Summary
Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.
Abstract
Transgene muismodellen zijn krachtig voor het begrijpen van de kritische genen die osteoclastendifferentiatie en -activiteit beheersen, en voor het bestuderen van mechanismen en farmaceutische behandelingen van osteoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten. De signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is relevant bij bothomeostase, maar de rol ervan bij osteoclasten in vivo blijft slecht gedefinieerd. Om het in vivo bewijs te leveren dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme, hebben we een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel gegenereerd (Stat3 fl/fl ; Ctsk-Cre) en analyseerde zijn skeletfenotype. Micro-CT-scanning en 3D-reconstructie impliceerden een verhoogde botmassa bij de voorwaardelijke knock-outmuizen. H&E-kleuring, calceïne en alizarine rode dubbele kleuring en tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring werden uitgevoerd om het botmetabolisme te detecteren. Kortom, dit protocol beschrijft enkele canonieke methoden en technieken om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren.
Introduction
Skeletbot is het belangrijkste dragende orgaan van het menselijk lichaam en staat onder druk van zowel de interne als externe omgeving tijdens het lopen en sporten1. Gedurende iemands hele leven ondergaan botten voortdurend zelfvernieuwing, die wordt gecompenseerd door osteoblasten en osteoclasten. Het proces van osteoclasten die oude botten en osteoblasten die nieuw bot vormen, zuivert de homeostase en mechanische functie van het skeletsysteem2. Verstoring van het evenwicht kan botmetabole ziekten veroorzaken, zoals osteoporose. Osteoporose, die wordt veroorzaakt door overmatige osteoclastische activiteit, komt wereldwijd voor en veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen voor de samenleving2,3,4. Volgens het beperkte aantal geneesmiddelen dat beschikbaar is voor osteoporosebehandeling en hun risico op bijwerkingen4, is het belangrijk om de details van osteoclastenvorming en -activiteit te onthullen.
Osteoclasten afgeleid van de monocyt/macrofaag hematopoietische afstamming hebben meerdere kernen (kunnen 2 tot 50 kernen hebben) en zijn groot (meestal groter dan 100 μm in diameter)2. Hoewel de exploratie van mechanismen en de screening van geneesmiddelen op osteoclastische aandoeningen sterk zijn verbeterd via in vitro osteoclastencultuur, maken de gecompliceerde organische reacties in vivo bewijs onmisbaar voor de gerichte therapie. Vanwege genetische en pathofysiologische overeenkomsten tussen muizen en mensen worden genetisch gemanipuleerde muismodellen vaak gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen en de farmaceutische behandelingen van menselijke ziekten in vivo6. Het Cre-loxP-systeem is een veelgebruikte technologie voor het bewerken van muisgen en heeft onderzoekers in staat gesteld om genfuncties op een weefsel-/celspecifieke manier te onderzoeken5. Cathepsine K (CSTK) is een cysteïne protease uitgescheiden door osteoclasten die botcollageen kunnen afbreken8. Het is algemeen aanvaard dat CTSK selectief wordt uitgedrukt in volwassen osteoclasten; daarom worden Ctsk-Cre muizen beschouwd als een nuttig hulpmiddel voor functionele studies van osteoclasten en is gebruikt6.
De signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT) familie is klassiek en zeer significant in immuniteit en kankerprogressie en ontwikkeling7,8. Van de zeven STATs is STAT3 naar verluidt het meest relevant voor bothomeostase9,10. Verschillende in vivo studies hebben gemeld dat specifieke inactivatie van STAT3 in osteoblasten de botvorming vermindert9,10. Niettemin is solide bewijs met betrekking tot de deelname van STAT3 aan osteoclastenvorming en botmetabolisme in vivo nog steeds beperkt. Onlangs hebben we in vivo bewijs geleverd met een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, hierna Stat3Ctskgenoemd) dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme11. In deze studie beschrijven we de methoden en protocollen die we gebruikten om de veranderingen in botmassa, bot histomorfologie en bot anabolisme en katabolisme van de Stat3Ctsk muizen te analyseren om de invloed van osteoclasten-specifieke STAT3 deletie op bothomeostase te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden met betrekking tot de hier beschreven dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Fokken van osteoclasten specifieke Stat3 deletie muizen
OPMERKING: Stat3fl/fl muizen werden commercieel verkregen. Ctsk-Cre muizen werden geleverd door S. Kato (Universiteit van Tokio, Tokio, Japan12). De muizen werden gefokt en onderhouden onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden in de institutionele dierenfaciliteit onder gestandaardiseerde omstandigheden.
- Koppel een geslachtsrijpe mannelijke muis met twee vrouwelijke muizen van dezelfde leeftijd. Controleer na 18 dagen de dagelijkse controles op pasgeborenen. Scheid de zwangere vrouwelijke muizen en houd deze indien nodig alleen. Verander mannelijke muizen tussen verschillende fokkooien als de vrouwelijke muizen niet zwanger waren binnen 1 maand na de koppeling.
- Kruis Stat3fl/fl muizen naar Ctsk-Cre muizen (F0). Knip de staarten voor genotypering en houd de mannelijke Stat3fl/+; Ctsk-Cre muizen tot ze geslachtsrijp zijn, wat ongeveer 6 weken oud is (F1). Gebruik de volgende primers: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
- Cross 6 weken oude man Stat3fl/+; Ctsk-Cre muizen met vrouwelijke Stat3fl/fl muizen. Knip de staarten voor genotypering en houd de mannelijke Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre muizen tot ze geslachtsrijp zijn, wat ongeveer 6 weken oud is (F2).
- Cross 6 weken oude man Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre muizen met vrouwelijke Stat3fl/fl muizen (F3). Knip de staarten voor genotypering en vervang de oude fokmuizen op tijd door jongere muizen (F3+N).
2. Specimen collectie
- Euthanaseer zes paren van 8 weken oude mannelijke Stat3fl/fl en Stat3Ctsk littermate muizen afzonderlijk met koolstofdioxide verstikking.
OPMERKING: Het CO2-debiet verplaatst 30% van het kooivolume per minuut (bijv. voor een kooi van 45 cm x 30 cm x 30 cm is het CO2-debiet 40 L/min). - Plaats de muizen in een liggende positie. Ontwricht de bilaterale heupgewrichten voorzichtig met de hand. Gebruik een oogheelkundige schaar om de huid verticaal af te snijden van het distale scheenbeen en ontleed vervolgens de hele huid van de achterste ledemaat.
- Snijd het gewrichtsbandje van het rechter heupgewricht en het kniegewricht af met een schaar om de achterpoot te scheiden. Snijd de trochanter en de verbinding van het kuitbeen door en dompel de achterste ledemaat onder in 4% paraformaldehyde. Houd de rechter achterpoten voor stap 3. Snijd het bot aan beide uiteinden op de juiste manier om het beenmerg volledig onder te dompelen en te fixeren met 4% paraformaldehyde.
- Knip het gewrichtsbandje van het linker heupgewricht en kniegewricht met een schaar, verwijder voorzichtig het zachte weefsel en scheid voorzichtig het scheenbeen en dijbeen. Dompel het scheenbeen en dijbeen apart onder in 75% ethanol. Houd de femora voor stap 4 en tibiae voor stap 6. Zorg ervoor dat de trochanter intact blijft.
3. Paraffine sectie voorbereiding
- Bevestig de rechter achterpoot in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 48 uur.
- Ontkalken: Was de monsters voorzichtig 3 keer met 1x PBS gedurende 10 min. Ontkalk de monsters in 15% EDTA (150 g EDTA in 800 ml ddH2O en 100 ml 10x PBS) met een ultrasone ontkalker gedurende 3 tot 4 weken totdat de botten kunnen worden gebogen. Om de dag vervangen door verse ontkalkingsvloeistof.
- Was de monsters voorzichtig 3x met 1x PBS en dompel ze vervolgens 's nachts onder in 75% ethanol bij 4 °C.
- Dehydrateren: Dompel op de tweede dag monsters achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen, elk gedurende 1 uur tweemaal.
- Dompel de specimens gedurende 30 minuten onder in 1/2 xyleen 1/2 paraffine. Dompel de specimens 's nachts onder in paraffine bij 65 °C.
- Insluiten: Selecteer een geschikte insluittank voor insluiten. Plaats het scheenbeen gelijkmatig eronder. Plaats het dijbeen en scheenbeen onder een hoek van 90°. Nadat de paraffine volledig is afgekoeld en gestold, verwijdert u deze uit de insluittank. Nummer de specimens en bewaar ze 's nachts bij -20 °C.
- Snijd continu 5 μm dikke secties met behulp van de microtome. Snijd 20-40 secties. Verdeel de secties over 37 °C water, plak ze aan microscoopglaasjes en bak 's nachts op 42 °C.
4. Micro-CT scannen en analyseren
- Scan de linker femora met een micro-CT scanner. Resolutie: 10 μm; Spanning: 70 kV; Stroom: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Rotatiestap: 0,5°.
- Reconstrueer 3D-beelden van het corticale bot en trabeculair bot met behulp van de ondersteunende software van de scanner volgens de instructies van de fabrikant. ROI's bevinden zich in een totale breedte van 1 mm trabeculair bot dicht bij de distale groeiplaat en in een totaal 1 mm breed deel van corticale bot in het midden van de femora.
- Bereken de kwantitatieve microarchitectuurparameters: botmineraaldichtheid (BMD), botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th.), trabeculair getal (Tb.N.), trabeculaire scheiding (Tb.Sp.) en corticale botdikte (Ct.Th.).
5. TRAP kleuring
- Bak de paraffinedelen 30 minuten op 65 °C.
- Dewax: Dompel de secties 10 minuten onder in xyleen. Voer deze stap 3x uit met verse xyleen.
- Rehydrateren: Dompel de secties opeenvolgend onder in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en ddH2O, elk gedurende 5 minuten tweemaal.
- Bereid de kleuroplossing met behulp van de TRAP-kleurset volgens de instructies van de fabrikant en verwarm tot 37 °C.
OPMERKING: TRAP-kleuroplossing moet onmiddellijk voor elke test vers worden bereid. - Voeg 50-100 μL kleuroplossing toe aan elk monster en incubeer gedurende 20-30 minuten in een vochtige kamer van 37 °C. Controleer elke 5 minuten de kleuringsstatus van de osteoclasten onder een lichtmicroscoop totdat rode multinucleated osteoclasten te zien zijn. Beëindig de reactie met ddH2O.
- Counterstain in hematoxyline oplossing gedurende 30 s. Creëer een stabiele blauwe kleur door onderdompeling in 1% ammoniakoplossing gedurende 1 min. Spoel langzaam stromend leidingwater af.
- Monteer de secties met afdeklips met neutrale balsem en droog 's nachts.
- Leg 3-5 interessegebieden vast met een microscoop. Analyseer de trabeculaire omtrek met afbeelding J: meet de lengte van de schaalbalk (Ls) met behulp van het gereedschap 'rechte lijn' als L1 en meet vervolgens de lengte van de trabeculaire omtrek met behulp van het gereedschap 'gesegmenteerde lijn' als L2, de fysieke lengte (Lp)= Ls *L2 /L1). Tel het aantal TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen.
6. Calcein en alizarin rode dubbele etikettering
- Monsterpreparaat: Intraperitoneaal injecteren 20 mg/kg calceïne (1 mg/ml in 2% NaHCO3-oplossing) op dag 0 en 25 mg/kg alizarinerood S (AL, 2 mg/ml in H2O) op dag 4. Offer muizen op dag 7. Ontkoppel het scheenbeen voorzichtig en fixeer 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 48 uur.
- Uitdrogen: Was na fixatie het scheenbeen voorzichtig 3x met 1x PBS. Dompel de monsters achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen gedurende 5 minuten tweemaal afzonderlijk.
- Dompel de specimens gedurende 12 uur onder in aceton, in 1/2 aceton 1/2 hars gedurende 2 uur en 's nachts in zuivere hars in een droogoven.
OPMERKING: De hars is bereid met in de handel verkrijgde hars (bijv. Embed 812 Resin) volgens de instructies van de fabrikant. - Insluiten: Voeg zuivere hars toe aan een geschikte silicagel insluittank en plaats de monsters voorzichtig om bellen te voorkomen. Polymeriseer de hars in een droogoven bij 60 °C gedurende 48 uur.
- Snijd de monsters continu in 5 μm dikke secties met een roterende microtome. Bewaar de rest van de monsters met droogmiddel bij kamertemperatuur.
- Plak de secties met een pincet in een druppel van 75% alcohol. Monteer de secties met afdeklips met neutrale balsem. Leg rode en groene fluorescentielabels vast met een fluorescentiemicroscoop.
- Meet de breedte tussen twee labellijnen (Ir.L.Wi), enkel gelabelde trabeculaire omtrek (sL.Pm), dubbel gelabelde trabeculaire omtrek (dL.Pm) en totale trabeculaire omtrek (Tb.Pm). Bereken de minerale appositiesnelheid (MAR) en botvormingssnelheid (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/intervaldagen. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol werden osteoclastenspecifieke Stat3-deletiemuizen gegenereerd om de invloed van STAT3-deletie op osteoclastendifferentiatie te bestuderen. Stat3Ctsk muizen en hun wildtype (WT) nestgenoten werden gefokt en gehouden na genotypering. Beenmergmafagen werden geïsoleerd en gekweekt tot osteoclasten, en STAT3-deletie bij Stat3Ctsk-muizen werd aangetoond (figuur 1).
Femora-reconstructie en kwantitatieve analyse door micro-CT gaven aan dat de botmassa van de Stat3Ctsk-muizen was toegenomen in vergelijking met WT-muizen (figuur 2).
Histomorfologie van de femora van WT- en Stat3Ctsk-muizen werd onderzocht via H&E-kleuring (figuur 3).
Osteoclastogene activiteit bij de muizen werd gedetecteerd door TRAP-kleuring. Osteoclasten waren TRAP+ (wijnrode of paarse) cellen met meerdere kernen en enorme afmetingen (figuur 4A). Het aantal TRAP+ osteoclasten was lager bij de Stat3Ctsk muizen in vergelijking met de WT muizen (Figuur 4B), wat aangeeft dat STAT3 deficiëntie verminderde osteoclastenvorming.
Osteogenese bij muizen wordt vertegenwoordigd door de minerale appositiesnelheid (MAR) en werd gemeten met calceïne en alizarine rode dubbele etikettering (figuur 5). Calceïne en alizarinerood werden achtereenvolgens intraperitoneaal geïnjecteerd. Daarom vertegenwoordigt het gebied tussen de calceïne (groen) en alizarine rode (rode) fluorescentielijnen nieuw gevormd bot gedurende vier dagen. Zoals weergegeven in figuur 5, had verwijderde STAT3 bij osteoclasten geen invloed op botangabolisme.
Figuur 1: Illustratie van osteoclastenpecifiek Stat3 deletie muismodelgeneratie en genetisch gemanipuleerde muizen. (A) Schematisch schema van Stat3 deletie in cathepsine K (Ctsk)-expresserende osteoclasten via het Cre-loxP systeem. (B) Fokvoortgang van osteoclastenspecifieke Stat3 deletiemuizen. Stat3fl/fl muizen werden gekruist naar Ctsk-Cre muizen (F0) om heterozygoot Stat3fl/+te genereren; Ctsk-Cre muizen (F1). Mannelijke Stat3fl/+; Ctsk-Cre muizen werden gehouden en gekruist naar vrouwelijke Stat3fl/fl muizen om homozygoot Stat3fl/flte genereren; Ctsk-Cre muizen (F2). Mannelijke Stat3fl/fl; Ctsk-Cre muizen werden gehouden en gekruist naar vrouwelijke Stat3fl/fl muizen om Stat3fl/flte genereren; Ctsk-Cre muizen en Stat3fl/fl muizen. (C) Genotypering voor verschillende genotypen van muizen. Stat3 mutant: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Westelijke vlek STAT3 in osteoclasten gekweekt met beenmerg macrofagen van Stat3fl/fl en Stat3Ctsk muizen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Driedimensionale reconstructie en kwantitatieve microarchitectuur parameteranalyse bij femora van muizen met behulp van micro-CT scanning. (A) Driedimensionaal gereconstrueerde micro-CT beelden van trabeculair bot van femora van 8 weken oude WT en Stat3Ctsk muizen. De regio van belang (ROI) was in een totale 1 mm breedte van trabeculair bot dicht bij de distale groeiplaat. (B) 3D gereconstrueerde micro-CT beelden van corticale bot van femora van 8 weken oude WT en Stat3Ctsk muizen. ROI was in een totaal 1 mm breed deel van corticale bot uit het midden van de femora. (C–H) Kwantitatieve microarchitectuurparameters van micro-CT: botmineraaldichtheid (BMD), botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th.), trabeculair getal (Tb.N.), trabeculaire scheiding (Tb.Sp.) en corticale botdikte (Ct.Th.). Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD, n=4, *P<0.05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Histomorfologie van femora van WT- en Stat3Ctsk-muizen tentoongesteld via H&E-kleuring. M-vormige gestippelde curve duidt op een kraakbeenlaag. Relatief hoogvermogen veld van corticale bot is verpakt met stippellijnen en hieronder tentoongesteld. Het relatieve high-power gebied van trabeculair been wordt omcirkeld met gestippelde lijnen en tentoongesteld bij de bodem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Osteoclastogenese bij femora van muizen vertegenwoordigd via TRAP-kleuring. (A) TRAP kleuring van femora van 8 weken oude WT en Stat3Ctsk muizen. TRAP+ multinucleated osteoclasten worden aangegeven door zwarte driehoeken. Relatief hoogvermogen veld van osteoclasten omcirkeld met stippellijnen worden hieronder tentoongesteld, wat meerdere kernen en een enorme grootte aantoont. (B) De aantallen TRAP+ multinucleated osteoclasten werden geteld. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD, n=5, *P<0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Osteogenese bij femora van muizen vertegenwoordigd via calceïne en alizarine rode dubbele etikettering. (A) Zeven weken oude muizen werden op dag 0 achtereenvolgens geïnjecteerd met calceïne, op dag 4 met alizarinerood en vervolgens op dag 7 geofferd. Het gebied tussen calceïne (groen) en alizarine rode (rode) fluorescentielijnen vertegenwoordigt nieuw gevormd corticale bot gedurende vier dagen. (B) Minerale appositiesnelheid (MAR) en botvormingssnelheid (BFR/BS) berekend door de afstand van de twee lijnen vertegenwoordigen de osteogene activiteit van het corticale bot. (C) Het gebied tussen de calceïne (groen) en alizarine rode (rode) fluorescentielijnen vertegenwoordigt nieuw gevormd trabeculair bot in vier dagen. (D) MAR en BFR/BS vertegenwoordigen de osteogene activiteit van het trabeculaire bot. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD, n=5, *P<0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisch gemanipuleerde muismodellen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het mechanisme en de farmaceutische behandeling van menselijke ziekten13. Ctsk-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten6. De huidige studie beschreef de protocollen van de methoden om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastische activiteit in vivo controleren.
Histologische analyse is de beste intuïtieve methode om botmetabolisme te detecteren. En de kwaliteit van de paraffinesecties is de basis van de histologische analyse. Voldoende tijd voor volledige fixatie en ontkalking van het botweefsel is uiterst essentieel omdat botweefsels kunnen worden gefragmenteerd. Onderzoekers die zich richten op femora en tibiae moeten het dijbeen en scheenbeen onder een hoek van 90° in de inbeddingsstap plaatsen. Om een betrouwbare en hoogwaardige histologische analyse uit te voeren, kozen we voor sagittale paraffinesecties waarin de kraakbeenlaag symmetrisch was en een duidelijke M-vormige lijn in H&E-kleuring vertoonde, die de geschikte hoek en diepte van die continue secties vertegenwoordigt. Aan de andere kant, als u de kniegewrichten en aangrenzende gewrichtsbanden moet observeren, moeten het dijbeen en het scheenbeen onder een hoek van 120 ° worden geplaatst.
TRAP dient al tientallen jaren als biochemische marker voor osteoclastenfunctie14, aangezien het voornamelijk wordt uitgedrukt in osteoclasten15,16. Twee substraten worden meestal gebruikt om de zuurfosfataseactiviteit te beoordelen. Nafthol-ASBI fosfaat (N-ASBI-P) is een uitstekend substraat voor de osteoclastenspecifieke TRAP isoform 5b. Para-nitrofenylfosfaat (pNPP) kan echter ook worden gehydrolyseerd door niet-type 5 TRAPs17. Daarom is de nafthol-ASBI fosforzuur-pararosaniline methode voor histochemische demonstratie van TRAP zeer specifiek in weefselsecties17,18,19. Macrofaagfosfatase (zure fosfatase) heeft een pH-optimum van 5,0-6,0, waarbij het meestal tartraatbestendig is20. Daarom raden we aan dat in het protocol van TRAP-kleuringstest weefselsecties die opnieuw zijn gekleurd door hematoxyline niet worden ontkleurd met zoutzuur. Belangrijk is dat, hoewel osteoblasten en osteocyten in de buurt van botremodelleringsgebieden ook TRAP21uitdrukken, alleen enorme TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen als osteoclasten werden beschouwd. In deze studie vertoonden Stat3Ctsk muizen geremde osteoclastenactiviteit (Figuur 4).
Calceïne is een fluorchrome (groene fluorescentie) die veel wordt gebruikt om skeletgroei tijdens verkalking aan te geven. Het kan zich binden aan calcium en worden opgenomen in de nieuw gevormde calciumcarbonaatkristallen22. Evenzo werden calceïne, alizarinerood (rode fluorescentie) en tetracycline (gele fluorescentie) in het bot ingebouwd om de groei vanaf het moment van blootstelling te schatten23,24. Veel studies in het verleden hebben enkele fluorchromen (meestal calceïne) gebruikt om bot te labelen, maar waarnemers kunnen gemakkelijk worden verward tussen het nieuw gevormde bot en het oude bot, vooral in onregelmatig trabeculair bot. Daarom stellen we voor dat onderzoekers twee verschillende soorten fluorchromen in muizen injecteren om het nieuwere bot van het oudere bot te onderscheiden. Volgens onze tests kan calceïne in combinatie met alizarine het meest voldoende en blijvende contrast bereiken. In deze studie werd calceine-alizarine rode labeling gebruikt om de osteogene snelheid van botweefsel te detecteren en het bleek dat de osteoblastactiviteit niet werd beïnvloed bij de Stat3Ctsk-muizen (Figuur 5).
Kortom, om de kritische genen te begrijpen die de osteoclale activiteit controleren, beschrijft dit protocol een canonieke methode om een transgeen muismodel te genereren. Dit protocol beschrijft ook enkele typische technieken voor het analyseren van het skeletfenotype. In deze studie, de deletie van STAT3 verminderde osteoclastenvorming en verhoogde botmassa. Deze technieken kunnen interessant zijn voor degenen die nieuw zijn in skeletweefselonderzoek. Nochtans, zijn meer kenmerken van skeletsysteem betrokken voor verdere studie, zoals mechanische bezit25. En we moeten altijd de ontwikkeling van nieuwe technieken in de gaten houden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Wij danken prof. Weiguo Zou en S. Kato voor reagentia en muizen en de leden van het Zou laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook het Laboratorium voor Gedigitaliseerde Stomatologie en Onderzoekscentrum voor Craniofaciale Anomalieën van het Shanghai Ninth People's Hospital voor hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, het SHIPM-mu fonds van het Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], het Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong , het cross-disciplinaire onderzoeksfonds van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. En L.J. is een geleerde van de Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program en het "Chen Xing" project van shanghai Jiaotong University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
