Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

एक सशर्त Stat3 विलोपन माउस मॉडल के कंकाल फेनोटाइप विश्लेषण

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल वीवो में ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जीन को समझने के लिए एक विहित विधि का वर्णन करता है। यह विधि कंकाल फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल और कुछ विहित तकनीकों का उपयोग करती है।

Abstract

ट्रांसजेनिक माउस मॉडल ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और गतिविधि को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जीन को समझने और ऑस्टियोपोरोसिस के तंत्र और दवा उपचार का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली हैं। कैथेप्सिन कश्मीर (सीटीके) - क्रे चूहों का व्यापक रूप से ओस्टियोक्लास्ट के कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है। ट्रांसक्रिप्शन 3 (स्टेट3) का सिग्नल ट्रांसड्यूसर और एक्टिवेटर बोन होमोस्टेसिस में प्रासंगिक है, लेकिन वीवो में ऑस्टियोक्लास्ट में इसकी भूमिका खराब परिभाषित बनी हुई है। विवो साक्ष्य प्रदान करने के लिए कि स्टेट3 ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और हड्डी चयापचय में भाग लेता है, हमने एक ऑस्टियोक्लास्ट-विशिष्ट स्टेट3 विलोपन माउस मॉडल(स्टेट3 एफएल/एफएल; सीटीके-क्रे)और इसके कंकाल फेनोटाइप का विश्लेषण किया। माइक्रो सीटी स्कैनिंग और 3 डी पुनर्निर्माण सशर्त नॉकआउट चूहों में वृद्धि हुई हड्डी द्रव्यमान निहित । हड्डी चयापचय का पता लगाने के लिए एचएंडई स्टेनिंग, कैल्सीन और एलिजारिन रेड डबल स्टेनिंग, और टारट्रेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) धुंधला किया गया। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल कंकाल फेनोटाइप का विश्लेषण करने और वीवो में ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जीन का अध्ययन करने के लिए कुछ विहित तरीकों और तकनीकों का वर्णन करता है।

Introduction

कंकाल की हड्डी मानव शरीर का मुख्य भार-असर अंग है और चलने और व्यायाम के दौरान आंतरिक और बाहरी वातावरण दोनों से दबाव में है1। किसी के जीवन के दौरान, हड्डियां लगातार आत्म-नवीकरण के माध्यम से जाती हैं, जो ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोक्लास्ट द्वारा संतुलित होती है। ओस्टियोक्लास्ट की प्रक्रिया पुरानी हड्डियों को साफ करती है और नई हड्डी बनाने वाले ऑस्टियोब्लास्ट कंकाल प्रणाली के होमोसेस्टेसिस और यांत्रिक कार्य को बनाए रखते हैं2. संतुलन में गड़बड़ी से हड्डी मेटाबोलिक रोगों को प्रेरित किया जा सकता है, जैसे ऑस्टियोपोरोसिस। ऑस्टियोपोरोसिस, जो अतिरिक्त ऑस्टियोक्लास्टिक गतिविधि के कारण होता है, विश्व स्तर पर प्रचलित है और समाज को पर्याप्त आर्थिक नुकसान पहुंचाता है2,3,4। ऑस्टियोपोरोसिस उपचार के लिए उपलब्ध दवाओं की सीमित संख्या और प्रतिकूल प्रभाव 4 के जोखिम के अनुसार, ऑस्टियोक्लास्टगठनऔर गतिविधि के विवरण का अनावरण करना महत्वपूर्ण है।

मोनोसाइट/मैक्रोफेज हेमेटोपोइटिक वंश से प्राप्त ऑस्टियोक्लास्ट में कई नाभिक होते हैं (2 से 50 नाभिक हो सकते हैं) और बड़े होते हैं (आमतौर पर व्यास में 100 माइक्रोन से अधिक)2. यद्यपि तंत्र की खोज और ऑस्टियोक्लास्टिक विकारों के लिए दवाओं की स्क्रीनिंग को इन विट्रो ऑस्टियोक्लास्ट संस्कृति के माध्यम से व्यापक रूप से सुधारा गया है, जटिल कार्बनिक प्रतिक्रियाएं लक्षित चिकित्सा के लिए अपरिहार्य वीवो साक्ष्य में बनाती हैं। चूहों और मनुष्यों के बीच आनुवंशिक और रोगविज्ञानी समानताओं के कारण, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल आमतौर पर वीवो 6 में मानव रोग के तंत्र और दवा उपचार का अध्ययन करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। क्रे-लोक्सपी प्रणाली माउस जीन संपादन के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है और शोधकर्ताओं को ऊतक-/सेल-विशिष्ट तरीके से जीन कार्यों की जांच करने में सक्षम बनाया है5। कैथेप्सिन के (सीएसटीके) ऑस्टियोक्लास्ट द्वारा स्रावित एक सिस्टीन प्रोटीज है जो हड्डी कोलेजन8को नीचा कर सकता है। यह अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है कि सीटीके को परिपक्व ऑस्टियोप्लास्ट में चुनिंदा रूप से व्यक्त किया जाता है; इसलिए, सीटीस्क-क्रे चूहों को ऑस्टियोप्लास्ट के कार्यात्मक अध्ययनों के लिए एक उपयोगी उपकरण माना जाता है और इसका उपयोग6किया गया है ।

ट्रांसक्रिप्शन (स्टेट) परिवार का सिग्नल ट्रांसड्यूसर और एक्टिवेटर शास्त्रीय है और प्रतिरक्षा और कैंसर की प्रगति और विकास7,8में अत्यधिक महत्वपूर्ण है। सात एसटीएटी में से, स्टेट3 को बोन होरोस्टेसिस9,10के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक बताया गया है। वीवो अध्ययनों में कई लोगों ने बताया है कि ऑस्टियोब्लास्ट में स्टेट3 की विशिष्ट निष्क्रियता हड्डीनिर्माण 9,10कम हो जाती है । फिर भी, वीवो में ऑस्टियोक्लास्ट गठन और अस्थि चयापचय में स्टेट3 की भागीदारी के बारे में ठोस सबूत अभी भी सीमित है। हाल ही में, हमने वीवो साक्ष्य में ऑस्टियोक्लास्ट-विशिष्ट स्टेट3 विलोपन माउस मॉडल(स्टेट3एफएल/एफएल)प्रदान किया है; सीटीके-क्रे, जिसे इसके बाद स्टेट3सीटीकेकहा जाताहै) कि स्टेट3 ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और अस्थि चयापचय11में भाग लेता है। वर्तमान अध्ययन में, हम उन तरीकों और प्रोटोकॉलों का वर्णन करते हैं जिन्हें हम बोन होमोस्टेसिस पर ऑस्टियोक्लास्ट-विशिष्ट स्टेट3 विलोपन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए स्टेट3सीटीके चूहों के हड्डी द्रव्यमान, हड्डी हिस्टोमॉर्फोलॉजी, और बोन एनाबोलिज्म और कैटाबोलिज्म में परिवर्तनों का विश्लेषण करते थे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित जानवरों से संबंधित सभी तरीकों को शंघाई जियाओटोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दी थी ।

1. ऑस्टियोक्लास्ट विशिष्ट स्टेट3 विलोपन चूहों का प्रजनन

नोट: Stat3fl/fl चूहों व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे । सीटीएसके-क्रे चूहों को एस काटो (टोक्यो विश्वविद्यालय, टोक्यो, जापान12)द्वारा प्रदान किया गया था। चूहों को मानकीकृत परिस्थितियों में संस्थागत पशु सुविधा में विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) स्थितियों के तहत पैदा और बनाए रखा गया था ।

  1. एक ही उम्र के दो महिला चूहों के साथ एक यौन परिपक्व पुरुष माउस जोड़ी। 18 दिनों के बाद, नवजात शिशुओं के लिए दैनिक जांचों की जांच करें। गर्भवती मादा चूहों को अलग करें और जरूरत पड़ने पर उसे अकेला रखें। यदि मादा चूहों बांधना के 1 महीने के भीतर गर्भवती नहीं थी तो विभिन्न प्रजनन पिंजरों के बीच पुरुष चूहों को बदलें।
  2. क्रॉस Stat3fl/fl चूहों को Ctsk-Cre चूहों (F0) । जेनोटीपिंग के लिए पूंछ क्लिप और पुरुष Stat3fl/ Ctsk-Cre चूहों जब तक वे यौन परिपक्व हैं, जो उम्र के लगभग 6 सप्ताह (F1) है। निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करें: स्टेट3 एफ-टीटीजीएसीसीटीजीटीसीटीसीसीसीएएएए; स्टेट3 आर-सीसीटीगेटागगेकाका; सीटीस्क-क्रे एफ-GAACGCACTGATCGACCA; सीटीएसके-क्रे आर-जीसीटीएकागसीटीटीटीटीटीसीटीसीटीसीटीटीसी।
  3. क्रॉस 6 सप्ताह पुराने पुरुष Stat3fl/+; महिला Stat3fl/fl चूहों के साथ Ctsk-Cre चूहों । जेनोटीपिंग के लिए पूंछ क्लिप और पुरुष Stat3 fl/flरखने केलिए; Ctsk-Cre चूहों जब तक वे यौन परिपक्व हैं, जो उम्र के लगभग 6 सप्ताह (F2) है।
  4. क्रॉस 6 सप्ताह पुराने पुरुष Stat3 fl/fl; महिला Stat3fl/fl चूहों (F3) के साथ Ctsk-Cre चूहों । जीनोटाइपिंग के लिए पूंछ क्लिप और समय में छोटे चूहों के साथ पुराने प्रजनन चूहों की जगह (F3 + N) ।

2. नमूना संग्रह

  1. 8 सप्ताह पुराने पुरुष Stat3fl/fl और Stat3Ctsk लिटरमेट चूहों के छह जोड़े को कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation के साथ अलग से euthanize ।
    नोट: सीओ2 प्रवाह दर प्रति मिनट पिंजरे की मात्रा का 30% विस्थापित (उदाहरण के लिए, 45 सेमी x 30 सेमी x 30 सेमी पिंजरे के लिए सीओ2 प्रवाह दर 40 एल/मिनट है)।
  2. चूहों को एक रीढ़ की स्थिति में रखें। द्विपक्षीय कूल्हे के जोड़ों को हाथ से धीरे-धीरे विस्थापित करें। त्वचा को डिस्टल टिबिया से लंबवत काटने के लिए नेत्र कैंची का प्रयोग करें और फिर पूरे त्वचा को हिंद अंग से काट लें।
  3. हिंद अंग को अलग करने के लिए कैंची के साथ दाहिने कूल्हे के जोड़ और घुटने के जोड़ के आर्टिकुलर स्नायु को काट दें। ट्रोचंटर और फिबुला के जंक्शन को काटें और फिर हिंद अंग को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में विसर्जित करें। 3 चरण के लिए दाहिने हिंद अंग रखें। उचित रूप से दोनों सिरों पर हड्डी को पूरी तरह से विसर्जित करने और 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ बोन मैरो को ठीक करने के लिए काटें।
  4. कैंची के साथ बाएं कूल्हे के जोड़ और घुटने के जोड़ के आर्टिकुलर स्नायु को काटें, धीरे-धीरे नरम ऊतक को हटा दें, और ध्यान से टिबिया और फीमर को अलग करें। टिबिया और फीमर को 75% इथेनॉल में अलग से विसर्जित करें। स्टेप 4 के लिए फेमोरा रखें और स्टेप 6 के लिए टिबिया। ट्रोचर को अक्षुण्ण रखना सुनिश्चित करें।

3. पैराफिन सेक्शन की तैयारी

  1. 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में दाहिने हिंद अंग को ठीक करें।
  2. डिक्लेबलिफाई करें: नमूनों को 10 मिनट 3 बार के लिए 1x पीबीएस के साथ धीरे से धोएं। 15% EDTA में नमूनों को डिक्लेयर (डीडीएच2ओ के 800 मिलीएल में 150 ग्राम ईडीटीए और 10x पीबीएस के 100 मिलीएल) में 3 से 4 सप्ताह तक अल्ट्रासोनिक डिकाल्टिफायर के साथ जब तक हड्डियों को झुकाया जा सकता है। हर दूसरे दिन ताजा डिक्लेबलिंग तरल पदार्थ के साथ बदलें।
  3. नमूनों को धीरे-धीरे 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं और फिर उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 75% इथेनॉल में विसर्जित करें।
  4. निर्जलीकरण: दूसरे दिन, क्रमिक रूप से 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल और जाइलीन में नमूनों को विसर्जित किया जाता है, प्रत्येक के लिए 1 घंटे के लिए दो बार।
  5. 30 मिनट के लिए 1/2 जाइलीन 1/2 पैराफिन में विसर्जित नमूनों । नमूनों को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन में विसर्जित कर दिया।
  6. एम्बेड: एम्बेडिंग के लिए एक उपयुक्त एम्बेडिंग टैंक चुनें। टिबिया को समान रूप से नीचे रखें। फीमर और टिबिया को 90 डिग्री कोण पर रखें। पैराफिन पूरी तरह से ठंडा और जम जाने के बाद, इसे एम्बेडिंग टैंक से हटा दें। नमूनों की संख्या और उन्हें रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. माइक्रोटॉम का उपयोग करके लगातार 5 माइक्रोन मोटी धाराओं को काटें। 20-40 वर्गों को काटें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी पर वर्गों को फैलाएं, माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए उनका पालन करें, और रात भर 42 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।

4. माइक्रो सीटी स्कैनिंग और विश्लेषण

  1. बाएं फेमोरा को माइक्रो-सीटी स्कैनर से स्कैन करें। संकल्प: 10 माइक्रोन; वोल्टेज: 70 केवी; वर्तमान: 114 μA; फ्लिटर: 0.5 मिमी अल; रोटेशन चरण: 0.5 डिग्री।
  2. निर्माता के निर्देश के बाद स्कैनर के सहायक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉर्टिकल हड्डी और ट्रैबकुलर हड्डी की 3डी छवियों का पुनर्निर्माण करें। आरओआई डिस्टल ग्रोथ प्लेट के करीब ट्रैबकुलर हड्डी की कुल 1 मिमी चौड़ाई में और फेमोरा के बीच में कॉर्टिकल हड्डी के कुल 1 मिमी चौड़े खंड में हैं।
  3. मात्रात्मक माइक्रोआर्साइटिक्चर मापदंडों की गणना करें: बोन मिनरल डेंसिटी (बीएमडी), बोन वॉल्यूम अंश (बीवी/टीवी), ट्रैबेकुलर मोटाई (Tb.Th.), ट्रैबेकुलर नंबर (TB.N.), ट्रैबकुलर सेपरेशन (TB.Sp.), और कॉर्टिकल बोन मोटाई (Ct.Th.)।

5. जाल धुंधला

  1. पैराफिन वर्गों को 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  2. डेवैक्स: 10 मिनट के लिए जाइलीन में वर्गों को विसर्जित करें। ताजा जाइलीन के साथ इस चरण 3x प्रदर्शन करते हैं।
  3. रिहाइड्रेट: 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल और डीडीएच2ओ में क्रमवार अनुभागों को विसर्जित करें, प्रत्येक के लिए 5 मिनट के लिए दो बार।
  4. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ट्रैप धुंधला किट का उपयोग करके धुंधला समाधान तैयार करें और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    नोट: जाल धुंधला समाधान हौसले से हर परख से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए ।
  5. प्रत्येक नमूने में 50-100 माइक्रोन धुंधला समाधान जोड़ें और 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें। हर 5 मिनट में एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे ऑस्टियोक्लास्ट की धुंधला स्थिति की जांच करें जब तक कि लाल बहुनीय ऑस्टियोक्लास्ट देखा जा सकता है। डीएच2ओ के साथ प्रतिक्रिया समाप्त करें।
  6. 30 एस के लिए हेमेटॉक्सीलिन समाधान में काउंटरटाइन। 1 मिनट के लिए 1% अमोनिया समाधान में विसर्जन करके एक स्थिर नीला रंग बनाएं। धीरे-धीरे चल रहे नल के पानी में कुल्ला।
  7. तटस्थ बालसम का उपयोग करके कवरस्लिप के साथ वर्गों को माउंट करें और रात भर सूखी।
  8. एक माइक्रोस्कोप द्वारा ब्याज के 3-5 क्षेत्रों पर कब्जा। इमेज जे द्वारा ट्रैबेक्युलर परिधि का विश्लेषण करें: एल1 के रूप में'सीधी रेखा'उपकरण का उपयोग करके स्केल बार (एलएस) की लंबाई को मापें, फिर एल 2 के रूप में'खंडित रेखा'उपकरण का उपयोग करके ट्रैबेकुलर परिधि की लंबाई को मापें, भौतिक लंबाई (एलपी)= एलएसएस * एल2 /एल 1)। तीन से अधिक नाभिक के साथ जाल पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या गिनती।

6. कैल्सीन और एलिजरिन रेड डबल लेबलिंग

  1. नमूना तैयारी: इंट्रापेरिटोनेली 0 दिन में 20 मिलीग्राम/किलो कैलोरी (2% नाएचसीओ 3 समाधान में1 मिलीग्राम/एमएल) और 4 दिन में 25 मिलीग्राम/किलो एलिजारिन रेड एस (एएल, 2 मिलीग्राम/एमएल एच2ओ में) इंजेक्ट करें । 7 दिन चूहों का बलिदान। टिबिया को सावधानी से अलग करें और 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड में ठीक करें।
  2. निर्जलीकरण: निर्धारण के बाद, धीरे से 1x PBS के साथ टिबिया 3x धोएं। क्रमिक रूप से 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल और जाइलीन में नमूनों को दो बार अलग से 5 मिनट के लिए विसर्जित करते हैं।
  3. 12 घंटे के लिए एसीटोन में नमूनों विसर्जित, 1/2 एसीटोन 1/2 राल में 2 घंटे के लिए, और शुद्ध राल में एक सुखाने ओवन में रात भर ।
    नोट: राल निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध राल (जैसे, एम्बेड 812 राल) द्वारा तैयार किया गया था।
  4. एम्बेड: एक उपयुक्त सिलिका जेल एम्बेडिंग टैंक में शुद्ध राल जोड़ें और बुलबुले से बचने के लिए नमूनों को धीरे-धीरे रखें। 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने वाले ओवन में राल को पॉलीमराइज करें।
  5. नमूनों को रोटरी माइक्रोटॉम के साथ लगातार 5 माइक्रोन मोटी धाराओं में काटें। बाकी नमूनों को कमरे के तापमान पर डिशरेंट के साथ स्टोर करें।
  6. 75% शराब की एक बूंद में चिमटी के साथ वर्गों का पालन करें। तटस्थ बालसम का उपयोग करके कवर्लिप्स के साथ वर्गों को माउंट करें। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ लाल और हरे रंग की फ्लोरेसेंस लेबलिंग पर कब्जा करें।
  7. दो लेबलिंग लाइनों (Ir.L.Wi), एकल लेबल वाले ट्रैबेक्युलर परिधि (sL.Pm), डबल-लेबल वाले ट्रैबकुलर परिधि (dL.Pm), और कुल ट्रैबेक्युलर परिधि (Tb.Pm) के बीच चौड़ाई को मापें। मिनरल अपोजिशन रेट (MAR) और बोन फॉर्मेशन रेट (बीएफआर/बीएस) की गणना करें। मार्च = Ir.L.Wi/अंतराल दिन । बीएफआर/बीएस= (dL.Pm±एसएल.पीएम/2) * MAR/Tb.Pm*100%।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, ऑस्टियोक्लास्ट विशिष्ट स्टेट 3 विलोपन चूहों को ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव पर स्टेट3 विलोपन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उत्पन्न किया गया था। Stat3Ctsk चूहों और उनके वाइल्डटाइप (WT) लिटरमेट्स पैदा किए गए और जीनोटाइपिंग के बाद रखा गया । बोन मैरो मैक्रोफेज को ऑस्टियोक्लास्ट में अलग-थलग और सुसंस्कृत किया गया था, और स्टेट 3सीटीके चूहों में स्टेट3 विलोपन का प्रदर्शन किया गया था(चित्र 1)।

माइक्रो-सीटी द्वारा फेमोरा पुनर्निर्माण और मात्रात्मक विश्लेषण से संकेत मिलता है कि STAT3Ctsk चूहों की हड्डी द्रव्यमान WT चूहों(चित्रा 2)की तुलना में बढ़ गया था ।

डब्ल्यूटीई और स्टेट3सीटीके चूहों से फेमोरा की हिस्टोमॉर्फोलॉजी की जांच एचएंडई स्टेनिंग(चित्रा 3) केमाध्यम से की गई थी।

चूहों में ऑस्टियोसास्टोस्टोजेनिक गतिविधि का पता ट्रैप स्टेनिंग से लगाया गया था। ऑस्टियोक्लास्ट ट्रैप+ (वाइन रेड या पर्पल) कोशिकाएं थीं जिनमें कई नाभिक और विशाल आकार(चित्रा 4ए)थे। डब्ल्यूटीई चूहों(चित्रा 4B)की तुलना में स्टेट3सीटीएसके चूहों में ट्रैप+ ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या कम थी, जो इंगित करता है कि स्टेट 3 की कमी बिगड़ा ऑस्टियोक्लास्ट गठन।

चूहों में ऑस्टियोजेनेसिस का प्रतिनिधित्व खनिज अपोजिशन रेट (मार्च) द्वारा किया जाता है और इसे कैल्सीन और एलिजरिन रेड डबल लेबलिंग(चित्रा 5)द्वारा मापा जाता था। कैल्सीन और एलिजारिन लाल को क्रमिक रूप से इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिया गया था। इसलिए, कैल्सीन (हरे) और एलिजारिन लाल (लाल) फ्लोरेसेंस लाइनों के बीच का क्षेत्र चार दिनों में नवगठित हड्डी का प्रतिनिधित्व करता है। जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है, ऑस्टियोक्लास्ट में हटाए गए स्टेट3 ने हड्डी एनाबोलिज्म को प्रभावित नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1: ऑस्टियोक्लास्ट विशिष्ट स्टेट 3 विलोपन माउस मॉडल पीढ़ी और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का चित्रण। (A)कैथेप्सिन के (सीटीके) में स्टेट3 विलोपन का योजनाबद्ध आरेख-क्रे-लोक्सपी प्रणाली के माध्यम से ऑस्टियोक्लास्ट व्यक्त करना । (ख)ऑस्टियोक्लास्ट विशिष्ट स्टेट3 विलोपन चूहों की प्रजनन प्रगति। Stat3fl/fl चूहों को पार कर गए Ctsk-Cre चूहों (F0) विषम Stat3fl/+उत्पन्न करने के लिए; सीटीके-क्रे चूहों (F1) । पुरुष Stat3fl/+; Ctsk-Cre चूहों रखा और महिला Stat3fl/fl चूहों को पार करने के लिए homozygous Stat3fl/flउत्पन्न किया गया; सीटीके-क्रे चूहों (F2) । पुरुष Stat3fl/fl; Ctsk-Cre चूहों रखा और महिला Stat3fl/fl चूहों को पार करने के लिए Stat3fl/flउत्पन्न किया गया; Ctsk-Cre चूहों और Stat3fl/fl चूहों । (ग)चूहों के विभिन्न जीनोटाइप के लिए जेनोटीपिंग। Stat3 उत्परिवर्ती: १८७ बीपी, Stat3 वाइल्डटाइप: १४६ बीपी, सीआरई: २०० बीपी .(D)ओस्टियोक्लास्ट्स में स्टेट3 के पश्चिमी दाग Stat3fl/fl और Stat3Ctsk चूहों से अस्थि मज्जा मैक्रोफेज के साथ सुसंस्कृत । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: माइक्रो-सीटी स्कैनिंग का उपयोग करके चूहों के फेमोरा में त्रि-आयामी पुनर्निर्माण और मात्रात्मक माइक्रोआर्किटेचर पैरामीटर विश्लेषण। (क)8 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटीई और स्टेट3सीटीके चूहों से फेमोरा की ट्रैबेकुलर हड्डी की तीन आयामी रूप से खंगाला गया माइक्रो-सीटी छवियां । ब्याज का क्षेत्र (आरओआई) डिस्टल ग्रोथ प्लेट के करीब ट्रैबेकुलर बोन की कुल 1 मिमी चौड़ाई में था। (ख)3डी ने 8 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटीई और स्टेट3सीटीके चूहों से फेमोरा की कॉर्टिकल बोन की माइक्रो-सीटी छवियों को खंगाला । आरओआई फेमोरा के बीच से कॉर्टिकल बोन के कुल 1 मिमी चौड़े खंड में था। (सी-एच) माइक्रो-सीटी के मात्रात्मक माइक्रोआर्ट्रिकिक्चर पैरामीटर: बोन मिनरल डेंसिटी (बीएमडी), बोन वॉल्यूम डिपेंशन (बीवी/टीवी), ट्रैबकुलर मोटाई (Tb.Th.), ट्रैबकुलर नंबर (TB.N.), ट्रैबकुलर सेपरेशन (TB.Sp.), और कॉर्टिकल बोन मोटाई (Ct.Th.)। त्रुटि सलाखों के मतलब ± एसडी, n = 4, * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एचएंडई धुंधला के माध्यम से प्रदर्शित डब्ल्यूटीई और स्टेट3सीटीके चूहों से फेमोरा की हिस्टोमॉर्फोलॉजी। एम के आकार का बिंदीदार वक्र एक उपास्थि परत को इंगित करता है। कॉर्टिकल हड्डी के सापेक्ष उच्च शक्ति क्षेत्र बिंदीदार लाइनों के साथ बॉक्स्ड और नीचे प्रदर्शित किया जाता है। ट्राबेकुलर हड्डी के सापेक्ष उच्च शक्ति क्षेत्र बिंदीदार लाइनों के साथ परिक्रमा की है और नीचे प्रदर्शित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जाल धुंधला के माध्यम से प्रतिनिधित्व चूहों के फेमोरा में ऑस्टियोप्लास्टोजेनेसिस। (A)8 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटीई और स्टेट3सीटीके चूहों से फेमोरा का ट्रैपधुंधला । ट्रैप+ बहुनीय ऑस्टियोक्लास्ट काले त्रिकोण द्वारा इंगित किए जाते हैं। बिंदीदार रेखाओं के साथ परिक्रमा की ऑस्टियोक्लास्ट के सापेक्ष उच्च शक्ति क्षेत्र नीचे प्रदर्शित कर रहे हैं, कई नाभिक और एक विशाल आकार का प्रदर्शन । (ख)ट्रैप+ मल्टीन्यूक्लिटेड ऑस्टियोक्लास्ट के नंबरों की गिनती की गई । त्रुटि सलाखों के मतलब ± एसडी, n = 5, * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: चूहों के फेमोरा में ऑस्टियोजेनेसिस कैल्सीन और एलिजारिन रेड डबल लेबलिंग के माध्यम से प्रतिनिधित्व करता है। (क)सात सप्ताह पुराने चूहों को क्रमिक रूप से 0 दिन पर कैल्सीन के साथ इंजेक्शन दिया गया, 4 दिन पर अलीजारिन लाल के साथ, और फिर 7 दिन पर बलिदान । कैल्सेइन (हरा) और एलिजारिन लाल (लाल) फ्लोरेसेंस लाइनों के बीच का क्षेत्र चार दिनों में नवगठित कॉर्टिकल हड्डी का प्रतिनिधित्व करता है। (B)खनिज अपोजिशन रेट (MAR) और बोन फॉर्मेशन रेट (बीएफआर/बीएस) की गणना दो लाइनों की दूरी से कॉर्टिकल बोन की ऑस्टियोजेनिक एक्टिविटी का प्रतिनिधित्व करती है । (ग)कैल्सीन (हरा) और एलिजारिन लाल (लाल) फ्लोरेसेंस लाइनों के बीच का क्षेत्र चार दिनों में नवगठित ट्रैबेकुलर हड्डी का प्रतिनिधित्व करता है । (घ)MAR और BFR/BS ट्राबेकुलर बोन की ऑस्टियोजेनिक गतिविधि का प्रतिनिधित्व करते हैं । त्रुटि सलाखों के मतलब ± एसडी, n = 5, * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आनुवांशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का उपयोग आमतौर पर मानव रोग के तंत्र और दवा उपचार का अध्ययन करने के लिए कियाजाताहै । सीटीके-क्रे चूहों का व्यापक रूप से ओस्टियोक्लास्ट6के कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है। वर्तमान अध्ययन में कंकाल फेनोटाइप का विश्लेषण करने और वीवो में ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जीनों का अध्ययन करने के तरीकों के प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया ।

हड्डी चयापचय का पता लगाने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण सबसे अच्छा सहज तरीका है। और पैराफिन वर्गों की गुणवत्ता हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का आधार है। हड्डी के ऊतकों के पूर्ण निर्धारण और डिक्लेरेशन के लिए पर्याप्त समय अत्यंत आवश्यक है क्योंकि हड्डी के ऊतकों को खंडित किया जा सकता है। फेमोरा और टिबिया पर ध्यान केंद्रित करने वाले शोधकर्ताओं को एम्बेडिंग स्टेप में फीमर और टिबिया को 90 डिग्री कोण पर लगाना चाहिए। विश्वसनीय और उच्च गुणवत्ता वाले हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का संचालन करने के लिए, हमने sagittal पैराफिन वर्गों को चुना जिसमें उपास्थि परत सममित थी और एचएंडई धुंधला में एक स्पष्ट एम-आकार की रेखा दिखाई गई, जो उन निरंतर वर्गों के उपयुक्त कोण और गहराई का प्रतिनिधित्व करती है। दूसरी ओर, यदि आपको घुटने के जोड़ों और आसन्न आर्टिकुलर स्नायु का निरीक्षण करने की आवश्यकता है, तो फीमर और टिबिया को 120 डिग्री कोण पर रखा जाना चाहिए।

ट्रैप ने दशकों तक ऑस्टियोप्लास्ट फंक्शन14के लिए बायोकेमिकल मार्कर के रूप में काम किया है , क्योंकि यह मुख्य रूप से ऑस्टियोक्लास्ट15,16में व्यक्त किया जाता है । आमतौर पर एसिड फॉस्फेट गतिविधि का आकलन करने के लिए दो सब्सट्रेट्स का उपयोग किया जाता है। नेफथॉल-एएसबीआई फॉस्फेट (एन-एएसबीआई-पी) ऑस्टियोक्लास्ट-स्पेसिफिक ट्रैप आइसोफॉर्म 5बी के लिए एक उत्कृष्ट सब्सट्रेट है। हालांकि, पैरा-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (पीपीपीपी) को नॉनटाइप 5 ट्रैप17द्वारा भी हाइड्रोलिज किया जा सकता है। इसलिए, ट्रैप के हिस्टोकेमिकल प्रदर्शन के लिए नैफथोल-एएसबीआई फॉस्फोरिक एसिड-पैरारोसिनिनविधि ऊतक वर्ग17, 18,19में अत्यधिक विशिष्ट है। मैक्रोफेज फॉस्फेटेस (एसिड फॉस्फेटे) में 5.0-6.0 का पीएच इष्टतम होता है, जिस पर यह ज्यादातर टार्ट्रेट प्रतिरोधी20होता है। इस प्रकार, हम अनुशंसा करते हैं कि ट्रैप धुंधला परख के प्रोटोकॉल में, हेमैटॉक्सीलिन द्वारा ऊतक वर्गों को फिर से दाग दिया जाना चाहिए हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ अलग नहीं किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात यह है कि हालांकि अस्थि पुनर्मॉडलिंग क्षेत्रों के करीब ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोसाइट्स भीजाल 21व्यक्त करते हैं, तीन से अधिक नाभिक वाले केवल विशाल जाल-सकारात्मक कोशिकाओं को ऑस्टियोक्लास्ट माना जाता था। इस अध्ययन में, Stat3Ctsk चूहों बाधित ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि(चित्र 4) दिखाया

कैल्सीन एक फ्लोरोक्रोम (ग्रीन फ्लोरेसेंस) है जिसका व्यापक रूप से कैलिफिकेशन के दौरान कंकाल विकास को इंगित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसे कैल्शियम से बांधकर नवगठित कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल22में शामिल किया जा सकता है . इसी प्रकार, एक्सपोजर23, 24के समय से विकास का अनुमान लगाने के लिए कैल्सीन, एलिजारिन लाल (लाल फ्लोरेसेंस), और टेट्रासाइक्लिन (पीला फ्लोरेसेंस) हड्डी में बनाया गया था। अतीत में कई अध्ययनों ने हड्डी को लेबल करने के लिए एकल फ्लोरोक्रोम (आमतौर पर कैल्सीन) का उपयोग किया है, लेकिन पर्यवेक्षकों को नवगठित हड्डी और पुरानी हड्डी के बीच आसानी से भ्रमित किया जा सकता है, विशेष रूप से अनियमित ट्रैबेकुलर हड्डी में। इसलिए, हमारा सुझाव है कि शोधकर्ता पुरानी हड्डी से नई हड्डी को अलग करने के लिए चूहों में दो अलग-अलग प्रकार के फ्लोरोक्रोम इंजेक्ट करते हैं। हमारे परीक्षणों के अनुसार, एलिजारिन के साथ मिलकर कैल्सीइन सबसे पर्याप्त और स्थायी विपरीत प्राप्त कर सकता है। इस अध्ययन में, हड्डी के ऊतकों की ऑस्टियोजेनिक दर का पता लगाने के लिए कैल्सीन-एलिजारिन रेड लेबलिंग का उपयोग किया गया था और यह पता चला कि स्टेट3सीटीके चूहों(चित्रा 5)में ऑस्टियोब्लास्ट गतिविधि प्रभावित नहीं थी।

संक्षेप में, ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जीन को समझने के लिए, यह प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक विहित विधि का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल कंकाल फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए कुछ विशिष्ट तकनीकों का भी वर्णन करता है। इस अध्ययन में, STAT3 बिगड़ा ऑस्टियोक्लास्ट गठन और हड्डी द्रव्यमान में वृद्धि के विलोपन। ये तकनीक उन लोगों के लिए दिलचस्प हो सकती है जो कंकाल ऊतक अनुसंधान के लिए नए हैं। हालांकि, कंकाल प्रणाली की अधिक विशेषताओं का संबंध आगे के अध्ययन के लिए है, जैसे यांत्रिक संपत्ति25। और हमें हमेशा नई तकनीकों के विकास पर आंखें रखने की जरूरत है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रो Weiguo Zou और एस Kato reagents और चूहों और उपयोगी चर्चा के लिए Zou प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी सहायता के लिए शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल के Craniofacial विसंगतियों के लिए डिजिटाइज्ड Stomatology और अनुसंधान केंद्र के लिए प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (एनएसएफसी) [81570950,81870740,81800949] से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, शंघाई शिखर सम्मेलन और पठारी विषयों, शंघाई इंस्टीट्यूट ऑफ प्रिसिजन मेडिसिन, शंघाई नौवें पीपुल्स हॉस्पिटल, शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन [JC201809], शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के लिए उच्च स्तरीय नवाचार टीम की प्रोत्साहन परियोजना से शिपएम-एमयू फंड , शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल, शंघाई जियाओटोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन [JYJC201902] के क्रॉस-डिसिप्लिनरी रिसर्च फंड । और एलजे उत्कृष्ट युवा चिकित्सा प्रतिभाओं के एक विद्वान है, शंघाई "चिकित्सा प्रतिभा के उभरते सितारे" युवा विकास कार्यक्रम और शंघाई Jiaotong विश्वविद्यालय से "चेन Xing" परियोजना ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  4. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
  5. Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
  6. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  7. Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
  8. Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
  9. Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
  10. Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
  11. Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
  12. Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
  13. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
  14. Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
  15. Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
  16. Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
  17. Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
  18. Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
  19. Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
  20. Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
  21. Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
  22. Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
  23. Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
  24. Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
  25. Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).

Tags

जीव विज्ञान अंक 161 कंकाल फेनोटाइप हड्डी चयापचय लेबलिंग ऑस्टियोक्लास्ट स्टेट3 ट्रांसजेनिक चूहों
एक <em>सशर्त Stat3</em> विलोपन माउस मॉडल के कंकाल फेनोटाइप विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter