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Biology

Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un método canónico para entender los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo. Este método utiliza un modelo de ratón transgénico y algunas técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético.

Abstract

Los modelos transgénicos del ratón son potentes para entender los genes críticos que controlan la diferenciación y la actividad del osteoclast, y para estudiar mecanismos y tratamientos farmacéuticos de la osteoporosis. Los ratones de catepsina K (Ctsk)-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es relevante en la homeostasis ósea, pero su papel en los osteoclastos in vivo sigue estando mal definido. Para proporcionar la evidencia in vivo de que STAT3 participa en la diferenciación de osteoclastos y el metabolismo óseo, se generó un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre) y analizó su fenotipo esquelético. La exploración de Micro-CT y la reconstrucción 3D implicaron la masa creciente del hueso en los ratones condicionales del golpe de gracia. La coloración de H&E, la coloración doble roja de la caleína y del alizarin, y la coloración ácida tartrato-resistente de la fosfatasa (TRAMPA) fueron realizadas para detectar metabolismo del hueso. En definitiva, este protocolo describe algunos métodos y técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético y estudiar los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo.

Introduction

El hueso esquelético es el principal órgano de carga del cuerpo humano y está bajo la presión del entorno interno y externo durante la marcha y el ejercicio1. A lo largo de la vida, los huesos pasan continuamente por la auto-renovación, que es equilibrada por osteoblastos y osteoclastos. El proceso de los osteoclastos que limpian los huesos viejos y los osteoblastos que forman el hueso nuevo mantiene la homeostasis y la función mecánica del sistema esquelético2. La alteración en el equilibrio puede inducir enfermedades metabólicas óseas, como la osteoporosis. La osteoporosis, que es causada por el exceso de actividad osteoclástica, es prevalente a nivel mundial y causa pérdidas económicas sustanciales a la sociedad2,3,4. De acuerdo con el número limitado de fármacos disponibles para el tratamiento de la osteoporosis y su riesgo de efectos adversos4,es importante desvelar los detalles de la formación y actividad de los osteoclastos.

Los osteoclastos derivados del linaje hematopoyético monocitos/macrófagos tienen múltiples núcleos (pueden tener de 2 a 50 núcleos) y son grandes (generalmente mayores de 100 μm de diámetro)2. Aunque la exploración de mecanismos y la investigación de las drogas para los desordenes osteoclastic se hayan mejorado extensamente vía cultura osteoclasta in vitro, las reacciones orgánicas complicadas hacen in vivo la evidencia indispensable para la terapia apuntada. Debido a las similitudes genéticas y fisiopatológicas entre ratones y humanos, los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar los mecanismos y los tratamientos farmacéuticos de las enfermedades humanas in vivo6. El sistema Cre-loxP es una tecnología ampliamente utilizada para la edición de genes de ratón y ha permitido a los investigadores investigar las funciones de los genes de una manera específica de tejidos/células5. La catepsina K (CSTK) es una cisteína proteasa secretada por osteoclastos que puede degradar el colágenoóseo 8. Está bien aceptado que CTSK se expresa selectivamente en osteoclastos maduros; por lo tanto, los ratones Ctsk-Cre son considerados como una herramienta útil para estudios funcionales de osteoclastos y se ha utilizado6.

La familia del transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) es clásica y altamente significativa en la inmunidad y en la progresión y desarrollo del cáncer7,8. Entre siete ESTAT, STAT3 se divulga para ser el más relevante al homeostasis del hueso9,10. Varios estudios in vivo han reportado que la inactivación específica de STAT3 en osteoblastos disminuye la formaciónósea 9,10. Sin embargo, la evidencia sólida con respecto a la participación de STAT3 en la formación de osteoclastos y el metabolismo óseo in vivo todavía es limitada. Recientemente, proporcionamos evidencia in vivo con un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, en adelante llamado Stat3Ctsk) que STAT3 participa en la diferenciación osteoclasta y metabolismo óseo11. En el presente estudio, describimos los métodos y protocolos que utilizamos para analizar los cambios en la masa ósea, la histomorfología ósea y el anabolismo óseo y el catabolismo de los ratones Stat3Ctsk con el fin de estudiar la influencia de la deleción osteoclasta-específica de STAT3 en la homeostasis ósea.

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Protocol

Todos los métodos relacionados con los animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

1. Cría de ratones de deleción Stat3 específicos de osteoclasto

NOTA: Stat3fl /fl ratones se obtuvieron comercialmente. Los ratones Ctsk-Cre fueron proporcionados por S. Kato (Universidad de Tokio, Tokio, Japón12). Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en la instalación animal institucional bajo condiciones estandarizadas.

  1. Emparejar un ratón macho sexualmente maduro con dos ratones hembra de la misma edad. Después de 18 días, revise los controles diarios de recién nacidos. Separe las hembras preñadas y manténgala sola si es necesario. Cambie los ratones machos entre diferentes jaulas de cría si los ratones hembra no estaban preñados dentro de 1 mes del emparejamiento.
  2. Cruza ratonesfl/fl Stat3a ratones Ctsk-Cre (F0). Recorte las colas para el genotipado y mantenga el macho Stat3fl /+; Ratones Ctsk-Cre hasta que son sexualmente maduros, que es alrededor de 6 semanas de edad (F1). Utilice los siguientes cebadores: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
  3. Cruz 6-semana de edad macho Stat3fl /+; Ratones Ctsk-Cre con hembras de ratones Stat3fl/fl. Recorte las colas para el genotipado y mantenga el macho Stat3 fl / fl; Ratones Ctsk-Cre hasta que son sexualmente maduros, que es alrededor de 6 semanas de edad (F2).
  4. Cruz 6-semana de edad macho Stat3 fl/fl; Ratones Ctsk-Cre con ratones hembras Stat3fl/fl (F3). Recorte las colas para el genotipado y reemplace los ratones reproductores viejos con ratones más jóvenes a tiempo (F3 + N).

2. Recolección de especímenes

  1. Eutanasia seis pares de ratones machos de 8 semanas de edad Stat3fl/fl y Stat3Ctsk littermate por separado con asfixia de dióxido de carbono.
    NOTA: El caudal de CO2 desplaza el 30% del volumen de la jaula por minuto (por ejemplo, para una jaula de 45 cm x 30 cm x 30 cm, la tasa de flujo de CO2 es de 40 L/min).
  2. Coloque los ratones en decúbito supino. Dislocar las articulaciones bilaterales de la cadera suavemente con la mano. Use tijeras oftálmicas para cortar la piel verticalmente de la tibia distal y luego diseccione toda la piel de la extremidad posterior.
  3. Corte el ligamento articular de la articulación de la cadera derecha y la articulación de la rodilla con tijeras para separar la extremidad posterior. Corte el trocánter y la unión del peroné y luego sumerja el miembro posterior en paraformadehído al 4%. Mantenga las extremidades posteriores derechas para el paso 3. Corte adecuadamente el hueso en ambos extremos para sumergir completamente y fijar la médula ósea con paraformadehído al 4%.
  4. Corte el ligamento articular de la articulación izquierda de la cadera y la articulación de la rodilla con tijeras, retire suavemente el tejido blando y separe cuidadosamente la tibia y el fémur. Sumergir la tibia y el fémur por separado en etanol al 75%. Mantenga los fémures para el paso 4 y las tibias para el paso 6. Asegúrese de mantener el trocánter intacto.

3. Preparación de la sección de parafina

  1. Fijar el miembro posterior derecho en paraformadehído al 4% a 4 °C durante 48 h.
  2. Descalcificar: Lavar suavemente las muestras con 1x PBS durante 10 min 3 veces. Descalcificar las muestras en EDTA al 15% (150 g EDTA en 800 mL de ddH2O y 100 mL de PBS 10x) con un descalcificador ultrasónico durante 3 a 4 semanas hasta que los huesos puedan ser doblados. Reemplácelo con líquido descalcificante fresco cada dos días.
  3. Lave suavemente las muestras 3x con 1x PBS y luego sumérjalas en etanol al 75% a 4 °C durante la noche.
  4. Deshidratar: En el segundo día, sumergir secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno, cada una durante 1 h dos veces.
  5. Sumergir los especímenes en 1/2 xileno 1/2 parafina durante 30 min. Sumergir los ejemplares en parafina a 65 °C durante la noche.
  6. Incrustar: Seleccione un tanque de incrustación adecuado para la incrustación. Coloque la tibia uniformemente debajo. Coloque el fémur y la tibia en un ángulo de 90°. Después de que la parafina se haya enfriado y solidificado por completo, retírela del tanque de incrustación. Numerar los especímenes y almacenarlos a -20 °C durante la noche.
  7. Cortar secciones de 5 μm de espesor continuamente usando el microtomo. Corte de 20 a 40 secciones. Extienda las secciones en agua de 37 °C, adhiérelas a los portaobjetos del microscopio y hornee a 42 °C durante la noche.

4. Exploración y análisis de micro-TC

  1. Escanee los fémures izquierdos con un escáner micro-CT. Resolución: 10 μm; Voltaje: 70 kV; Corriente: 114 μA; Fliter: 0.5 mm Al; Paso de rotación: 0.5°.
  2. Reconstruya imágenes 3D del hueso cortical y del hueso trabecular utilizando el software de soporte del escáner siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ROIs están en un ancho total de 1 mm de hueso trabecular cerca de la placa de crecimiento distal y en una sección total de 1 mm de ancho de hueso cortical en el centro de los fémures.
  3. Calcule los parámetros cuantitativos de la microarquitectura: densidad mineral ósea (DMO), fracción de volumen óseo (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separación trabecular (Tb.Sp.) y grosor óseo cortical (Ct.Th.).

5. Tinción trap

  1. Hornear las secciones de parafina a 65 °C durante 30 min.
  2. Dewax: Sumergir las secciones en xileno durante 10 min. Realice este paso 3x con xileno fresco.
  3. Rehidratar: Sumergir las secciones secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y ddH2O, cada una durante 5 min dos veces.
  4. Prepare la solución de tinción utilizando el kit de tinción TRAP siguiendo las instrucciones del fabricante y caliente a 37 °C.
    NOTA: La solución de tinción trap debe prepararse recientemente inmediatamente antes de cada ensayo.
  5. Añadir una solución de tinción de 50–100 μL a cada muestra e incubar en una cámara húmeda de 37 °C durante 20–30 min. Compruebe el estado de tinción de los osteoclastos bajo un microscopio de luz cada 5 minutos hasta que se puedan ver osteoclastos multinucleados rojos. Finalizar la reacción con ddH2O.
  6. Contratendía en solución de hematoxilina durante 30 s. Crear un color azul estable por inmersión en 1% solución de amoníaco durante 1 min. Enjuague en agua del grifo que corre lentamente.
  7. Monte las secciones con cubrebocas usando bálsamo neutro y seco durante la noche.
  8. Captura de 3 a 5 campos de interés mediante un microscopio. Analice el perímetro trabecular por la Imagen J: mida la longitud de la barra de escala (Ls) usando la herramienta 'línea recta' como L1, luego mida la longitud del perímetro trabecular usando la herramienta 'línea segmentada' como L2, la longitud física (Lp)= Ls*L2 /L1). Cuente el número de células TRAP-positivas con más de tres núcleos.

6. Calein y alizarin rojo doble etiquetado

  1. Preparación de la muestra: Inyecte por vía intraperitoneal 20 mg/kg de caleína (1 mg/mL en solución de NaHCO3 al 2%) el día 0, y 25 mg/kg de alizarina roja S (AL, 2 mg/mL en H2O) el día 4. Sacrificar ratones el día 7. Desasocie cuidadosamente las tibias y fije en paraformadehído al 4% a 4 °C durante 48 h.
  2. Deshidratar: Después de la fijación, lavar suavemente las tibias 3x con 1x PBS. Sumergir secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante 5 min dos veces por separado.
  3. Sumergir las muestras en acetona durante 12 h, en 1/2 acetona 1/2 resina durante 2 h, y en resina pura en un horno de secado durante la noche.
    NOTA: La resina fue preparada por resina disponible comercialmente (por ejemplo, Embed 812 Resin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Incrustar: Agregue resina pura en un tanque de incrustación de gel de sílice adecuado y coloque las muestras suavemente para evitar burbujas. Polimerizar la resina en un horno de secado a 60 °C durante 48 h.
  5. Corte las muestras en secciones de 5 μm de espesor continuamente con un microtomo rotatorio. Guarde el resto de las muestras con desecante a temperatura ambiente.
  6. Adherir las secciones con pinzas en una gota de 75% de alcohol. Monte las secciones con cubrebocas usando bálsamo neutro. Capture el etiquetado de fluorescencia rojo y verde con un microscopio de fluorescencia.
  7. Mida el ancho entre dos líneas de etiquetado (Ir.L.Wi), perímetro trabecular de etiqueta simple (sL.Pm), perímetro trabecular de doble etiqueta (dL.Pm) y perímetro trabecular total (Tb.Pm). Calcular la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/días de intervalo. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

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Representative Results

Usando el actual protocolo, los ratones específicos osteoclast de la canceladura Stat3 fueron generados para estudiar la influencia de la canceladura STAT3 en la diferenciación osteoclasta. Los ratones Stat3Ctsk y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) fueron criados y mantenidos después del genotipado. Los macrófagos de médula ósea se aislaron y cultivaron en osteoclastos, y se demostró la deleción de STAT3en ratones Stat3Ctsk (Figura 1).

La reconstrucción de fémures y el análisis cuantitativo por micro-TC indicaron que la masa ósea de los ratones Stat3Ctsk aumentó en comparación con los ratones WT(Figura 2).

La histomorfología de los fémures de los ratones WT y Stat3Ctsk fue examinada vía la coloración de H&E (figura 3).

La actividad osteoclastogenic en los ratones fue detectada por la coloración de la TRAMPA. Los osteoclastos eran célulasTRAP+ (vino tinto o púrpura) con múltiples núcleos y enorme tamaño(Figura 4A). El número deTRAP+ osteoclastos fue menor en los ratones Stat3Ctsk en comparación con los ratones WT(Figura 4B), loque indica que la deficiencia de STAT3 alteró la formación de osteoclastos.

La osteogénesis en ratones está representada por la tasa de aposición mineral (MAR) y se midió mediante el doble etiquetado rojo de calqueína y alizarina(Figura 5). El rojo de la caleína y del alizarin fue inyectado secuencialmente intraperitoneal. Por lo tanto, el área entre las líneas de fluorescencia de calcina (verde) y rojo de alizarina (rojo) representa el hueso recién formado durante cuatro días. Como se muestra en la Figura 5,la eliminación de STAT3 en los osteoclastos no influyó en el anabolismo óseo.

Figure 1
Figura 1: Ilustración de la generación de modelos de ratón de deleción Stat3 específicos de osteoclastos y ratones modificados genéticamente. (A)Diagrama esquemático de la deleción de Stat3 en catepsina K (Ctsk)-que expresa osteoclastos a través del sistema Cre-loxP. (B)Progreso de reproducción de ratones de deleción Stat3 específicos de osteoclasto. Los ratones Stat3fl/fl se cruzaron a ratones Ctsk-Cre (F0) para generar Stat3fl/+heterocigótico; Ratones Ctsk-Cre (F1). Stat3fl/+masculino ; Los ratones Ctsk-Cre se mantuvieron y cruzaron a ratones hembra Stat3fl/fl para generar Stat3fl/flhomocigóticos; Ratones Ctsk-Cre (F2). Stat3masculino fl/fl; Los ratones Ctsk-Cre se mantuvieron y cruzaron a ratones hembra Stat3fl /fl para generar Stat3fl / fl; Ratones Ctsk-Cre y ratones Stat3fl/fl. (C) Genotipado para varios genotipos de ratones. Stat3 mutante: 187 pb, Stat3 tipo salvaje: 146 pb, Cre: 200 pb.(D)Western blot de STAT3 en osteoclastos cultivados con macrófagos de médula ósea de ratones Stat3fl/fl y Stat3Ctsk. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Reconstrucción tridimensional y análisis cuantitativo de parámetros de microarquitectura en fémures de ratones mediante micro-TC. (A)Imágenes micro-CT reconstruidas tridimensionalmente del hueso trabecular de fémures de ratones WT y Stat3Ctsk de 8 semanas de edad. La región del interés (ROI) estaba en una anchura total de 1 milímetro del hueso trabecular cerca de la placa distal del crecimiento. (B)3D reconstruyó imágenes micro-CT de hueso cortical de fémures de 8 semanas de edad WT y Stat3Ctsk ratones. El ROI estaba en una sección total de 1 milímetro de ancho del hueso cortical del centro de los fémures. (C–H) Parámetros cuantitativos de la microarquitectura de micro-CT: densidad mineral ósea (DMO), fracción de volumen óseo (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separación trabecular (Tb.Sp.) y grosor óseo cortical (Ct.Th.). Las barras de error representan la media ± SD, n=4, *P<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Histomorfología de los fémures de wt y Stat3Ctsk ratones exhibidos a través de H &E tinción. La curva punteada en forma de M indica una capa de cartílago. El campo de alta potencia relativo del hueso cortical se encajona con líneas punteadas y se exhibe abajo. El campo de alta potencia relativo del hueso trabecular se circunda con líneas punteadas y se exhibe en la parte inferior. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Osteoclastogénesis en fémures de ratones representados a través de la tinción trap. (A)Tinción trap de fémures de 8 semanas de edad WT y Stat3Ctsk ratones. Trap+ osteoclastos multinucleados están indicados por triángulos negros. El campo de alta potencia relativo de osteoclastos circundado con líneas punteadas se exhibe abajo, demostrando núcleos múltiples y un tamaño enorme. (b)Se contaron los números de TRAP+ osteoclastos multinucleados. Las barras de error representan la media ± DE, n=5, *P<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Osteogénesis en fémures de ratones representados mediante calqueína y doble etiquetado rojo de alizarina. (A)Los ratones de siete semanas de edad fueron inyectados secuencialmente con calcina el día 0, con alizarina roja el día 4, y luego sacrificados el día 7. El área entre las líneas de fluorescencia de calqueína (verde) y rojo de alizarina (rojo) representa el hueso cortical recién formado durante cuatro días. (B)La tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea (BFR/BS) calculadas por la distancia de las dos líneas representan la actividad osteogénica del hueso cortical. (C)El área entre las líneas de fluorescencia calcina (verde) y rojo alizarina (rojo) representa el hueso trabecular recién formado en cuatro días. (D)MAR y BFR/BS representan la actividad osteogénica del hueso trabecular. Las barras de error representan la media ± DE, n=5, *P<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

Los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar el mecanismo y el tratamiento farmacéutico de las enfermedades humanas13. Los ratones Ctsk-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos6. El actual estudio describió los protocolos de los métodos para analizar fenotipo esquelético y para estudiar los genes críticos que controlaban actividad osteoclasta in vivo.

El análisis histológico es el mejor método intuitivo para detectar el metabolismo óseo. Y la calidad de las secciones de parafina es la base del análisis histológico. El tiempo suficiente para la fijación completa y la descalcificación del tejido óseo es extremadamente esencial ya que los tejidos óseos pueden ser fragmentados. Los investigadores que se centran en los fémures y las tibias deben colocar el fémur y la tibia en un ángulo de 90 ° en el paso de incrustación. Para conducir análisis histológico confiable y de alta calidad, elegimos las secciones sagitales de la parafina en las cuales la capa del cartílago era simétrica y demostró una línea M-formada clara en la coloración de H&E, que representa el ángulo y la profundidad convenientes de esas secciones continuas. Por otro lado, si necesita observar las articulaciones de la rodilla y el ligamento articular adyacente, el fémur y la tibia deben colocarse en un ángulo de 120 °.

Trap ha servido durante décadas como un marcador bioquímico para la función osteoclasta14,ya que se expresa predominantemente en los osteoclastos15,16. Dos substratos se utilizan generalmente para evaluar actividad ácida de la fosfatasa. El fosfato de Naftol-ASBI (N-ASBI-P) es un sustrato excelente para la isoforma TRAP 5b específica del osteoclasta. Sin embargo, el fosfato de para-nitrofenilo (pNPP) también puede hidrolizado por traps no tipo5 17. Por lo tanto, el método de ácido fosfórico-pararosanilina naftol-ASBI para la demostración histoquímica de TRAP es altamente específico en las secciones de tejido17,18,19. La macrófago fosfatasa (fosfatasa ácida) tiene un pH óptimo de 5,0-6,0, al que es mayormente resistente al tartrato20. Así, recomendamos que en el protocolo de la trampa que mancha el análisis, las secciones del tejido re-manchadas por hematoxylin no se decoloren con el ácido clorhídrico. Es importante destacar que, aunque los osteoblastos y los osteocitos cercanos a las áreas de remodelación ósea también expresan TRAP21,solo las células trap-positivas enormes con más de tres núcleos se consideraron osteoclastas. En este estudio, los ratones Stat3Ctsk mostraron actividad osteoclasta inhibida (Figura 4).

La calcina es un fluorocromo (fluorescencia verde) que se utiliza ampliamente para indicar el crecimiento esquelético durante la calcificación. Puede unirse al calcio e incorporarse a los cristales de carbonato de calcio recién formados22. Del mismo modo, la calcina, la alizarina roja (fluorescencia roja) y la tetraciclina (fluorescencia amarilla) se integraron en el hueso para estimar el crecimiento desde el momento de la exposición23,24. Muchos estudios en el pasado han utilizado fluorocromos individuales (generalmente calcina) para etiquetar el hueso, pero los observadores pueden confundirse fácilmente entre el hueso recién formado y el hueso viejo, especialmente en el hueso trabecular irregular. Por lo tanto, sugerimos que los investigadores inyecten dos tipos diferentes de fluorocromos en ratones para distinguir el hueso más nuevo del hueso más viejo. Según nuestras pruebas, la calcina junto con la alizarina podría lograr el contraste más suficiente y duradero. En este estudio, se utilizó el etiquetado rojo de calqueína-alizarina para detectar la tasa osteogénica de tejido óseo y resultó que la actividad de los osteoblastos no estaba influenciada en los ratones Stat3Ctsk (Figura 5).

En definitiva, para entender los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta, este protocolo describe un método canónico para generar un modelo de ratón transgénico. Este protocolo también describe algunas técnicas típicas para analizar el fenotipo esquelético. En este estudio, la canceladura de STAT3 perjudicó la formación osteoclasta y aumentó el massachusetts del hueso. Estas técnicas pueden ser interesantes para aquellos que son nuevos en la investigación de tejido esquelético. Sin embargo, más características del sistema esquelético se refieren para el estudio adicional, tales como propiedad mecánica25. Y siempre tenemos que estar atentos al desarrollo de nuevas técnicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Prof. Weiguo Zou y A S. Kato por los reactivos y ratones y a los miembros del laboratorio Zou por sus útiles discusiones. También agradecemos al Laboratorio de Estomatología Digitalizada y al Centro de Investigación de Anomalías Craneofaciales del Noveno Hospital Popular de Shanghai por su asistencia. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, el fondo SHIPM-mu del Instituto de Medicina de Precisión de Shanghai, el Noveno Hospital Popular de Shanghai, la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai [JC201809], el Proyecto de Incentivos del Equipo de Innovación de Alto Nivel para la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai , el Fondo de Investigación Interdisciplinaria del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad JiaoTong de Shanghai [JYJC201902]. Y L.J. es un académico de los Talentos Médicos Juveniles Sobresalientes, el Programa de Desarrollo Juvenil "Rising Stars of Medical Talent" de Shanghai y el proyecto "Chen Xing" de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Número 161 fenotipo esquelético metabolismo óseo etiquetado osteoclastos STAT3 ratones transgénicos
Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional <em>de Stat3</em>
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Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,… More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

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