Summary
Ce protocole décrit une méthode canonique pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo. Cette méthode utilise un modèle murin transgénique et certaines techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique.
Abstract
Les modèles murins transgéniques sont puissants pour comprendre les gènes critiques contrôlant la différenciation et l’activité de l’ostéoclaste, et pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques de l’ostéoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Crémeurs ont été largement utilisés pour les études fonctionnelles des ostéoclastes. Le transducteur de signal et activateur de transcription 3 (STAT3) est pertinent dans l’homéostasie osseuse, mais son rôle dans les ostéoclastes in vivo reste mal défini. Pour fournir la preuve in vivo que STAT3 participe à la différenciation des ostéoclastes et au métabolisme osseux, nous avons généré un modèle murin de délétion Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) et analysé son phénotype squelettique. Le balayage de Micro-CT et la reconstruction 3D ont impliqué la masse accrue d’os chez les souris knockout conditionnelles. La souillure de H&E, la double souillure rouge de calcein et d’alizarin, et la souillure acide tartrate-résistante de la phosphatase (PIÈGE) ont été exécutées pour détecter le métabolisme d’os. En bref, ce protocole décrit quelques méthodes et techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.
Introduction
L’os squelettique est le principal organe porteur du corps humain et est sous la pression de l’environnement interne et externe pendant la marche et l’exercice1. Tout au long de la vie, les os passent continuellement par l’auto-renouvellement, qui est équilibré par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Le processus d’élimination des ostéoclastes des os anciens et de la formation de nouveaux os par les ostéoblastes maintient l’homéostasie et la fonction mécanique du système squelettique2. Une perturbation de l’équilibre peut induire des maladies métaboliques osseuses, telles que l’ostéoporose. L’ostéoporose, qui est causée par une activité ostéoclastique excessive, est répandue à l’échelle mondiale et entraîne des pertes économiques substantielles pour la société2,3,4. Selon le nombre limité de médicaments disponibles pour le traitement de l’ostéoporose et leur risque d’effets indésirables4, il est important de dévoiler les détails de la formation et de l’activité de l’ostéoclaste.
Les ostéoclastes dérivés de la lignée hématopoïétique monocyte/macrophage ont des noyaux multiples (peuvent avoir de 2 à 50 noyaux) et sont grands (généralement supérieurs à 100 μm de diamètre)2. Bien que l’exploration des mécanismes et le criblage des drogues pour des désordres osteoclastic aient été largement améliorés par l’intermédiaire de la culture osteoclast in vitro, les réactions organiques compliquées rendent l’évidence in vivo indispensable pour la thérapie visée. En raison des similitudes génétiques et physiopathologiques entre les souris et les humains, les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques des maladies humaines in vivo6. Le système Cre-loxP est une technologie largement utilisée pour l’édition de gènes de souris et a permis aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes d’une manière spécifique aux tissus/cellules5. La cathepsine K (CSTK) est une cystéine protéase sécrétée par des ostéoclastes qui peuvent dégrader le collagène osseux8. Il est bien accepté que CTSK soit sélectivement exprimé dans les osteoclasts mûrs ; par conséquent, les souris Ctsk-Cre sont considérées comme un outil utile pour les études fonctionnelles des ostéoclastes et ont été utilisées6.
La famille des transducteurs de signaux et activateurs de transcription (STAT) est classique et très importante dans l’immunité et la progression et le développement du cancer7,8. Parmi les sept STATs, STAT3 est signalé comme le plus pertinent pour l’homéostasie osseuse9,10. Plusieurs études in vivo ont rapporté que l’inactivation spécifique de STAT3 dans les ostéoblastes diminue la formation osseuse9,10. Néanmoins, les preuves solides concernant la participation de STAT3 à la formation d’ostéoclastes et au métabolisme osseux in vivo sont encore limitées. Récemment, nous avons fourni des preuves in vivo avec un modèle murin de suppression Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3fl/ fl; Ctsk-Cre, ci-après appelé Stat3Ctsk) que STAT3 participe à la différenciation ostéoclaste et au métabolisme osseux11. Dans la présente étude, nous décrivons les méthodes et les protocoles que nous avions l’habitude d’analyser les changements de la masse d’os, de l’histomorphologie d’os, et de l’anabolisme et du catabolisme d’os des souris Stat3Ctsk afin d’étudier l’influence de la suppression STAT3 osteoclast-spécifique sur l’homéostasie d’os.
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Protocol
Toutes les méthodes relatives aux animaux décrits ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai.
1. Élevage de souris de délétion Stat3 spécifiques à l’ostéoclaste
REMARQUE: Les souris Stat3fl/fl ont été obtenues commercialement. Les souris Ctsk-Cre ont été fournies par S. Kato (Université de Tokyo, Tokyo, Japon12). Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) dans l’établissement pour animaux de l’établissement dans des conditions normalisées.
- Associez une souris mâle sexuellement mature à deux souris femelles du même âge. Après 18 jours, vérifiez les contrôles quotidiens pour les nouveau-nés. Séparez les souris femelles gravides et gardez-les seules si nécessaire. Changer les souris mâles entre différentes cages de reproduction si les souris femelles n’étaient pas enceintes dans les 1 mois suivant l’appariement.
- Croiser lessourisStat3 fl/fl aux souris Ctsk-Cre (F0). Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3fl/+; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F1). Utilisez les amorces suivantes : Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
- Cross mâle de 6 semaines Stat3fl/+; Souris Ctsk-Cre avec des souris femelles Stat3fl/fl. Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3 fl /fl; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F2).
- Cross mâle de 6 semaines Stat3 fl/fl; Souris Ctsk-Cre avec des souris stat3femelles fl/fl (F3). Coupez les queues pour le génotypage et remplacez les vieilles souris reproductrices par des souris plus jeunes à temps (F3+N).
2. Prélèvement de spécimens
- Euthanasier six paires de souris mâles Stat3fl/fl et Stat3Ctsk mâles de 8 semaines séparément avec asphyxie au dioxyde de carbone.
NOTA : Le débit de CO2 déplace 30 % du volume de la cage par minute (p. ex., pour une cage de 45 cm x 30 cm x 30 cm, le débit de CO2 est de 40 L/min). - Placez les souris en décubitus dorsal. Disloquer doucement les articulations bilatérales de la hanche à la main. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper la peau verticalement du tibia distal, puis disséquer toute la peau du membre postérieur.
- Couper le ligament articulaire de l’articulation droite de la hanche et de l’articulation du genou avec des ciseaux pour séparer le membre postérieur. Couper le trochanter et la jonction du péroné puis immerger le membre postérieur dans du paraformaldéhyde à 4%. Conservez les membres postérieurs droits pour l’étape 3. Couper de manière appropriée l’os aux deux extrémités pour immerger complètement et fixer la moelle osseuse avec du paraformaldéhyde à 4%.
- Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche gauche et de l’articulation du genou avec des ciseaux, retirez doucement les tissus mous et séparez soigneusement le tibia et le fémur. Plongez le tibia et le fémur séparément dans de l’éthanol à 75%. Conservez les fémurs pour l’étape 4 et les tibias pour l’étape 6. Assurez-vous de garder le trochanter intact.
3. Préparation de la section de paraffine
- Fixer le membre postérieur droit dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.
- Décalcifier: Lavez doucement les échantillons avec 1x PBS pendant 10 min 3 fois. Décalcifier les échantillons dans 15% d’EDTA (150 g d’EDTA dans 800 mL deddH2Oet 100 mL de PBS 10x) avec un décalcificateur ultrasonique pendant 3 à 4 semaines jusqu’à ce que les os puissent être pliés. Remplacer par du liquide décalcifiant frais tous les deux jours.
- Lavez doucement les échantillons 3x avec 1x PBS, puis plongez-les dans de l’éthanol à 75% à 4 °C pendant la nuit.
- Déshydratation: Le deuxième jour, immerger séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 100% et du xylène, chacun pendant 1 h deux fois.
- Immerger les spécimens dans 1/2 xylène 1/2 paraffine pendant 30 min. Plongez les spécimens dans de la paraffine à 65 °C pendant la nuit.
- Embed: Sélectionnez un réservoir d’encastrement approprié pour l’encastrement. Placez le tibia uniformément en dessous. Placez le fémur et le tibia à un angle de 90°. Une fois que la paraffine a été complètement refroidie et solidifiée, retirez-la du réservoir d’encastrement. Numérotez les spécimens et conservez-les à -20 °C pendant la nuit.
- Couper des sections de 5 μm d’épaisseur en continu à l’aide du microtome. Coupez 20 à 40 sections. Étalez les sections sur de l’eau à 37 °C, adhérez-les aux lames du microscope et faites cuire à 42 °C pendant la nuit.
4. Micro-CT balayage et analyse
- Scannez les fémurs gauches avec un micro-scanner. Résolution: 10 μm; Tension: 70 kV; Courant : 114 μA; Fliter : 0,5 mm Al ; Étape de rotation : 0,5°.
- Reconstruire des images 3D de l’os cortical et de l’os trabéculaire à l’aide du logiciel de support du scanner en suivant les instructions du fabricant. Les ROIs sont dans une largeur totale de 1 mm d’os trabéculaire près du plat distal de croissance et dans une section totale de 1 millimètre de large de l’os cortical au milieu des fémurs.
- Calculer les paramètres quantitatifs de microarchitecture : densité minérale osseuse (DMO), fraction volumique osseuse (BV/TV), épaisseur trabéculaire (Tb.Th.), nombre trabéculaire (Tb.N.), séparation trabéculaire (Tb.Sp.) et épaisseur corticale osseuse (Ct.Th.).
5. Coloration TRAP
- Cuire les sections de paraffine à 65 °C pendant 30 min.
- Dewax: Plongez les sections dans le xylène pendant 10 min. Effectuez cette étape 3x avec du xylène frais.
- Réhydrater : Immerger les sections séquentiellement dans de l’éthanol à 100 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 70 % et du ddH2O, chacun pendant 5 min deux fois.
- Préparer la solution de coloration à l’aide de la trousse de coloration TRAP en suivant les instructions du fabricant et réchauffer à 37 °C.
REMARQUE: La solution de coloration TRAP doit être fraîchement préparée immédiatement avant chaque essai. - Ajouter une solution de coloration de 50 à 100 μL à chaque échantillon et incuber dans une chambre humide à 37 °C pendant 20 à 30 min. Vérifiez l’état de coloration des ostéoclastes au microscope optique toutes les 5 minutes jusqu’à ce que des ostéoclastes multinucléés rouges puissent être vus. Terminez la réactionavec ddH2 O.
- Contre-tache dans une solution d’hématoxyline pendant 30 s. Créez une couleur bleue stable par immersion dans une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min. Rincer à l’eau du robinet qui coule lentement.
- Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre et séchez pendant la nuit.
- Capturez 3 à 5 champs d’intérêt au microscope. Analyser le périmètre trabéculaire par l’image J: mesurer la longueur de la barre d’échelle (Ls) en utilisant l’outil 'ligne droite' comme L1, puis mesurer la longueur du périmètre trabéculaire en utilisant l’outil 'ligne segmentée' comme L2, la longueur physique (Lp)= Ls*L2 /L1). Comptez le nombre de cellules TRAP-positives avec plus de trois noyaux.
6. Double étiquetage de calcine et d’alizarine rouge
- Préparation de l’échantillon : Injecter par voie intrapéritonéale 20 mg/kg de caltine (1 mg/mL dans une solution de NaHCO3 à 2 %) le jour 0, et 25 mg/kg d’alizarine rouge S (AL, 2 mg/mL dansH2O)le jour 4. Sacrifier des souris le jour 7. Dissocier soigneusement les tibias et fixer dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.
- Déshydratation: Après fixation, lavez doucement les tibias 3x avec 1x PBS. Plongez séquentiellement les éprouvettes dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant 5 min deux fois séparément.
- Plongez les éprouvettes dans de l’acétone pendant 12 h, dans 1/2 d’acétone 1/2 résine pendant 2 h, et dans de la résine pure dans un four de séchage pendant la nuit.
NOTA : La résine a été préparée à l’aide de résine disponible dans le commerce (p. ex. résine Embed 812) conformément aux instructions du fabricant. - Incorporer: Ajoutez de la résine pure dans un réservoir d’encastrement de gel de silice approprié et placez les échantillons doucement pour éviter les bulles. Polymériser la résine dans un étuve de séchage à 60 °C pendant 48 h.
- Couper les éprouvettes en sections épaisses de 5 μm en continu à l’avec un microtome rotatif. Conservez le reste des échantillons avec du desséchant à température ambiante.
- Adhérez aux sections avec une pince à épiler dans une goutte de 75% d’alcool. Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre. Capturez le étiquetage de fluorescence rouge et vert avec un microscope à fluorescence.
- Mesurez la largeur entre deux lignes d’étiquetage (Ir.L.Wi), le périmètre trabéculaire monétique (sL.Pm), le périmètre trabéculaire à double étiquette (dL.Pm) et le périmètre trabéculaire total (Tb.Pm). Calculer le taux d’apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/jours d’intervalle. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.
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Representative Results
Utilisant le protocole actuel, des souris spécifiques osteoclast de suppression Stat3 ont été produites pour étudier l’influence de la suppression STAT3 sur la différentiation osteoclast. Les souris Stat3Ctsk et leurs compagnons de litière de type sauvage (WT) ont été élevés et gardés après le génotypage. Des macrophages de moelle osseuse ont été isolés et cultivés en osteoclasts, et la suppression STAT3 chez les souris Stat3Ctsk a été démontrée (Figure 1).
La reconstruction des fémurs et l’analyse quantitative par micro-CT ont indiqué que la masse osseuse des souris Stat3Ctsk a été augmentée comparée aux souris WT (Figure 2).
L’histomorphologie des fémurs des souris WT et Stat3Ctsk a été examinée par coloration H&E(figure 3).
L’activité Osteoclastogenic chez les souris a été détectée par la souillure de PIÈGE. Les ostéoclastes étaient des cellules TRAP+ (rouge vin ou violet) avec des noyaux multiples et une taille énorme(Figure 4A). Le nombre de TRAP+ osteoclasts était plus faible chez les souris Stat3Ctsk par rapport aux souris WT(figure 4B),ce qui indique que la carence en STAT3 altère la formation d’osteoclast.
L’ostéogenèse chez la souris est représentée par le taux d’apposition minérale (MAR) et a été mesurée par double étiquetage rouge de calcéine et d’alizarine (Figure 5). La calcine et le rouge d’alizarine ont été séquentiellement injectés intrapéritonéalement. Par conséquent, la zone entre les lignes de fluorescence rouge de calèche (vert) et d’alizarine rouge (rouge) représente l’os nouvellement formé sur quatre jours. Comme le montre la figure 5,stat3 supprimé dans les ostéoclastes n’a pas influencé l’anabolisme osseux.
Figure 1 : Illustration de la génération de modèles murins de délétion Stat3 spécifiques à l’ostéoclaste et de souris génétiquement modifiées. (A) Schéma schématique de la suppression de Stat3 dans la cathepsine K (Ctsk) - exprimant les ostéoclastes via le système Cre-loxP. (B) Progrès de reproduction des souris de délétion Stat3 spécifiques osteoclast. Des souris Stat3fl/fl ont été croisées avec des souris Ctsk-Cre (F0) pour générer des souris hétérozygotes Stat3fl/+; Souris Ctsk-Cre (F1). Mâle Stat3fl/+; Des souris Ctsk-Cre ont été gardées et croisées avec des souris femelles Stat3fl/fl pour générer des souris homozygotes Stat3fl/fl; Souris Ctsk-Cre (F2). Mâle Stat3fl/fl; Des souris Ctsk-Cre ont été gardées et croisées avec des souris femelles Stat3fl/fl pour générer Stat3fl/fl; Souris Ctsk-Cre et souris Stat3fl/fl. (C) Génotypage pour divers génotypes de souris. Stat3 mutant: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Western blot de STAT3 dans les osteoclasts cultivés avec des macrophages de moelle osseuse de stat3fl/ fl et Stat3Ctsk souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Reconstruction tridimensionnelle et analyse quantitative des paramètres de microarchitecture chez les fémurs de souris à l’aide de la micro-tomodensitométrie. (A) Images micro-CT reconstruites en trois dimensions de l’os trabéculaire des fémurs de 8 semaines-vieilles wt et stat3ctsk. La région d’intérêt (ROI) était dans une largeur totale de 1 millimètre d’os trabecular près du plat distal de croissance. (B) Images micro-CT reconstruites en 3D de l’os cortical des fémurs de 8 semaines de souris WT et Stat3Ctsk. Le ROI était dans une section totale de 1 millimètre de large de l’os cortical du milieu des fémurs. (C à H) Paramètres quantitatifs de microarchitecture de micro-CT : densité minérale d’os (BMD), fraction volumique d’os (BV/TV), épaisseur trabecular (Tb.Th.), nombre trabecular (Tb.N.), séparation trabecular (Tb.Sp.), et épaisseur corticale d’os (Ct.Th.). Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SD, n=4, *P<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 3 : Histomorphologie des fémurs de souris WT et Stat3Ctsk exposées par coloration H&E. La courbe pointillée en forme de M indique une couche de cartilage. Le champ relatif de haute puissance de l’os cortical est encadré de lignes pointillées et exposé ci-dessous. Le champ relatif de haute puissance de l’os trabéculaire est entouré de lignes pointillées et exposé en bas. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 4 : Ostéoclastogenèse chez les fémurs de souris représentées par coloration TRAP. (A) PIÉGEAGE coloration des fémurs de 8 semaines-vieux WT et Stat3Ctsk souris. TRAP+ ostéoclastes multinucleated sont indiqués par des triangles noirs. Un champ relatif de haute puissance d’ostéoclastes entourés de lignes pointillées est exposé ci-dessous, démontrant plusieurs noyaux et une taille énorme. (B) Les nombres de TRAP+ osteoclasts multinucleated ont été comptés. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SD, n=5, *P<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 5 : Ostéogenèse chez les fémurs de souris représentées par double étiquetage de la calcétine et de l’alizarine rouge. (A) Des souris de sept semaines ont été séquentiellement injectées avec de la calcétine le jour 0, avec le rouge d’alizarine le jour 4, puis sacrifiées le jour 7. La zone entre la calcétine (verte) et les lignes de fluorescence rouges (rouges) d’alizarine représente l’os cortical nouvellement formé sur quatre jours. (B) Le taux d’apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse (BFR/BS) calculés par la distance des deux lignées représentent l’activité ostéogénique de l’os cortical. (C) La zone entre les lignes de fluorescence rouge de calcétine (vert) et rouge d’alizarine (rouge) représente l’os trabéculaire nouvellement formé en quatre jours. (D) MAR et BFR/BS représentent l’activité ostéogénique de l’os trabéculaire. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SD, n=5, *P<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier le mécanisme et le traitement pharmaceutique des maladies humaines13. Les souris Ctsk-Cre ont été largement utilisées pour les études fonctionnelles des ostéoclastes6. La présente étude a décrit les protocoles des méthodes pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.
L’analyse histologique est la meilleure méthode intuitive pour détecter le métabolisme osseux. Et la qualité des sections de paraffine est la base de l’analyse histologique. Le temps suffisant pour la pleine fixation et la décalcification du tissu d’os est extrêmement essentiel puisque des tissus d’os peuvent être fragmentés. Les chercheurs qui se concentrent sur les fémurs et les tibias devraient placer le fémur et le tibia à un angle de 90 ° dans l’étape d’intégration. Afin d’effectuer l’analyse histologique fiable et de haute qualité, nous avons choisi les sections sagittales de paraffine dans lesquelles la couche de cartilage était symétrique et avons montré une ligne claire en forme de M dans la souillure de H&E, qui représente l’angle et la profondeur appropriés de ces sections continues. D’autre part, si vous avez besoin d’observer les articulations du genou et le ligament articulaire adjacent, le fémur et le tibia doivent être placés à un angle de 120 °.
TRAP a servi pendant des décennies de marqueur biochimique pour la fonction osteoclast14,puisqu’il est principalement exprimé dans les osteoclasts15,16. Deux substrats sont habituellement utilisés pour évaluer l’activité de la phosphatase acide. Le phosphate naphtol-ASBI (N-ASBI-P) est un excellent substrat pour l’isoforme TRAP 5b spécifique à l’ostéoclaste. Cependant, le phosphate de para-nitrophényle (pNPP) peut également être hydrolysé par des TRAPs non de type5 17. Par conséquent, la méthode naphtol-ASBI acide phosphorique-pararosaniline pour la démonstration histochimique de TRAP est très spécifique dans les sections tissulaires17,18,19. La macrophage phosphatase (phosphatase acide) a un pH optimal de 5,0 à 6,0, auquel elle est principalement résistante au tartrate20. Ainsi, nous recommandons que dans le protocole de l’analyse de souillure de PIÈGE, des sections de tissu re-souillées par hematoxylin ne devraient pas être décolorées avec de l’acide chlorhydrique. Il est important de savoir, bien que les ostéoblastes et les ostéocytes proches des zones de remodelage osseux expriment également TRAP21,seules d’énormes cellules TRAP-positives avec plus de trois noyaux ont été considérées comme ostéoclastes. Dans cette étude, les souris Stat3Ctsk ont montré une activité ostéoclaste inhibée (Figure 4).
La calcine est un fluorochrome (fluorescence verte) qui est largement utilisé pour indiquer la croissance squelettique pendant la calcification. Il peut se lier au calcium et être incorporé dans les cristaux de carbonate de calcium nouvellement formés22. De même, la caltine, le rouge d’alizarine (fluorescence rouge) et la tétracycline (fluorescence jaune) ont été intégrés dans l’os pour estimer la croissance à partir du moment de l’exposition23,24. De nombreuses études dans le passé ont utilisé des fluorochromes simples (généralement de la calcétine) pour étiqueter l’os, mais les observateurs peuvent être facilement confondus entre l’os nouvellement formé et le vieil os, en particulier dans l’os trabéculaire irrégulier. Par conséquent, nous suggérons que les chercheurs injectent deux types différents de fluorochromes chez la souris pour distinguer l’os plus récent de l’os plus ancien. Selon nos tests, la calcétine couplée à l’alizarine pourrait obtenir le contraste le plus suffisant et le plus durable. Dans cette étude, le étiquetage rouge de calcéine-alizarine a été utilisé pour détecter le taux ostéogénique de tissu osseux et il s’est avéré que l’activité de l’ostéoblaste n’a pas été influencée chez les souris Stat3Ctsk (Figure 5).
En bref, pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité de l’ostéoclaste, ce protocole décrit une méthode canonique pour générer un modèle murin transgénique. Ce protocole décrit également quelques techniques typiques pour analyser le phénotype squelettique. Dans cette étude, la suppression de STAT3 a altéré la formation osteoclast et a augmenté la masse d’os. Ces techniques peuvent être intéressantes pour ceux qui sont nouveaux dans la recherche sur les tissus squelettiques. Cependant, d’autres caractéristiques du système squelette sont concernées pour une étude plus approfondie, telles que la propriété mécanique25. Et nous devons toujours garder un œil sur le développement de nouvelles techniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Professeur Weiguo Zou et S. Kato pour les réactifs et les souris et les membres du laboratoire Zou pour leurs discussions utiles. Nous remercions également le Laboratoire de stomatologie numérisée et le Centre de recherche sur les anomalies craniofaciales du neuvième hôpital populaire de Shanghai pour son aide. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, du fonds SHIPM-mu de l’Institut de médecine de précision de Shanghai, du Neuvième Hôpital populaire de Shanghai, de l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai [JC201809], du projet d’incitation de l’équipe d’innovation de haut niveau pour l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai , le Fonds de recherche interdisciplinaire du neuvième hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’université JiaoTong de Shanghai [JYJC201902]. Et L.J. est un chercheur du programme de développement des jeunes talents médicaux exceptionnels, du programme de développement des jeunes « Rising Stars of Medical Talent » de Shanghai et du projet « Chen Xing » de l’Université Jiaotong de Shanghai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
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