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Biology

조건부 Stat3 삭제 마우스 모델의 골격 표현형 분석

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 이해하는 정식 방법을 설명합니다. 이 방법은 형질 형형과 일부 표준 기술을 사용하여 골격 표현형을 분석합니다.

Abstract

트랜스제닉 마우스 모델은 골세포 분화 및 활동을 제어하는 중요한 유전자를 이해하고 골다공증의 메커니즘 및 제약 치료를 연구하는 데 강력합니다. 카테핀 K (Ctsk)-Cre 마우스는 골세포의 기능적 연구에 널리 사용되어 왔다. 전사 3(STAT3)의 신호 변환기 및 활성화기는 뼈 항상성에서 관련이 있지만 생체 내의 골막세포에서의 역할은 제대로 정의되지 않습니다. STAT3가 골세포 분화 및 뼈 대사에 참여한다는 생체 내 증거를 제공하기 위해, 우리는 골세포별 Stat3 삭제 마우스모델(Stat3 fl/fl;; Ctsk-Cre)및 골격 표현형을 분석하였다. 마이크로 CT 스캐닝 및 3D 재구성은 조건부 녹아웃 마우스에서 골질량을 증가시묵화하였다. H&E 염색, 칼세인 및 알리자린 레드 더블 염색, 타르타르트 내성 산 인산인산(TRAP) 염색이 뼈 대사를 검출하기 위해 수행되었다. 요컨대, 이 프로토콜은 골격 표현형을 분석하고 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 연구하기 위해 몇 가지 표준 방법과 기술을 설명합니다.

Introduction

골격 뼈는 인체의 주요 하중 베어링 기관이며 걷기 및 운동 중 내부 및 외부 환경 모두에서 압력을 받고있다 1. 평생 동안 뼈는 계속해서 자체 재생을 거치며, 이는 골세포와 골세포에 의해 균형을 이룹니다. 새로운 뼈를 형성하는 오래된 뼈와 골세포를 지우는 골세포의 과정은 골격 시스템2의항상성 및 기계적 기능을 유지한다. 균형에 장애가 골다공증과 같은 뼈 대사 질환을 유발할 수 있습니다. 골다공증은 과도한 골세포 활성으로 인해 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 사회2,3,4에상당한 경제적 손실을 초래합니다. 골다공증 치료에 사용할 수 있는 약물의 제한된 수와 부작용의 그들의 위험4에따르면, 골다세포 형성 및 활동의 세부 사항을 공개 하는 것이 중요 하다.

단핵세포/대식세포 조혈 계보로부터 유래된 골세포는 다중 핵(2~50개의 핵을 가질 수 있음)을 가지며 큰(보통 직경 100 μm 이상)2. 기전의 탐구와 골세포 질환에 대한 약물의 검열은 체외 골세포 문화를 통해 널리 개선되었지만, 복잡한 유기 반응은 표적 치료에 필수적불가결한 생체 내 증거를 만듭니다. 마우스와 인간 사이의 유전적 및 병리학적 유사성으로 인해, 유전자 조작 마우스 모델은 일반적으로 생체 내에서 인간 질환의 메커니즘 및 약제 학적 치료를 연구하는 데 사용된다6. Cre-loxP 시스템은 마우스 유전자 편집을 위해 널리 사용되는 기술이며 연구자들이 조직/세포 별 방식으로 유전자 기능을 조사할 수 있게 해 주었다5. 카테프신 K(CSTK)는 골콜라겐8을저하시킬 수 있는 골세포에 의해 분비된 시스테인 프로테아제이다. CTSK가 성숙한 골세포에서 선택적으로 표현된다는 것은 잘 받아들여진다. 따라서, Ctsk-Cre 마우스는 골세포에 대한 기능적 연구를 위한 유용한 도구로 간주되고6.

전사(STAT) 제품군의 신호 트랜스듀서 및 활성화기는 면역 및 암 진행 및 개발7,8에서고전적으로 매우 유의하다. 7개의 STAT 중 STAT3는 뼈 항상성9,10과가장 관련이 있는 것으로 보고됩니다. 여러 생체 내 연구는 골세포에서 STAT3의 특정 불활성화가 뼈 형성9,10을감소시키는 것으로 보고되었다. 그럼에도 불구 하 고, osteoclast 형성및 생체 내 뼈 대사에 STAT3의 참여에 관한 확실한 증거는 여전히 제한. 최근에는 osteoclast-특정 Stat3 삭제 마우스모델(Stat3fl/fl;)과함께 생체 내 증거를 제공했습니다. Ctsk-Cre, 이하 Stat3Ctsk)라고불리는STAT3는 골세포 분화 및 뼈대사(11)에참여한다. 본 연구에서는, 뼈 집상성에 대한 골세포별 STAT3 삭제의 영향을 연구하기 위해 Stat3Ctsk 마우스의 뼈 질량, 뼈 조직화 및 뼈 분석및 이화작용의 변화를 분석하는 데 사용한 방법과 프로토콜을 설명합니다.

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Protocol

여기에 설명 된 동물에 관한 모든 방법은 상하이 자오퉁 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 골세포 특정 Stat3 삭제 마우스의 사육

참고: Stat3fl/fl 마우스는 상업적으로 수득하였다. Ctsk-Cre 마우스는 S. 카토 (도쿄 대학, 도쿄, 일본12)에의해 제공되었다. 마우스는 표준화된 조건하에서 기관 동물 시설에서 특정 병원체가 없는 (SPF) 조건하에서 사육되고 유지되었다.

  1. 같은 나이의 두 여성 마우스와 성적으로 성숙한 남성 마우스를 쌍. 18 일 후, 신생아에 대한 매일 검사를 확인하십시오. 임신 한 여성 마우스를 분리하고 필요한 경우 혼자 보관하십시오. 암컷 마우스가 페어링의 1 달 이내에 임신하지 않은 경우 다른 사육 케이지 중 남성 마우스를 변경합니다.
  2. 크로스 Stat3fl/fl 마우스 Ctsk-Cre 마우스 (F0). 지노티핑을 위해 꼬리를 자르고 남성 Stat3fl /+유지; Ctsk-Cre 마우스는 성적으로 성숙할 때까지 생쥐이며, 이는 약 6주(F1)입니다. 다음 프라이머사용: Stat3 F-TTGACCTGTTCCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Stat3 R-CCCTAGATTAGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCCGTTCGTTCGTTC.
  3. 십자가 6 주 된 남성 Stat3fl/+; 여성 Stat3fl/fl 마우스를 가진 Ctsk-Cre 마우스. 지노티핑을 위해 꼬리를 자르고 남성 Stat3 fl/fl을유지하십시오. Ctsk-Cre 마우스는 성적으로 성숙할 때까지 생쥐이며, 이는 약 6주(F2)입니다.
  4. 크로스 6 주 된 남성 Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre 마우스 와 여성 Stat3fl/fl 마우스 (F3). 지노티핑을 위해 꼬리를 자르고 오래된 번식 마우스를 시간에 젊은 쥐로 교체하십시오 (F3 +N).

2. 표본 수집

  1. 8주 된 남성 Stat3fl/fl 및 Stat3Ctsk 쓰레기메이트 마우스6쌍을 이산화탄소 질식으로 분리하여 안락사시합니다.
    참고: CO2 유량은 분당 케이지 볼륨의 30%를 대체합니다(예: 45cm x 30cm x 30cm 케이지의 경우CO2 유량은 40L/min)입니다.
  2. 마우스를 척추 위치에 놓습니다. 손으로 양자 엉덩이 관절을 부드럽게 탈바릅니다. 안과 가위를 사용하여 경골에서 수직으로 피부를 잘라낸 다음 뒷다리에서 전체 피부를 해부합니다.
  3. 뒷다리를 분리하기 위해 가위로 오른쪽 엉덩이 관절과 무릎 관절의 관절 인대를 잘라냅니다. 트로챈터와 비골의 접합을 잘라낸 다음 뒷다리를 4% 파라포름알데히드에 담가 두습니다. 3단계에서 오른쪽 뒷다리를 유지합니다. 적절하게 완전히 몰입하고 4 % 파라 포름 알데히드로 골수를 고정하기 위해 양쪽 끝에서 뼈를 잘라.
  4. 왼쪽 엉덩이 관절과 무릎 관절의 관절 인대를 가위로 자르고 연조직을 부드럽게 제거하고 경골과 대퇴골을 조심스럽게 분리합니다. 75%의 에탄올에 경골과 대퇴골을 따로 담급다. 단계 4에 대한 페모라를 유지하고 단계 6경골. 트로챈터를 그대로 유지하십시오.

3. 파라핀 섹션 준비

  1. 오른쪽 뒷다리를 4°C에서 48h로 수정합니다.
  2. 데칼시피: 1x PBS로 시편을 10분 3회 부드럽게 세척합니다. 15% EDTA(ddH2O의 800mL에서 150g EDTA, 10x PBS의 100mL)로 시편을 3~4주 동안 초음파 탈량제로 하여 뼈가 구부러질 수 있다. 매일 신선한 탈균 액으로 대체하십시오.
  3. 1x PBS로 시편을 3배 부드럽게 씻은 다음 하룻밤 사이에 4°C에서 75% 에탄올에 담가 두십시오.
  4. 탈수: 둘째 날에는 각각 1시간 씩 95% 에탄올, 100% 에탄올, 자일렌으로 시편을 순차적으로 담급니다.
  5. 표본을 1/2 자일렌 1/2 파라핀에 30분 동안 담가 두어 두드셔도 됩니다. 하룻밤 사이에 65°C에서 파라핀에 표본을 담그면 됩니다.
  6. 포함: 포함에 적합한 포함 탱크를 선택합니다. 경골을 균일하게 아래에 놓습니다. 대퇴골과 경골을 90° 각도로 놓습니다. 파라핀이 완전히 냉각되고 고화된 후 포함 탱크에서 제거합니다. 표본을 번호로 하룻밤 동안 -20 °C에 저장합니다.
  7. 마이크로토메를 사용하여 5 μm 두께의 부분을 지속적으로 절단합니다. 20-40 섹션을 잘라. 37°C 물에 섹션을 확산하고 현미경 슬라이드에 부착하고 하룻밤 사이에 42 °C에서 구우십시오.

4. 마이크로 CT 스캐닝 및 분석

  1. 마이크로 CT 스캐너로 왼쪽 페모라를 스캔합니다. 해상도: 10 μm; 전압 : 70 kV; 전류: 114 μA; 플리터: 0.5mm 알; 회전 단계: 0.5°.
  2. 제조업체의 지시에 따라 스캐너의 지원 소프트웨어를 사용하여 피질 뼈와 좌골 뼈의 3D 이미지를 재구성합니다. ROI는 말단 성장 플레이트에 가깝고 페모라 의 중간에 피질 뼈의 총 1mm 폭에 있습니다.
  3. 정량적 미세 아키텍처 매개 변수를 계산: 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 뼈 볼륨 분획 (BV/TV), 궤적 두께 (Tb.Th.), 궤적 수 (Tb.N.), 궤적 분리 (Tb.Sp.), 및 피질 뼈 두께 (Ct.Th.).

5. 트랩 염색

  1. 파라핀 섹션을 65°C에서 30분간 굽습니다.
  2. 데왁스: 10분 동안 자일렌에 섹션을 담그세요. 신선한 자일렌으로 이 단계를 3배 수행합니다.
  3. 재수화: 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, ddH2O로 섹션에 순차적으로 몰입하여 각각 5분 동안 두 번 담가 두 번.
  4. 제조업체의 지시에 따라 TRAP 염색 키트를 사용하여 염색 용액을 준비하고 37°C로 따뜻하게 합니다.
    참고: TRAP 염색 솔루션은 모든 분석 전에 즉시 신선하게 준비해야 합니다.
  5. 각 샘플에 50-100 μL 염색 용액을 추가하고 20-30 분 동안 37 ° C 습한 챔버에 배양하십시오. 붉은 다핵 골세포가 보일 때까지 5 분마다 가벼운 현미경으로 골의 염색 상태를 확인하십시오. ddH2O로 반응을 종료합니다.
  6. 30 s용 헤마톡시린 용액의 카운터스테인. 1% 암모니아 용액에 1분간 침수하여 안정적인 청색을 연출합니다. 천천히 흐르는 수돗물로 헹구는 다.
  7. 중성 발삼을 사용하여 커버립으로 섹션을 마운트하고 밤새 건조하십시오.
  8. 현미경으로 관심 있는 3-5 필드를 캡처합니다. 이미지 J에 의해 궤적 둘레를 분석: L1로'직선'도구를 사용하여 스케일 바(Ls)의 길이를 측정한 다음,'분할된 선'도구를 L2, 물리적 길이(Lp)로 사용하여 적혈구 둘레의 길이를 측정합니다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 세포의 수를 계산합니다.

6. 칼신과 알리자린 레드 더블 라벨링

  1. 표본 제제: 0일째에 20 mg/kg 칼세인(1 mg/mL in 2% NaHCO3 솔루션)과 25 mg/kg 알리자린 레드 S(AL, 2 mg/mL in H2O)를 4일째에 주입한다. 7일째에 마우스를 희생하십시오. 경골을 조심스럽게 분리하고 48 h에 대한 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다.
  2. 탈수: 고정 후, 경골 3배를 PBS 1x로 부드럽게 씻으십시오. 표본을 95% 에탄올, 100% 에탄올, 자일렌으로 5분 동안 따로 담가.
  3. 12시간 동안 아세톤에 표본을 담그고, 1/2 아세톤 1/2 수지에서 2시간 동안, 그리고 밤새 건조 오븐에 순수한 수지에 담가 두십시오.
    참고: 수지는 제조업체의 지침에 따라 시판되는 수지(예: 812 수지 포함)에 의해 제조되었습니다.
  4. 포함: 퓨어 수지를 적합한 실리카 젤 포함 탱크에 넣고 거품을 피하기 위해 표본을 부드럽게 배치합니다. 48h에 대해 60°C에서 건조 오븐에서 수지를 중합한다.
  5. 회전 마이크로토메로 시편을 5 μm 두께의 섹션으로 지속적으로 절단합니다. 나머지 샘플을 실온에서 건조제로 저장합니다.
  6. 75%의 알코올을 한 방울로 핀셋으로 섹션을 준수하십시오. 중립 발삼을 사용하여 커버립으로 섹션을 마운트합니다. 형광 현미경으로 적색 및 녹색 형광 라벨을 캡처합니다.
  7. 두 라벨링 라인(Ir.L.Wi), 단일 라벨이 부착된 반구 둘레(sL.Pm), 이중 라벨이 부착된 관두(dL.Pm) 및 총 반구 경계(Tb.Pm)사이의 너비를 측정합니다. 미네랄 정수 속도(MAR) 및 뼈 형성 속도(BFR/BS)를 계산합니다. MAR = Ir.L.Wi/간격 일. BFR/BS= (dL.Pm±SL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100%.

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Representative Results

본 프로토콜을 이용하여, osteoclast 특이적 Stat3 삭제 마우스는 골세포 분화에 STAT3 삭제의 영향을 연구하기 위해 생성되었다. Stat3Ctsk 마우스와 그들의 야생형 (WT) 쓰레기는 유전자를 지운 후에 사육되고 유지되었습니다. 골수 대식세포는 골수 세포로 분리되고 배양되었고, Stat3Ctsk 마우스에서 STAT3삭제가 입증되었다(도1).

마이크로 CT에 의한 페모라 재구성 및 정량분석은 Stat3Ctsk 마우스의 뼈 질량이 WT 마우스(도2)에비해 증가된 것으로 나타났다.

WT 및 Stat3Ctsk 마우스로부터의 페모라의 조직형태는 H&E염색(도 3)을통해 조사되었다.

마우스에서 의골격세포발생 활성은 TRAP 염색에 의해 검출되었다. 골세포는 여러 핵과 거대한 크기(그림 4A)를가진 TRAP+ (와인 레드 또는 보라색) 세포였습니다. TRAP+ 골세포의 수는 Stat3Ctsk 마우스에서 WT 마우스(도4B)와비교하여 낮았으며, 이는 STAT3 결핍이 손상된 골세포 형성을 나타낸다는 것을 나타낸다.

마우스의 골발생은 미네랄 apposition 속도(MAR)로 나타내며 칼신 및 알리자린 레드 더블라벨링(도 5)에의해 측정되었다. 칼신과 알리자린 레드는 순차적으로 주입되었다. 따라서, 칼신(green)과 알리자린 레드(red) 형광선 사이의 영역은 4일 동안 새로 형성된 뼈를 나타낸다. 그림 5에도시된 바와 같이, 골문세포에서 STAT3를 삭제한 결과 골전증에 영향을 미치지 않았다.

Figure 1
그림 1: 골세포별 Stat3 삭제 마우스 모델 생성 및 유전자 조작 마우스의 그림. (A)Cre-loxP 시스템을 통해 카테신 K(Ctsk)에서 Stat3 삭제의 회로도도. (B)골세포특정 Stat3 삭제 마우스의 번식 진행. Stat3fl/fl 마우스는 이종고우스 Stat3 fl/+ 생성하기 위하여 Ctsk-Cre 마우스 (F0)로 교차되었습니다; Ctsk-Cre 마우스 (F1). 남성 Stat3fl/+; Ctsk-Cre 마우스는 유지 하 고 유지 하 고 여성 Stat3fl/fl 마우스에 교차 하 여 homozygous Stat3fl/fl을생성; Ctsk-Cre 마우스 (F2). 남성 Stat3fl/fl; Ctsk-Cre 마우스는 Stat3fl/fl을 생성하기 위해 여성 Stat3 fl/fl 마우스로 유지및 교차하였다. Ctsk-Cre 마우스와 Stat3fl/fl 마우스. (C)쥐의 다양한 유전자형에 대한 유전자형. Stat3 돌연변이: 187 bp, Stat3 야생형: 146 bp, Cre: 200 bp.(D) Stat3fl/fl 및 Stat3Ctsk 마우스의 골수 대식세포로 배양된 골수 세포에서 STAT3의 서부 블롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 마이크로 CT 스캐닝을 사용하여 마우스의 페모라에서 3차원 재구성 및 정량적 미세 아키텍처 파라미터 분석. (A)8주 된 WT 및 Stat3Ctsk 마우스에서 페모라의 반경 뼈의 3 차원 재구성 마이크로 CT 이미지. 관심 영역(ROI)은 탈경 성장 판에 가까운 반구 뼈의 총 1mm 폭에 있었다. (B)8주 된 WT 및 Stat3Ctsk 마우스에서 페모라의 피질 뼈의 3D 재구성 마이크로 CT 이미지. ROI는 페모라의 중간에서 피질 뼈의 총 1mm 넓은 섹션에 있었다. (C-H) 마이크로 CT의 정량적 미세 아키텍처 매개 변수: 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 뼈 부피 분획 (BV/TV), 궤적 두께 (Tb.Th.), 궤적 수 (Tb.N.), 궤적 분리 (Tb.Sp.), 및 피질 뼈 두께 (Ct.Th.). 오류 막대는 평균 ± SD, n=4, *P<0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: H&E 염색을 통해 전시된 WT 및 Stat3Ctsk 마우스에서 모모라의 조직모형. M자형 점선 곡선은 연골 층을 나타냅니다. 피질 뼈의 상대적인 고전력 필드는 점선으로 박스형으로 상자에 보관되어 있으며 아래에 전시되어 있습니다. 상반골의 상대적인 고출력 필드는 점선으로 동그라미를 치고 바닥에 전시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: TRAP 염색을 통해 표현된 마우스의 페모라에서 의골 성형술 발생. (A)8주 된 WT 및 Stat3Ctsk 마우스에서 페모라의 트랩 염색. TRAP+ 다핵 된 골세포는 검은 삼각형으로 표시됩니다. 점선으로 동그라미를 친 골세포의 상대적인 고출력 필드는 아래에 전시되어 여러 핵과 거대한 크기를 보여줍니다. (B)TRAP+ 다핵 골의 수가 계산되었다. 오류 막대는 평균 ± SD, n=5, *P<0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 칼신과 알리자린 레드 더블 라벨링을 통해 표현되는 마우스의 페모라에서의 골발생. (A)7주된 생쥐는 0일째에 칼신을 순차적으로 주입하고, 4일째에는 알리자린을 적색으로 주입한 다음 7일째에 희생하였다. 칼세인(녹색)과 알리자린 레드(적) 형광선 사이의 영역은 4일 동안 새로 형성된 피질 뼈를 나타낸다. (B)두 라인의 거리에 의해 계산된 미네랄 apposition 속도(MAR) 및 골 형성 속도(BFR/BS)는 피질 뼈의 골형성 활성을 나타낸다. (C)칼세인(녹색)과 알리자린 레드(red) 형광선 사이의 영역은 4일 만에 새로 형성된 반구 뼈를 나타낸다. (D)MAR 및 BFR/BS는 혈관 골격의 골성 활성을 나타낸다. 오류 막대는 평균 ± SD, n=5, *P<0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

유전자 조작 마우스 모델은 일반적으로 인간 질환의 메커니즘 및 약제 학적 치료를 연구하는 데사용된다(13). Ctsk-Cre 마우스는 골세포6의기능적 연구에 널리 사용되어 왔다. 본 연구는 골격 표현형을 분석하고 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 연구하는 방법의 프로토콜을 설명했다.

조직학적 분석은 뼈 대사를 감지하는 가장 직관적인 방법입니다. 그리고 파라핀 섹션의 품질은 조직학적 분석의 기초입니다. 뼈 조직이 단편화 될 수 있기 때문에 뼈 조직의 완전한 고정 및 탈화에 대한 충분한 시간은 매우 필수적입니다. 페모라와 경골에 초점을 맞춘 연구원은 포함 단계에서 90° 각도로 대퇴골과 경골을 배치해야합니다. 신뢰할 수 있고 고품질 조직학 분석을 수행하기 위해 연골 층이 대칭인 처진 파라핀 섹션을 선택하고 H&E 염색시 명확한 M자형 라인을 보였으며, 이는 연속 적인 섹션의 적절한 각도와 깊이를 나타냅니다. 다른 한편으로는, 무릎 관절과 인접한 관절 인대를 관찰해야하는 경우, 대퇴골과 경골은 120 ° 각도로 배치해야합니다.

TRAP은 주로 골세포15,16에서발현되기 때문에, 골세포 기능14에대한 생화학적 마커로 수십 년 동안 봉사해 왔다. 2개의 기판은 일반적으로 산 인산 활성을 평가하기 위하여 이용됩니다. Naphthol-ASBI 인산염(N-ASBI-P)은 골세포별 TRAP 이소폼 5b에 대한 우수한 기판이다. 그러나, 파라니트로페닐 인산염(pNPP)도 비형 5 TRAPs17에의해 가수분해될 수 있다. 따라서 TRAP의 조직화학적 시연을 위한 나프톨-ASBI 인산 파라로사닐린 방법은 조직 섹션17,18,19에서매우 특이하다. 대식대식인산성포염(산인산인체)은 pH 최적 5.0-6.0을 가지며, 이 중 대부분은타프로테강성(20)이다. 따라서 TRAP 염색 분석의 프로토콜에서 헤마톡슬린에 의해 다시 염색된 조직 섹션은 염산으로 변색되어서는 안 됩니다. 중요한 것은, 골재세포와 골세포가 뼈 리모델링 부위에 가깝더라도 TRAP21을발현하고 있지만, 3개 이상의 핵을 가진 거대한 TRAP 양성 세포만이 골세포로 간주되었다. 이 연구에서Stat3Ctsk 마우스는 저해된 골세포활성(도 4)을보였다.

칼세인은 석회화 중 골격 성장을 나타내는 데 널리 사용되는 형광(녹색 형광)입니다. 칼슘에 결합하여 새로 형성된 탄산칼슘결정(22)에통합될 수 있다. 유사하게, 칼세인, 알리자린 레드(적색 형광), 및 테트라사이클린(yellow 형광)은23,24의노출 시점으로부터 의 성장을 추정하기 위해 뼈에 내장되었다. 과거에 많은 연구는 단일 불소 크롬을 사용 (일반적으로 calcein) 뼈를 레이블, 하지만 관찰자 쉽게 새로 형성 된 뼈와 오래 된 뼈 사이 혼동 될 수 있습니다., 특히 불규칙 한 반 구 뼈에서. 따라서, 우리는 연구원이 이전 뼈에서 새로운 뼈를 구별하기 위하여 마우스에 불소크롬의 2개의 다른 모형을 주입한다는 것을 건의합니다. 우리의 시험에 따르면, 알리자린과 결합 된 칼신은 가장 충분하고 지속적인 대조를 달성 할 수 있습니다. 본 연구에서, 칼신-알리자린 적색 라벨링은 골조직의 골발생 속도를 검출하는 데 사용되었고, 골세포 활성이 Stat3Ctsk 마우스(도5)에영향을 받지 않은 것으로 밝혀졌다.

요컨대, osteoclast 활동을 제어하는 중요한 유전자를 이해하기 위해, 이 프로토콜은 형질 전환 마우스 모델을 생성하는 정식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 골격 표현형을 분석하기 위한 몇 가지 일반적인 기술을 설명합니다. 이 연구에서, STAT3의 삭제는 손상된 골세포 형성 및 증가 된 뼈 질량. 이러한 기술은 골격 조직 연구에 새로운 사람들을 위해 재미있을 수 있습니다. 그러나, 스켈레톤 시스템의 더 많은 특성은 기계적특성(25)과같은 추가 연구를 염려한다. 그리고 우리는 항상 새로운 기술의 개발에 눈을 유지해야합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 시약과 마우스와 Zou 실험실의 구성원에 대한 Weiguo Zou 교수와 S. 카토 교수에게 감사유용한 토론을. 우리는 또한 상하이 아홉 번째 인민 병원의 두개 안면 이상을위한 디지털화 된 Stomatology 및 연구 센터에 대한 실험실에 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립자연과학재단(NSFC)[81570950,81870740,81800949]의 보조금으로 부분적으로 지원되었다. 상하이 서밋 & 고원 분야, 상하이 정밀 의학 연구소, 상하이 9인조 병원, 상하이 자오동 의과대학 [JC201809], 상하이 자오동 대학 의과대학 고원혁신팀 인센티브 프로젝트 상하이 제9인민병원 상하이자오퉁대학교의 학과 [JYJC201902]의 종합연구기금. L.J.는 우수 청소년 의료 인재, 상하이 "의학 재능의 떠오르는 별" 청소년 개발 프로그램 및 상하이 자오퉁 대학의 "첸 싱" 프로젝트의 학자입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

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References

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생물학 문제 161 골격 표현형 뼈 대사 라벨링 골세포 STAT3 형질전환 마우스
조건부 <em>Stat3</em> 삭제 마우스 모델의 골격 표현형 분석
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Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,… More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

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