆症のメカニズムと薬学的治療法を研究するのに強力です。カテプシンK(Ctsk)-クレマウスは、破骨細胞の機能研究に広く使用されています。転写3(STAT3)のシグナルトランスデューサおよび活性化剤は骨恒常性に関連しているが、生体内の破骨細胞におけるその役割は未定のままである。STAT3が破骨細胞分化と骨代謝に関与しているというインビボの証拠を提供するために、我々は、破骨細胞特異的Stat3欠失マウスモデル(Stat3 fl/fl;Ctsk-Cre)を、骨格表現型を分析した。マイクロCTスキャンと3D再構成は、条件付きノックアウトマウスにおける骨量の増加を暗示した。H&E染色、カルセインおよびアリザリンレッド二重染色、および酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)染色を行い、骨代謝を検出した。つまり、このプロトコルは、骨格表現型を分析し、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を研究するためのいくつかの正規の方法と技術を記述する。
Introduction
骨格骨は人体の主な荷重を受ける器官であり、歩行と運動1の間に内部環境と外部環境の両方から圧力を受けている。骨は骨芽細胞と破骨細胞のバランスが取れた自己再生を通り抜け続ける。破骨細胞が古い骨を除去し、骨芽細胞が新しい骨を形成する過程は、骨格系2の恒常性および機械的機能を維持する。バランスの乱れは骨粗鬆症などの骨代謝性疾患を誘発しうる。骨粗鬆症は、過剰な破骨活性によって引き起こされ、世界的に流行しており、社会2、3、4に大きな経済的損失を引き起こす。骨粗鬆症治療に利用できる限られた数の薬物と副作用のリスク4によると、骨細胞形成および活動の詳細を明らかにすることが重要である。
単球/マクロファージ造血系統に由来する破骨細胞は、複数の核(2〜50核を有し得る)を有し、大きい(通常、直径100μmを超える)2である。骨破骨疾患のメカニズムの探索と薬剤のスクリーニングは、体外骨細胞内培養を通じて広く改善されているが、複雑な有機反応は、標的療法に不可欠なインビボの証拠を作る。マウスとヒトの間の遺伝的および病的生理学的類似性のために、遺伝子組み換えマウスモデルは、生体内でのヒト疾患のメカニズムおよび医薬的治療法を研究するために一般的に使用される。Cre-loxPシステムは、マウス遺伝子編集に広く使用されている技術であり、研究者は組織/細胞特異的な方法で遺伝子機能を調査することを可能にしました 5.カテプシンK(CSTK)は、骨コラーゲン8を分解し得る破骨細胞によって分泌されるシステインプロテアーゼである。CTSKは成熟した破骨細胞で選択的に発現することは十分に受け入れられています。従って、Ctsk-Creマウスは破骨細胞の機能研究に有用なツールであると考えられ、6.
転写(STAT)ファミリーのシグナルトランスデューサおよびアクチベーターは、免疫と癌の進行と発達において古典的かつ非常に重要です7,8.7つのSTAの中で、STAT3は骨恒常性9,10に最も関連していると報告されている。いくつかのインビボ研究は、骨芽細胞におけるSTAT3の特異的不活性化が骨形成9、10を減少させることを報告している。それにもかかわらず、骨細胞形成および生体内の骨代謝におけるSTAT3の関与に関する確かな証拠は依然として限られている。最近、我々は、骨細胞特異的Stat3欠失マウスモデル(Stat3fl /fl;Ctsk-Creは、STAT3と呼ばれるSTAT3)は、STAT3が破骨細胞分化および骨代謝に関与することを11.本研究では、骨骨格特異的STAT3欠失が骨恒常症に及ぼす影響を研究するために、Stat3Ctskマウスの骨量、骨組織形態、骨代謝および異化の変化を分析するために用いた方法とプロトコルについて説明する。
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Protocol
ここに記載されている動物に関するすべての方法は、上海交通大学医学部の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 破骨細胞特異的 Stat3 欠失マウスの繁殖
注 :Stat3fl/fl マウスは商業的に得られた。 Ctsk-Cre マウスは、加藤(東京大学、東京12)によって提供された。マウスは、標準化された条件下で施設内の動物施設で特異的な病原体を含まない(SPF)状態下で飼育および維持した。
- 性的に成熟した雄のマウスと同じ年齢の2匹の雌マウスを組み合わせる。18日後、新生児の毎日のチェックをチェックしてください。妊娠中の雌マウスを分離し、必要に応じて単独で保管してください。雌マウスがペアリングから1ヶ月以内に妊娠しなかった場合、異なる繁殖ケージの間で雄マウスを変更する。
- Ctsk-Creマウス(F0)にStat3fl/flマウスを渡る。ジェノタイピングのための尾をクリップし、男性のStat3flを保つ/+;Ctsk-Creマウスは、生後約6週間である性的に成熟するまでである(F1)。次のプライマーを使用してください: 統計 3 F-TTGACCTGTGCTCC TACAAAAAAAAAAA;統計 3 R-CCCTAGATTAGGCAGCACA;クツク・クレ F-GAACGCACTGcAtTCGACCA;クツク・クレ R-GCTAACCGC GTTTTCGTTTTCC.
- クロス 6 週齢 男性Stat3fl/+;メスのStat3fl/flマウスを持つCtsk-Creマウス。ジェノタイピングのための尾をクリップし、男性Stat3 fl / flを保ちます。Ctsk-Creマウスは、生後約6週間である性的に成熟するまでである(F2)。
- クロス 6 週齢 男性Stat3 fl/fl;メスのStat3fl/flマウスを有するCtsk-Creマウス(F3)。ジェノタイピングのために尾をクリップし、古い繁殖マウスを時間内に若いマウスに置き換えます(F3+N)。
2. 標本収集
- 8週齢の雄 Stat3fl/fl と Stat3Ctsk littermateマウスの6組を二酸化炭素窒息で別々に安楽死させる。
注:CO2 の流量は、1分間のケージ体積の30%を置き換えます(例えば、45 cm x 30 cm x 30 cmケージの場合、CO2 の流量は40 L/minです)。 - マウスをスピーヌの位置に配置します。両側股関節を手で優しく外す。眼科用はさみを使用して遠位脛球から皮膚を垂直に切り落とし、後肢から皮膚全体を解剖する。
- 右股関節と膝関節の関節靭帯をハサミで切り取り、後肢を分離する。トロシャンターとフィブラの接合部を切り、後肢を4%パラホルムアルデヒドに浸します。ステップ 3 の右後肢を保持します。適切に完全に浸漬し、4%パラホルムアルデヒドで骨髄を固定するために両端の骨をカット.
- 左股関節と膝関節の関節靭帯をはさみで切断し、柔らかい組織をそっと取り除き、脛骨と大腿骨を慎重に分離します。脛骨と大腿骨を75%エタノールに分けて浸します。ステップ4のフェムラとステップ6の脛骨を保ちます。トロチャンターをそのままに保つようにしてください。
3. パラフィンセクションの準備
- 4°Cで4%パラホルムアルデヒドで48時間右後肢を固定します。
- 脱灰: 1x PBSで10分間3回静かに洗浄します。骨が曲がることができるまで3〜4週間超音波デカーシファイアで15%EDTA(ddH2Oの800 mLおよび100 mLの100 mLで150 g EDTA)の試験体を脱灰する。1日おきに新鮮な脱カルシウム液に交換してください。
- 試料を1x PBSで3倍軽く洗い、4°Cで75%エタノールに浸します。
- 脱水:2日目に、95%エタノール、100%エタノール、キシレンに検体を順次浸漬し、それぞれ1時間ずつ2回浸します。
- 1/2キシレン1/2パラフィンに30分間試料を浸します。試料をパラフィンに65°Cで一晩浸漬します。
- 埋め込み: 埋め込み用の適切な埋め込みタンクを選択します。脛目を下に均一に置きます。大腿骨と脛骨を90°の角度で配置します。パラフィンを完全に冷却し固めた後、埋め込みタンクから取り出します。標本に番号を付け、一晩で-20 °Cで保管してください。
- マイクロトームを使用して、厚さ5μmの部分を連続的にカットします。20~40のセクションをカットします。37°Cの水にセクションを広げ、顕微鏡スライドに付着し、一晩42°Cで焼きます。
4. マイクロCTスキャンおよび分析
- マイクロCTスキャナで左フェムラをスキャンします。解像度:10 μm。電圧:70キロV。電流:114 μA;フリッター:0.5ミリメートルアル;回転ステップ:0.5°。
- メーカーの指示に従ってスキャナーのサポートソフトウェアを使用して、皮質骨と骨の3D画像を再構築します。ROIは、遠位成長プレートに近い骨の合計1mm幅、および女性の真ん中の皮質骨の合計1mm幅の幅である。
- 定量的マイクロアーキテクチャパラメータを計算します:骨密度(BMD)、骨体積分率(BV /TV)、骨膜厚(Tb.Th)、柱状数(Tb.N.)、骨膜分離(Tb.Sp.)、皮質骨厚さ(Ct.Th)。
5. トラップ染色
- パラフィンの切片を65°Cで30分間焼きます。
- デワックス:10分間、切片をキシレンに浸します。このステップ3xを新鮮なキシレンで実行します。
- リハイドレート:セクションを100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、およびddH2Oに順次浸漬し、それぞれ5分間2回浸漬します。
- 製造者の指示に従ってTRAP染色キットを使用して染色液を準備し、37°Cに温めます。
注:TRAP染色溶液は、すべてのアッセイの直前に新たに調製する必要があります。 - 50~100 μLの染色液を各サンプルに加え、37°Cの湿気のあるチャンバーで20~30分間インキュベートします。赤い多核破骨細胞が見えるまで、5分ごとに軽い顕微鏡で破骨細胞の染色状態を確認してください。反応をddH2Oで終了する。
- 30 sのためのヘマトキシリン溶液中のカウンターステイン。1%アンモニア溶液に1分間浸漬することで、安定した青色を作成します。ゆっくりと水道水を流してすすい。
- ニュートラルバルサムを使用してカバースリップでセクションをマウントし、一晩乾燥させます。
- 顕微鏡で関心のある3~5の分野を捉えます。イメージ J で境界の分析: '直線' ツールを使用してスケール バー (Ls) の長さを測定し、L2、物理長 (Lp)= Ls*L2/L1) として 'セグメント線' ツールを使用して、境界の長さを測定します。3つ以上の核を持つTRAP陽性細胞の数を数えます。
6. カルセインとアリザリンレッドダブルラベリング
- 標本調製:腹腔内注入 20 mg/kg カルセイン (2% NaHCO 3溶液で 1 mgL 2% NaHCO3 溶液) 4日目に 25 mg/kg アリザリンレッドS (AL,H 2 Oで 2 mg/mL) 4日目.7日目にマウスを犠牲にする。48時間4°Cで4%パラホルムアルデヒドに慎重に関連付けを解除します。
- 脱水: 固定後、1x PBSで脛目3xを静かに洗います。検体を95%エタノール、100%エタノール、キシレンを5分間、別々に2回浸漬します。
- 試料をアセトンに12時間、1/2アセトン1/2樹脂に2時間浸し、純粋な樹脂を一晩乾燥オーブンに浸します。
注:樹脂は、メーカーの指示に従って市販の樹脂(例えば、埋め込み812樹脂)によって調製した。 - 埋め込み: 純粋な樹脂を適切なシリカゲル埋め込みタンクに加え、泡を避けるために試料を穏やかに配置します。乾燥オーブンで樹脂を60°Cで48時間重合します。
- 回転ミクロトームで試料を5μmの厚いセクションに連続して切ります。残りのサンプルは、乾燥剤とともに室温で保管してください。
- 75%のアルコールの低下でピンセットでセクションを付けます。ニュートラルバルサムを使用してカバーリップでセクションをマウントします。蛍光顕微鏡で赤と緑の蛍光標識をキャプチャします。
- 2 つのラベル線(Ir.L.Wi)、単一ラベル付きの柱状周長(sL.Pm)、二重ラベル付きの柱状の周長(dL.Pm)、および総柱状周長(Tb.Pm)の間の幅を測定します。鉱物割当率(MAR)と骨形成率(BFR/BS)を計算します。MAR = Ir.L.Wi/インターバル日数。BFR/BS= (dL.Pm±SL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100%。
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Representative Results
本プロトコルを用いて、破骨細胞特異的Stat3欠失マウスを生成し、破骨細胞分化に対するSTAT3欠失の影響を検討した。Stat3Ctskマウスとその野生型(WT)リターメイトは、ジェノタイピング後に飼育され、保管された。骨髄マクロファージを単離し、破骨細胞に培養し、Stat3CtskマウスにおけるSTAT3欠失が実証された(図1)。
マイクロCTによるフェムラ再構成および定量分析は、Stat3Ctskマウスの骨量がWTマウスと比較して増加したことを示した(図2)。
WTおよびStat3Ctskマウスからのフェムラの組織形態をH&E染色を介して調べた(図3)。
マウスにおける骨切肉切死活性はTRAP染色によって検出された。破骨細胞は、複数の核と巨大なサイズを有するTRAP+(ワイン赤または紫)細胞であった(図4A)。TRAP+破骨細胞の数は、WTマウス(図4B)と比較してStat3Ctskマウスにおいて低かったが、これはSTAT3欠乏が破骨細胞形成を損なうことを示している。
マウスにおける骨形成は、鉱物格子率(MAR)で表され、カルセインとアリザリンレッドダブルラベリングで測定した(図5)。カルセイン及びアリザリン赤を順次腹腔内注射した。したがって、カルセイン(緑色)とアリザリンレッド(赤色)の間の領域は、4日間にわたって新たに形成された骨を表す。図5に示すように、破骨細胞におけるSTAT3の削除は骨の解化に影響を与えなかった。
図1:破骨細胞特有Stat3欠失マウスモデル生成および遺伝子操作マウスの図(A)Cre-loxPシステムを介したカテプシンK(Ctsk)発現破骨細胞におけるStat3欠失の概略図。(B) 破骨細胞特異的Stat3欠失マウスの繁殖過程Stat3fl/flマウスをCtsk-Creマウス(F0)に交配してヘテロ接合Stat3fl/+を生成した。Ctsk-Creマウス(F1)。男性の統計 3fl/+;Ctsk-Creマウスは飼われ、雌のStat3fl/flマウスに渡ってホモ接合Stat3fl/flを生成した。Ctsk-Creマウス(F2)。男性統計3fl/fl;Ctsk-Creマウスを保持し、メスのStat3fl/flマウスに渡ってStat3fl/flを生成しました。Ctsk-CreマウスとStat3fl/flマウス。(C)マウスの様々な遺伝子型のジェノタイピング。Stat3変異体:187bp、Stat3野生型:146bp、Cre:200 bp.(D)Stat3 fl/flおよびStat3Ctskマウスから骨髄マクロファージで培養された破骨細胞におけるSTAT3のウェスタンブロット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2 マイクロCTスキャンを用いたマウスの女性の3次元再構成および定量的マイクロアーキテクチャパラメータ解析(A) 8週齢のWTおよび Stat3Ctsk マウスから生まれる大腿骨の骨の三次元再構成マイクロCT画像。対象領域(ROI)は、遠位成長板に近い骨骨の合計1mm幅であった。(B)3Dは、8週齢のWTおよび Stat3Ctsk マウスから大腿骨の皮質骨のマイクロCT画像を再構築した。ROIは、フェムラの真ん中から皮質骨の合計1mm幅のセクションにあった。(C–H)マイクロCTの定量的マイクロアーキテクチャパラメータ:骨密度(BMD)、骨体積分率(BV/TV)、骨膜厚(Tb.Th)、柱状数(Tb.N.)、骨膜分離(Tb.Sp.)、皮質骨厚さ(Ct.Th。誤差範囲は、SD、n=4、*P<0.05±平均を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:H&E染色を介して発現したWTおよび Stat3Ctsk マウスからのフェモラの組織形態M字の点線は軟骨層を示す。皮質骨の相対的な高出力フィールドは、点線で箱詰めされ、以下に示される。骨底骨の相対的な高出力フィールドは、点線で囲まれ、底部に示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TRAP染色を介して表されるマウスの女性体における骨包種形成。(A)8週齢のWTおよび Stat3Ctsk マウスからのフェムラのTRAP染色。TRAP+ 多核破骨細胞は黒い三角形によって示される。破線で囲まれた破骨細胞の相対的な高出力フィールドが以下に展示され、複数の核と巨大な大きさを示す。(B)TRAP+ 多核破骨細胞の数を数えた。誤差範囲は、SD、n= 5、*P<0.05±平均を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:カルセインおよびアリザリン赤色二重標識を介して表されるマウスのフェムラにおける骨形成(A)7週齢のマウスは、0日目にカルセインを順次注射し、4日目にアリザリンを赤色にして、7日目に屠殺した。カルセイン(緑色)とアリザリンレッド(赤)蛍光線の間の領域は、4日間にわたって新たに形成された皮質骨を表す。(B)ミネラルアポジレート(MAR)と骨形成率(BFR/BS)は、2つのラインの距離によって計算され、皮質骨の骨形成活性を表す。(C)カルセイン(緑色)とアリザリンレッド(赤)蛍光線の間の領域は、4日間で新たに形成された骨を表す。(D) MARおよびBFR/BSは、骨膜骨の骨形成活性を表す。誤差範囲は、SD、n= 5、*P<0.05±平均を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患13のメカニズムおよび医薬的治療の研究に一般的に使用される。 Ctsk-Cre マウスは、破骨細胞6の機能研究に広く使用されている。本研究では、骨格表現型を分析し、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を研究する方法のプロトコルについて説明した。
組織学的分析は骨代謝を検出する最も直感的な方法です。そして、パラフィンセクションの品質は、組織学的分析の基礎です。骨組織を断片化させることができるので、骨組織の完全な固定および脱灰のための十分な時間は非常に不可欠である。フェムラと脛骨に焦点を当てた研究者は、埋め込みステップで大腿骨と脛骨を90°の角度に置く必要があります。信頼性と質の高い組織学的解析を行うために、軟骨層が対称的で、H&E染色で明確なM字線を示した矢状パラフィンセクションを選択しました。一方、膝関節と隣接する関節靭帯を観察する必要がある場合は、大腿骨と脛骨を120°の角度で配置する必要があります。
TRAPは、骨細胞15,16で主に発現しているため、破骨細胞機能14の生化学的マーカーとして何十年も務めてきた。2つの基質は、通常、酸ホスファターゼ活性を評価するために使用される。ナフトール-ASBIリン酸(N-ASBI-P)は、破骨細胞特異的TRAPアイソフォーム5bに優れた基質です。しかしながら、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)は、非タイプ5のTRAPs17によって加水分解することもできる。従って、TRAPの組織化学的実証のためのナフトール−ASBIリン酸パラロサニリン法は、組織切片17、18、19において非常に特異的である。マクロファージホスファターゼ(酸性ホスファターゼ)は、5.0〜6.0のpHの最適な、それは主に酒類耐性20である。従って、TRAP染色アッセイのプロトコルでは、ヘマトキシリンによって再染色された組織切片を塩酸で変色させないことを推奨する。重要なことに、骨造形領域に近い骨芽細胞および骨細胞もTRAP21を発現するが、3つ以上の核を有する巨大なTRAP陽性細胞のみが破骨細胞と考えられていた。本研究では、Stat3Ctskマウスは、破骨細胞活性の抑制を示した(図4)。
カルセインは、石灰化中の骨格の成長を示すために広く使用されている蛍光色(緑色蛍光)です。カルシウムに結合して、新たに形成された炭酸カルシウム結晶22に組み込むことができる。同様に、カルセイン、アリザリン赤(赤蛍光)、およびテトラサイクリン(黄色蛍光)を骨に組み込んで、露光時23、24から成長を推定した。過去に多くの研究では、単一のフルオロクロム(通常はカルセイン)を使用して骨にラベルを付けてきましたが、観察者は、特に不規則な骨の骨で、新たに形成された骨と古い骨の間で容易に混乱することができます。そこで、研究者は、新しい骨と古い骨を区別するために、2種類のフッ素クロムをマウスに注入することを示唆する。私たちのテストによると、カルセインとアリザリンを組み合わせることで、最も十分で永続的なコントラストを達成する可能性があります。本研究では、カルセイン‐アリザリン赤い標識を用いて骨組織の骨形成速度を検出し、Stat3Ctskマウスでは骨芽細胞活性が影響を受けていないことが判明した(図5)。
要するに、破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を理解するために、このプロトコルは、トランスジェニックマウスモデルを生成する正規の方法を記述する。このプロトコルは、骨格表現型を分析するためのいくつかの典型的な手法についても説明する。本研究では、STAT3の欠失は破骨細胞形成を損ない、骨量の増加を示した。これらの技術は、骨格組織研究に新しい人にとって興味深いかもしれません。しかし、骨格系のより多くの特性は、機械的特性25のようなさらなる研究のために懸念される。そして、私たちは常に新しい技術の開発に目を離す必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
試薬とマウスのWeiguo Zou教授と加藤先生、そしてZou研究室のメンバーに有益な議論を感謝します。また、上海第9人民病院頭蓋顔面異常研究センターのデジタル化された病頭学研究センターに対する支援に感謝します。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC)からの助成金によって部分的に支えられました[81570950、81870740、81800949]、 上海サミット・高原分野、上海精密医学研究所、上海九人民病院、上海交通大学医学部(JC201809)、上海交通大学医学部の高レベルイノベーションチームインセンティブプロジェクト上海交通大学医学部上海交通大学附属病院(JYJC201902)の学際研究基金L.J.は、優れた青少年医療人材、上海「医療人材の新星」青少年育成プログラム、上海交通大学の「陳興」プロジェクトの学者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
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