Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Skelet phenotype analyse af en betinget Stat3 Sletning Mouse Model

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en kanonisk metode til at forstå de kritiske gener, der styrer osteoklastaktivitet in vivo. Denne metode bruger en transgen mus model og nogle kanoniske teknikker til at analysere skelet fænotype.

Abstract

Transgene musemodeller er stærke til at forstå de kritiske gener, der styrer osteoklastdifferentiering og aktivitet, og til at studere mekanismer og farmaceutiske behandlinger af osteoporose. Cathepsin K (Ctsk)-Cre mus har været meget anvendt til funktionelle undersøgelser af osteoklaster. Signaltransduceren og aktivatoren af transskription 3 (STAT3) er relevant i knoglehomøostase, men dens rolle i osteoklaster in vivo er stadig dårligt defineret. For at fremlægge in vivo-dokumentation for, at STAT3 deltager i osteoklastdifferentiering og knoglemetabolisme, genererede vi en osteoklastspecifik Stat3-sletningsmusmodel (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) og analyserede dens skelet fænotype. Micro-CT-scanning og 3D-rekonstruktion indebar øget knoglemasse i de betingede knockoutmus. H &E farvning, calcein og alizarin rød dobbelt farvning, og tartrat-resistente syre fosfatase (TRAP) farvning blev udført for at opdage knogle metabolisme. Kort sagt beskriver denne protokol nogle kanoniske metoder og teknikker til at analysere skeletphoenotype og studere de kritiske gener, der styrer osteoklastaktivitet in vivo.

Introduction

Skeletben er det vigtigste bærende organ i menneskekroppen og er under pres fra både det indre og ydre miljø under gang og motion1. Gennem ens liv gennemgår knogler kontinuerligt selvfornyelse, som afbalanceres af osteoblaster og osteoklaster. Processen med osteoklaster, der rydder gamle knogler og osteoblaster, der danner nye knogler, opretholder skeletsystemets homøostase og mekaniske funktion2. Forstyrrelser i balancen kan fremkalde knoglemetaboliske sygdomme, såsom osteoporose. Osteoporose, som er forårsaget af overskydende osteoklastisk aktivitet, er globalt udbredt og forårsager betydelige økonomiske tab for samfundet2,3,4. Ifølge det begrænsede antal lægemidler til rådighed for osteoporose behandling og deres risiko for bivirkninger4, er det vigtigt at afsløre detaljerne i osteoklast dannelse og aktivitet.

Osteoklaster afledt af den monocytiske/makrofaglige hæmatopoietiske afstamning har flere kerner (kan have 2 til 50 kerner) og er store (normalt over 100 μm i diameter)2. Selv om udforskningen af mekanismer og screeningen af lægemidler mod osteoklastiske lidelser er blevet væsentligt forbedret via in vitro osteoklastkulturen, gør de komplicerede organiske reaktioner in vivo-beviser uundværlige for den målrettede behandling. På grund af genetiske og patofysiologiske ligheder mellem mus og mennesker anvendes genetisk manipulerede musemodeller almindeligvis til at studere mekanismerne og de farmaceutiske behandlinger af sygdomme hos mennesker in vivo6. Cre-loxP-systemet er en udbredt teknologi til musegenredigering og har gjort det muligt for forskere at undersøge genfunktioner på en vævs-/cellespecifik måde5. Cathepsin K (CSTK) er en cystein protease udskilles af osteoklaster, der kan nedbryde knogle kollagen8. Det er velkendt, at CTSK er selektivt udtrykt i modne osteoklaster; derfor anses Ctsk-Cre mus for at være et nyttigt værktøj til funktionelle undersøgelser af osteoklaster og er blevet brugt6.

Signaltransduceren og aktivatoren af transskriptionsfamilien (STAT) er klassisk og meget vigtig i immunitet og kræftudvikling og udvikling7,8. Blandt syv STAT'er rapporteres STAT3 at være den mest relevante for knoglehomøostase9,10. Flere in vivo-undersøgelser har rapporteret , at specifik inaktivering af STAT3 i osteoblaster reducerer knogledannelsen9,10. Ikke desto mindre er solid dokumentation for STAT3's deltagelse i osteoklastdannelse og knoglemetabolisme in vivo stadig begrænset. For nylig har vi givet in vivo beviser med en osteoklast-specifik stat3 sletning mus model(Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, i det følgende benævnt Stat3Ctsk), at STAT3 deltager i osteoklast differentiering og knoglemetabolisme11. I denne undersøgelse beskriver vi de metoder og protokoller, som vi brugte til at analysere ændringerne i knoglemasse, knogle histomorphologi og knogleanabolisme og katabolisme hos Stat3Ctsk-musene for at studere indflydelsen af osteoklastspecifik STAT3-sletning på knoglehomøostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder vedrørende de dyr, der er beskrevet her, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Shanghai Jiaotong University School of Medicine.

1. Opdræt af osteoklastspecifikke Stat3-sletningsmus

BEMÆRK: Stat3fl/fl mus blev fremstillet kommercielt. Ctsk-Cre mus blev leveret af S. Kato (University of Tokyo, Tokyo, Japan12). Musene blev opdrættet og vedligeholdt under specifikke patogenfrie (SPF) forhold i det institutionelle dyreanlæg under standardiserede forhold.

  1. Par en seksuelt moden mandlig mus med to kvindelige mus på samme alder. Efter 18 dage skal du kontrollere daglige kontroller for nyfødte. Adskil de gravide hunmus og hold det alene, hvis det er nødvendigt. Skift mandlige mus blandt forskellige avlsbure, hvis de kvindelige mus ikke var gravide inden for 1 måned efter parringen.
  2. Kryds Stat3fl/fl mus til Ctsk-Cre mus (F0). Klip halerne til genotyping og hold den mandlige Stat3fl /+; Ctsk-Cre mus, indtil de er seksuelt modne, hvilket er omkring 6 uger (F1). Brug følgende primere: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
  3. Cross 6-ugers-gamle mandlige Stat3fl /+; Ctsk-Cre mus med kvindelige Stat3fl/fl mus. Klip halerne til genotyping og hold den mandlige Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre mus, indtil de er seksuelt modne, hvilket er omkring 6 uger (F2).
  4. Cross 6-ugers-gamle mandlige Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre mus med kvindelige Stat3fl/fl mus (F3). Klip halerne til genotyping og udskift de gamle avlsmus med yngre mus i tide (F3 +N).

2. Prøvesamling

  1. Aflive seks par 8-ugers gamle mandlige Stat3fl / fl og Stat3Ctsk littermate mus separat med kuldioxid kvælning.
    BEMÆRK: CO 2-strømningshastigheden fortrænger 30% af burvolumenet pr. minut (f.eks. i 45 cm x 30 cm x 30 cm bur er CO 2-strømningshastigheden 40 L/min).
  2. Placer musene i en liggende position. Forvred de bilaterale hofteled forsigtigt i hånden. Brug oftalmisk saks til at afskære huden lodret fra det distale skinneben og derefter dissekere hele huden fra bagbenet.
  3. Skær ledbåndet i højre hofteled og knæled med en saks for at adskille bagbenet. Skær trochanter og krydset af fibula og derefter nedsænke bagbenet i 4% paraformaldehyd. Hold højre bagben til trin 3. Skær knoglen i begge ender korrekt for at fordybe sig helt og fastgør knoglemarven med 4% paraformaldehyd.
  4. Skær ledbåndet i venstre hofteled og knæled med en saks, fjern forsigtigt det bløde væv, og adskil forsigtigt skinnebenet og lårbenet. Fordyb skinnebenet og lårbenet separat i 75% ethanol. Hold femora for trin 4 og skinneben til trin 6. Sørg for at holde trochanter intakt.

3. Forberedelse af paraffinsektion

  1. Højre bagben fastgøres i paraformaldehyd ved 4 °C i 48 timer.
  2. Afkalk: Vask forsigtigt prøverne med 1x PBS i 10 min. 3 gange. Afkalk prøverne i 15% EDTA (150 g EDTA i 800 mL ddH2O og 100 mL 10x PBS) med ultralydsdecalcifier i 3 til 4 uger, indtil knoglerne kan bøjes. Udskift med frisk afkalkningsvæske hver anden dag.
  3. Forsigtigt vaske prøverne 3x med 1x PBS og derefter nedsænke dem i 75% ethanol ved 4 °C natten over.
  4. Dehydrer: På den anden dag nedsænkes prøver i 95% ethanol, 100% ethanol og xylen, hver i 1 time to gange.
  5. Fordyb prøverne i 1/2 xylen 1/2 paraffin i 30 min. Prøverne i paraffin nedsænkes ved 65 °C natten over.
  6. Integrering: Vælg en egnet indlejringstank til indlejring. Placer skinnebenet ensartet nedenunder. Lårbenet og skinnebenet anbringes i en vinkel på 90°. Når paraffinen er helt afkølet og størknet, skal du fjerne den fra indlejringstanken. Antal prøverne, og opbevar dem ved -20 °C natten over.
  7. Skær 5 μm tykke sektioner kontinuerligt ved hjælp af mikrotomen. Klip 20-40 sektioner. Spred sektionerne på 37 °C vand, klæbe dem til mikroskop dias, og bages ved 42 °C natten over.

4. Mikro-CT-scanning og -analyse

  1. Scan den venstre femora med en mikro-CT scanner. Opløsning: 10 μm; Spænding: 70 kV; Strøm: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Rotationstrin: 0,5°.
  2. Rekonstruer 3D-billeder af den kortikale knogle og trabekulære knogle ved hjælp af scannerens understøttende software efter producentens instruktion. ROI'erne er i en samlet 1 mm bred trabekulær knogle tæt på den distale vækstplade og i alt 1 mm bred del af kortikale knogler i midten af femoraen.
  3. De kvantitative mikroarkitekturparametre beregnes: knoglemineraltæthed (BMD), knoglevolumenfraktion (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th.), trabekulært tal (Tb.N.), trabekulær adskillelse (Tb.Sp.) og kortikal knogletykkelse (Ct.Th.).

5. TRAP farvning

  1. Paraffinsektionerne bages ved 65 °C i 30 min.
  2. Dewax: Fordyb sektionerne i xylen i 10 min. Udfør dette trin 3x med frisk xylen.
  3. Rehydrer: Fordyb sektionerne sekventielt i 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol og ddH2O, hver i 5 min. to gange.
  4. Farvningsopløsningen fremstilles ved hjælp af TRAP-farvningssættet efter fabrikantens anvisninger og opvarmes til 37 °C.
    BEMÆRK: TRAP farvningsopløsningen skal tilberedes frisk umiddelbart før hver analyse.
  5. Der tilsættes en 50-100 μL farvningsopløsning til hver prøve, og der inkuberes i et fugtigt kammer på 37 °C i 20-30 min. Kontroller osteoklasternes farvningsstatus under et let mikroskop hvert 5. minut, indtil der kan ses røde multinukleerede osteoklaster. Afslut reaktionen med ddH2O.
  6. Modstain i hematoxylinopløsning i 30 s. Opret en stabil blå farve ved nedsænkning i 1% ammoniakopløsning i 1 min. Skyl i langsomt rindende vand fra hanen.
  7. Monter sektionerne med coverslips ved hjælp af neutral balsam og tør natten over.
  8. Indfang 3-5 interessefelter med et mikroskop. Analyser den trabekulære omkreds efter billede J: Mål længden af skalabjælken (Ls) ved hjælp af værktøjet 'lige linje' som L1, og mål derefter længden af den trabekulære omkreds ved hjælp af værktøjet 'segmenteret linje' som L2, den fysiske længde (Lp)= Ls*L2 /L1). Tæl antallet af TRAP-positive celler med mere end tre kerner.

6. Calcein og alizarin rød dobbelt mærkning

  1. Prøveforberedelse: Intraperitone injicerer intraperitonealt 20 mg/kg calcein (1 mg/ml i 2% NaHCO3-opløsning) på dag 0 og 25 mg/kg alizarin rød S (AL, 2 mg/ml i H2O) på dag 4. Ofre mus på dag 7. Fjern forsigtigt skinnebenet og fastgøres i 4% paraformaldehyd ved 4 °C i 48 timer.
  2. Dehydrer: Efter fiksering vaskes skinnebenet 3x forsigtigt med 1x PBS. Sekventielt nedsænkes prøverne i 95% ethanol, 100% ethanol og xylen i 5 minutter to gange separat.
  3. Prøverne i acetone nedsænkes i 12 timer, i 1/2 acetone 1/2 harpiks i 2 timer og i ren harpiks i en tørreovn natten over.
    BEMÆRK: Harpiksen er fremstillet af kommercielt tilgængelig harpiks (f.eks. Indlejring 812 harpiks) i henhold til producentens anvisninger.
  4. Indlejring: Tilsæt ren harpiks i en passende silicagelindlejringstank, og placer prøverne forsigtigt for at undgå bobler. Harpiksen polymeriseres i en tørreovn ved 60 °C i 48 timer.
  5. Prøverne skæres i 5 μm tykke sektioner kontinuerligt med en roterende mikrotom. Resten af prøverne opbevares med desiccant ved stuetemperatur.
  6. Hold sektionerne med pincet i en dråbe på 75% alkohol. Monter sektionerne med coverlips ved hjælp af neutral balsam. Fang rød og grøn fluorescensmærkning med et fluorescensmikroskop.
  7. Mål bredden mellem to etiketlinjer (Ir.L.Wi), en-mærket trabecular perimeter (sL.Pm), dobbeltmærket trabecular perimeter (dL.Pm) og total trabekulær omkreds (Tb.Pm). Mineralansættelseshastigheden (MAR) og knogledannelseshastigheden (BFR/BS) beregnes. MAR = Ir.L.Wi/intervaldage. BFR/BS= (dL.Pm±sL.pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol blev osteoklastspecifikke Stat3-sletningsmus genereret for at studere INDFLYDELSEn af STAT3-sletning på osteoklastdifferentiering. Stat3Ctsk mus og deres wildtype (WT) littermates blev opdrættet og holdt efter genotyping. Knoglemarvsmakrofager blev isoleret og dyrket i osteoklaster, og STAT3-sletning i Stat3Ctsk-mus blev påvist (Figur 1).

Femora rekonstruktion og kvantitativ analyse ved mikro-CT viste, at knoglemassen af Stat3Ctsk mus blev øget sammenlignet med WT mus (Figur 2).

Histomorfologi af femora fra WT og Stat3Ctsk mus blev undersøgt via H &E farvning (Figur 3).

Osteoclastogen aktivitet i musene blev opdaget ved TRAP farvning. Osteoklaster var TRAP+ (vinrøde eller lilla) celler med flere kerner og stor størrelse(figur 4A). Antallet af TRAP+ osteoklaster var lavere i Stat3Ctsk mus sammenlignet med WT mus (Figur 4B), hvilket indikerer, at STAT3 mangel nedsat osteoklast dannelse.

Osteogenese hos mus er repræsenteret ved mineraludsendelseshastigheden (MAR) og blev målt ved calcein og alizarin rød dobbeltmærkning (Figur 5). Calcein og alizarin rød blev sekventielt intraperitoneally injiceres. Derfor repræsenterer området mellem calcein (grøn) og alizarin rød (rød) fluorescens linjer nydannet knogle over fire dage. Som det fremgår af figur 5, påvirkede slettet STAT3 i osteoklaster ikke knogleanabolismen.

Figure 1
Figur 1: Illustration af osteoklastspecifik stat3-sletning af musemodelgenerering og gensplejsede mus. (A) Skematisk diagram over Stat3-sletning i cathepsin K (Ctsk) udtrykke osteoklaster via Cre-loxP-systemet. (B) Avlsfremskridt for osteoklastspecifikke Stat3-slettemus. Stat3fl/fl mus blev krydset til Ctsk-Cre mus (F0) for at generere heterozygogous Stat3fl/+; Ctsk-Cre mus (F1). Mænds stat3fl/+; Ctsk-Cre mus blev holdt og krydset til kvindelige Stat3fl/fl mus for at generere homozygogous Stat3fl/fl; Ctsk-Cre mus (F2). Mænds stat3fl/fl; Ctsk-Cre mus blev holdt og krydset til kvindelige Stat3fl/fl mus for at generere Stat3fl/fl; Ctsk-Cre mus og Stat3fl/fl mus. (C) Genotyping for forskellige genotyper af mus. Stat3 mutant: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Vestlige blot af STAT3 i osteoklaster dyrket med knoglemarvsmakrofager fra Stat3fl/fl og Stat3Ctsk mus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Tredimensionel rekonstruktion og kvantitativ mikroarkitekturparameteranalyse i femora af mus ved hjælp af mikro-CT-scanning. (A) Tredimensionelt rekonstruerede mikro-CT-billeder af femoras trabekulære knogle fra 8 uger gamle WT- og Stat3Ctsk-mus. Interesseregionen (ROI) var i en samlet bredde på 1 mm af trabekulær knogle tæt på den distale vækstplade. (B) 3D rekonstruerede mikro-CT-billeder af kortikale knogler af femora fra 8 uger gamle WT- og Stat3Ctsk-mus. ROI var i alt 1 mm bred del af kortikale knogler fra midten af femora. (C-H) Kvantitative mikroarkitekturparametre for mikro-CT: knoglemineraltæthed (BMD), knoglevolumenfraktion (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th.), trabekulært tal (Tb.N.), trabekulær adskillelse (Tb.Sp.) og kortikal knogletykkelse (Ct.Th.). Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SD, n=4, *P<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Histomorphology af femora fra WT og Stat3Ctsk mus udstillet via H &E farvning. M-formet syltet kurve angiver et brusklag. Relativ high-power felt af kortikale knogle er boxed med prikket linjer og udstillet nedenfor. Relativ high-power felt af trabecular knogle er omgivet med prikket linjer og udstillet i bunden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Osteoklastogenese hos femora af mus repræsenteret via TRAP farvning. (A) TRAP farvning af femora fra 8 uger gamle WT og Stat3Ctsk mus. TRAP+ multinukleerede osteoklaster er angivet med sorte trekanter. Relativ high-power felt af osteoklaster kredsede med punkterede linjer er udstillet nedenfor, viser flere kerner og en enorm størrelse. (B) Antallet af TRAP+ multinukleerede osteoklaster blev talt. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SD, n=5, *P<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Osteogenese i femora af mus repræsenteret via calcein og alizarin rød dobbelt mærkning. (A) Syv uger gamle mus blev sekventielt injiceret med calcein på dag 0, med alizarin rød på dag 4, og derefter ofret på dag 7. Området mellem calcein (grøn) og alizarin rød (rød) fluorescens linjer repræsenterer nydannede kortikale knogle over fire dage. (B) Mineralansættelseshastighed (MAR) og knogledannelseshastighed (BFR/BS), beregnet ved afstanden mellem de to linjer, repræsenterer kortikalens osteogene aktivitet. (C) Området mellem calcein (grøn) og alizarin rød (rød) fluorescens linjer repræsenterer nydannede trabecular knogle i fire dage. D) MAR og BFR/BS repræsenterer den osteogene aktivitet i den trabekulære knogle. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SD, n=5, *P<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gensplejsede musemodeller bruges ofte til at studere mekanismen og farmaceutisk behandling af sygdomme hos mennesker13. Ctsk-Cre mus har været meget anvendt til funktionelle undersøgelser af osteoklaster6. Denne undersøgelse beskrev protokollerne for metoderne til at analysere skeletphoenotype og til at studere de kritiske gener, der styrer osteoklastaktivitet in vivo.

Histologiske analyser er den bedste intuitive metode til at opdage knoglemetabolisme. Og kvaliteten af paraffinsektionerne er grundlaget for den histologiske analyse. Tilstrækkelig tid til fuld fiksering og afkalkning af knoglevævet er yderst vigtigt, da knoglevæv kan fragmenteret. Forskere med fokus på femora og skinneben bør placere lårbenet og skinnebenet i en 90 ° vinkel i indlejring trin. For at gennemføre pålidelige og højkvalitets histologiske analyser valgte vi sagittale paraffinsektioner, hvor brusklaget var symmetrisk og viste en klar M-formet linje i H &E-farvning, som repræsenterer den passende vinkel og dybde af disse kontinuerlige sektioner. På den anden side, hvis du har brug for at observere knæleddene og tilstødende ledbånd, skal lårbenet og skinnebenet placeres i en 120 ° vinkel.

TRAP har i årtier fungeret som biokemisk markør for osteoklastfunktion14, da den overvejende udtrykkes i osteoklaster15,16. To substrater bruges normalt til at vurdere syrefosfataseaktivitet. Naphthol-ASBI fosfat (N-ASBI-P) er et fremragende substrat til osteoklastspecifik trap isoform 5b. Paranitrophenylphosphat (pNPP) kan dog også hydrolyseres af ikke-type 5TRAP'er 17. Derfor er naphthol-ASBI fosforsyre-pararosanilinmetoden til histokemisk påvisning af TRAP meget specifik i vævsafsnit17,18,19. Makrofagfosfatase (syrephosphatase) har en pH-optimal på 5,0-6,0, hvor den for det meste er tartratresistent20. Således anbefaler vi, at i protokollen af TRAP farvning assay, væv sektioner re-farves af hematoxylin bør ikke affarves med saltsyre. Det er vigtigt, at selv om osteoblaster og osteocytter tæt på knogleombygningsområder også udtrykker TRAP21, blev kun store TRAP-positive celler med mere end tre kerner betragtet som osteoklaster. I denne undersøgelse viste Stat3Ctsk-mus hæmmet osteoklastaktivitet (figur 4).

Calcein er en fluorokrom (grøn fluorescens), der er meget udbredt til at indikere skeletvækst under forkalkning. Det kan binde sig til calcium og indarbejdes i de nydannede calciumcarbonatkrystaller22. På samme måde blev calcein, alizarin rød (rød fluorescens) og tetracyklin (gul fluorescens) indbygget i knoglen for at estimere væksten fra eksponeringstidspunktet23,24. Mange undersøgelser i fortiden har brugt enkelt fluorochromes (normalt calcein) til at mærke knoglen, men observatører kan let forveksles mellem den nydannede knogle og gamle knogle, især i uregelmæssig trabekulær knogle. Derfor foreslår vi, at forskere injicerer to forskellige typer fluorochromer i mus for at skelne den nyere knogle fra den ældre knogle. Ifølge vores tests, calcein kombineret med alizarin kan opnå den mest tilstrækkelige og varige kontrast. I denne undersøgelse blev calcein-alizarin rød mærkning brugt til at detektere osteogenic sats af knoglevæv, og det viste sig, at osteoblast aktivitet ikke var påvirket i Stat3Ctsk mus (Figur 5).

Kort sagt, for at forstå de kritiske gener, der styrer osteoklastaktivitet, beskriver denne protokol en kanonisk metode til at generere en transgen musemodel. Denne protokol beskriver også nogle typiske teknikker til analyse af skelettet fænotype. I denne undersøgelse, sletning af STAT3 nedsat osteoklast dannelse og øget knoglemasse. Disse teknikker kan være interessant for dem, der er nye til skeletvæv forskning. Flere karakteristika ved skeletsystemet er imidlertid bekymrede for yderligere undersøgelse, såsom mekanisk ejendom25. Og vi skal altid holde øje med udviklingen af nye teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker professor Weiguo Zou og S. Kato for reagenser og mus og medlemmerne af Zou-laboratoriet for nyttige diskussioner. Vi takker også Laboratoriet for Digitaliseret Stomatologi og Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People's Hospital for hjælp. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, SHIPM-mu-fonden fra Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], incitamentsprojektet for innovationsteam på højt niveau for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , den tværfaglige forskningsfond for Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. Og LJ er en forsker i Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program og "Chen Xing" projekt fra Shanghai Jiaotong University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  4. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
  5. Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
  6. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  7. Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
  8. Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
  9. Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
  10. Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
  11. Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
  12. Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
  13. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
  14. Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
  15. Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
  16. Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
  17. Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
  18. Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
  19. Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
  20. Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
  21. Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
  22. Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
  23. Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
  24. Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
  25. Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).

Tags

Biologi Problem 161 skelet fænotype knoglemetabolisme mærkning osteoklaster STAT3 transgene mus
Skelet phenotype analyse af en betinget <em>Stat3</em> Sletning Mouse Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,… More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter