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Biology

Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.

Abstract

Modelos de camundongos transgênicos são poderosos para entender os genes críticos que controlam a diferenciação e atividade osteoclante, e para estudar mecanismos e tratamentos farmacêuticos da osteoporose. Os camundongos Cathepsin K (Ctsk)-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é relevante na homeostase óssea, mas seu papel nos osteoclas in vivo permanece mal definido. Para fornecer a evidência in vivo de que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo, geramos um modelo de rato de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) e analisou seu fenótipo esquelético. A varredura microcsi tomografia e a reconstrução 3D implicaram aumento da massa óssea nos camundongos eliminatórios condicionais. Foram realizadas colorações de H&E, re coloração dupla de calceína e alizarina vermelha e coloração de fosfattase de ácido resistente a tartaratos (TRAP) para detectar o metabolismo ósseo. Em suma, este protocolo descreve alguns métodos e técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.

Introduction

O osso esquelético é o principal órgão portador de carga do corpo humano e está sob pressão do ambiente interno e externo durante a caminhada e o exercício1. Ao longo de sua vida, os ossos passam continuamente pela auto-renovação, que é equilibrada por osteoblastos e osteoclartos. O processo de osteoclasstos limpando ossos velhos e osteoblastos formando novos ossos mantém a homeostase e a função mecânica do sistema esquelético2. A perturbação no equilíbrio pode induzir doenças metabólicas ósseas, como a osteoporose. A osteoporose, causada pelo excesso de atividade osteoclástica, é globalmente prevalente e causa perdas econômicas substanciais para a sociedade2,3,4. De acordo com o número limitado de medicamentos disponíveis para o tratamento da osteoporose e seu risco de efeitos adversos4, é importante desvendar os detalhes da formação e atividade do osteoclato.

Os osteoclatos derivados da linhagem hematopoiética monócito/macrófago têm múltiplos núcleos (podem ter de 2 a 50 núcleos) e são grandes (geralmente maiores que 100 μm de diâmetro)2. Embora a exploração de mecanismos e a triagem de medicamentos para distúrbios osteoclásticos tenham sido amplamente melhoradas através da cultura osteoclasta in vitro, as complicadas reações orgânicas tornam a evidência in vivo indispensável para a terapia-alvo. Devido às semelhanças genéticas e fisiopacionológicas entre camundongos e humanos, modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente utilizados para estudar os mecanismos e os tratamentos farmacêuticos da doença humana in vivo6. O sistema Cre-loxP é uma tecnologia amplamente utilizada para edição de genes de camundongos e permitiu que os pesquisadores investigassem funções genéticas de forma específica de tecido/célula5. Cathepsin K (CSTK) é uma protease de cisteína secretada por osteoclartos que pode degradar colágeno ósseo8. É bem aceito que o CTSK seja expresso seletivamente em osteoclastos maduros; portanto, os camundongos Ctsk-Cre são considerados uma ferramenta útil para estudos funcionais de osteoclatos e tem sido utilizado6.

O transdutor de sinal e ativador da família de transcrição (STAT) é clássico e altamente significativo em imunidade e progressão e desenvolvimento do câncer7,8. Entre os sete STATs, o STAT3 é relatado como o mais relevante para a homeostaseóssea 9,10. Vários estudos in vivo relataram que a inativação específica do STAT3 nos osteoblastos diminui a formaçãoóssea 9,10. No entanto, as evidências sólidas sobre a participação do STAT3 na formação de osteoclatos e metabolismo ósseo in vivo ainda são limitadas. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo de mouse de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, a partir de agora chamado Stat3Ctsk) que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo11. No presente estudo, descrevemos os métodos e protocolos que utilizamos para analisar as alterações na massa óssea, histomorfologia óssea e anabolismo ósseo e catabolismo dos camundongos Stat3Ctsk, a fim de estudar a influência da exclusão STAT3 específica do osteoclato na homeostase óssea.

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Protocol

Todos os métodos relacionados aos animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Xangai Jiaotong.

1. Reprodução de camundongos de exclusão Stat3 específicos do assino

NOTA: Os ratos Stat3fl/fl foram obtidos comercialmente. Os camundongos Ctsk-Cre foram fornecidos pela S. Kato (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão12). Os camundongos foram criados e mantidos sob condições específicas sem patógenos (FPS) na instalação institucional de animais em condições padronizadas.

  1. Emparelhe um rato macho sexualmente maduro com duas fêmeas da mesma idade. Após 18 dias, verifique diariamente os cheques para recém-nascidos. Separe os camundongos fêmeas grávidas e mantenha-o sozinho, se necessário. Mude os camundongos machos entre diferentes gaiolas de reprodução se os camundongos fêmeas não estivessem grávidas dentro de um mês do emparelhamento.
  2. Cruze ratosfl/fl de Stat3para ratos Ctsk-Cre (F0). Corte as caudas para genotipagem e mantenha o Stat3fl/+ ;masculino Camundongos Ctsk-Cre até que estejam sexualmente maduros, que tem cerca de 6 semanas de idade (F1). Use os seguintes primers: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
  3. Cruze 6 semanas de idade masculino Stat3fl/+; Camundongos Ctsk-Cre com ratos Stat3fl/fl femininos. Corte as caudas para genotipagem e mantenha o Stat3 fl/flmasculino; Camundongos Ctsk-Cre até que estejam sexualmente maduros, que tem cerca de 6 semanas de idade (F2).
  4. Cruz 6-week-old masculino Stat3 fl/fl; Camundongos Ctsk-Cre com ratos Stat3fl/fl fêmeas (F3). Corte as caudas para genotipagem e substitua os camundongos de criação antigos por camundongos mais jovens com o tempo (F3+N).

2. Coleta de espécimes

  1. Eutanize seis pares de 8 semanas de idade Stat3fl/fl e Stat3Ctsk lixo-mate ratos separadamente com asfixia por dióxido de carbono.
    NOTA: A taxa de fluxo de CO2 desloca 30% do volume da gaiola por minuto (por exemplo, para 45 cm x 30 cm x 30 cm de gaiola a taxa de fluxo de CO2 é de 40 L/min).
  2. Coloque os ratos em uma posição supina. Desloque as articulações bilaterais do quadril suavemente à mão. Use uma tesoura oftálmica para cortar a pele verticalmente da tíbia distal e, em seguida, dissecar toda a pele do membro traseiro.
  3. Corte o ligamento articular da articulação do quadril direito e articulação do joelho com uma tesoura para separar o membro traseiro. Corte o trochanter e a junção da fíbula e, em seguida, mergulhe o membro traseiro em 4% de paraformaldeído. Mantenha os membros traseiros certos para o passo 3. Corte adequadamente o osso em ambas as extremidades para imergir completamente e fixar a medula óssea com 4% de paraformaldeído.
  4. Corte o ligamento articular da articulação do quadril esquerdo e da articulação do joelho com uma tesoura, remova suavemente o tecido mole e separe cuidadosamente a tíbia e o fêmur. Mergulhe a tíbia e o fêmur separadamente em 75% de etanol. Mantenha a femora para a etapa 4 e tíbia para a etapa 6. Certifique-se de manter o trochanter intacto.

3. Preparação da seção de parafina

  1. Fixar o membro traseiro direito em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 48 h.
  2. Decalcificar: Lave suavemente os espécimes com 1x PBS por 10 min 3 vezes. Decalcifice os espécimes em 15% EDTA (150 g EDTA em 800 mL de ddH2O e 100 mL de 10x PBS) com um decalcificador ultrassônico por 3 a 4 semanas até que os ossos possam ser dobrados. Substitua por um fluido de decalcificante fresco a cada dois dias.
  3. Lave suavemente as amostras 3x com 1x PBS e, em seguida, mergulhe-as em 75% de etanol a 4 °C durante a noite.
  4. Desidratação: No segundo dia, imergir sequencialmente espécimes em 95% de etanol, 100% etanol e xileno, cada um por 1h duas vezes.
  5. Mergulhe espécimes em 1/2 xileno 1/2 parafina por 30 min. Mergulhe os espécimes em parafina a 65 °C durante a noite.
  6. Incorporar: Selecione um tanque de incorporação adequado para incorporar. Coloque a tíbia uniformemente por baixo. Coloque o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90°. Depois que a parafina tiver esfriado e solidificado, remova-a do tanque de incorporação. Numerar os espécimes e armazená-los a -20 °C durante a noite.
  7. Corte seções de 5 μm de espessura continuamente usando o microtoma. Corte de 20 a 40 seções. Espalhe as seções em água de 37 °C, adere-as aos slides do microscópio e asse a 42 °C durante a noite.

4. Micro-CT de digitalização e análise

  1. Escaneie a femora esquerda com um scanner microcáludo. Resolução: 10 μm; Tensão: 70 kV; Corrente: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Passo de rotação: 0,5°.
  2. Reconstrua imagens 3D do osso cortical e do osso trabecular usando o software de suporte do scanner seguindo as instruções do fabricante. Os ROIs têm uma largura total de 1 mm de osso trabecular próximo à placa de crescimento distal e em uma seção total de 1 mm de largura do osso cortical no meio da femora.
  3. Calcular os parâmetros quantitativos de microarquitetura: densidade mineral óssea (DMO), fração de volume ósseo (VB/TV), espessura trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separação trabecular (Tb.Sp.) e espessura óssea cortical (Ct.Th.).

5. Coloração de armadilha

  1. Asse as seções de parafina a 65 °C por 30 min.
  2. Dewax: Mergulhe as seções em xileno por 10 minutos. Realize esta etapa 3x com xileno fresco.
  3. Reidratar: Mergulhe as seções sequencialmente em 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol e ddH2O, cada uma por 5 min duas vezes.
  4. Prepare a solução de coloração usando o kit de coloração TRAP seguindo as instruções do fabricante e aqueça até 37 °C.
    NOTA: A solução de coloração TRAP deve ser preparada imediatamente antes de cada ensaio.
  5. Adicione 50-100 μL de solução de coloração a cada amostra e incubar em uma câmara úmida de 37 °C por 20-30 min. Verifique o estado de coloração dos osteoclastos sob um microscópio de luz a cada 5 minutos até que os osteoclastos multinucleados vermelhos possam ser vistos. Termine a reação com ddH2O.
  6. Contra-mancha na solução de hematoxilina para 30 s. Crie uma cor azul estável por imersão em solução de amônia de 1% por 1 min. Enxágüe lentamente água da torneira.
  7. Monte as seções com tampas usando bálsamo neutro e seque durante a noite.
  8. Capture 3-5 campos de interesse por um microscópio. Analise o perímetro trabecular por Imagem J: meça o comprimento da barra de escala (Ls) usando a ferramenta 'linha reta' como L1, em seguida, meça o comprimento do perímetro trabecular usando a ferramenta 'linha segmentada' como L2, o comprimento físico (Lp)= Ls*L2 /L1). Conte o número de células TRAP-positivas com mais de três núcleos.

6. Rotulagem dupla vermelha de Calcein e alizarin

  1. Preparação da amostra: Injete intraperitonealmente 20 mg/kg de calceína (1 mg/mL em solução NaHCO3) no dia 0, e 25 mg/kg alizarin vermelho S (AL, 2 mg/mL em H2O) no dia 4. Sacrifício de ratos no 7º dia. Desassociar cuidadosamente a tíbia e fixar em 4% paraformaldeído a 4 °C por 48 h.
  2. Desidratar: Após a fixação, lave suavemente a tíbia 3x com 1x PBS. Imersão sequencialmente as amostras em 95% de etanol, 100% etanol e xileno por 5 min duas vezes separadamente.
  3. Mergulhe os espécimes em acetona por 12 h, em 1/2 resina acetona 1/2 por 2 h, e em resina pura em um forno de secagem durante a noite.
    NOTA: A resina foi preparada por resina comercialmente disponível (por exemplo, Embed 812 Resin) de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Incorporar: Adicione resina pura em um tanque adequado de incorporação de gel de sílica e coloque os espécimes suavemente para evitar bolhas. Polimerize a resina em forno de secagem a 60 °C por 48 h.
  5. Corte os espécimes em seções de 5 μm de espessura continuamente com um microtome rotativo. Armazene o resto das amostras com dessecante à temperatura ambiente.
  6. Adere às seções com pinças em uma queda de 75% de álcool. Monte as seções com tampas usando bálsamo neutro. Capture rotulagem de fluorescência vermelha e verde com um microscópio de fluorescência.
  7. Meça a largura entre duas linhas de rotulagem (Ir.L.Wi), perímetro trabecular de etiqueta única (sL.Pm), perímetro trabecular de dupla rotulagem (dL.Pm) e perímetro trabecular total (Tb.Pm). Calcular a taxa de apposition mineral (MAR) e a taxa de formação óssea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/dias de intervalo. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

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Representative Results

Utilizando o protocolo atual, foram gerados camundongos de exclusão Stat3 específicos para estudar a influência da exclusão de STAT3 na diferenciação de osteoclatos. Os camundongos Stat3Ctsk e seus ninhados wildtype (WT) foram criados e mantidos após a genotipagem. Macrófagos de medula óssea foram isolados e cultivados em osteoclatos, e a exclusão de STAT3 em camundongos Stat3Ctsk foi demonstrada(Figura 1).

A reconstrução femora e a análise quantitativa por microCC indicaram que a massa óssea dos camundongos Stat3Ctsk foi aumentada em comparação com os camundongos WT(Figura 2).

A histomorfologia da femora dos camundongos WT e Stat3Ctsk foi examinada via mancha H&E(Figura 3).

A atividade osteoclastogênica nos camundongos foi detectada pela coloração trap. Os osteoclastos foram células TRAP+ (vinho tinto ou roxo) com múltiplos núcleos e tamanho enorme(Figura 4A). O número de TRAP+ osteoclastas foi menor nos camundongos Stat3Ctsk em comparação com oscamundongosWT (Figura 4B),o que indica que a deficiência de STAT3 prejudicou a formação osteoclasta.

A osteogênese em camundongos é representada pela taxa de apposição mineral (MAR) e foi medida pela rotulagem dupla vermelha de calceína e alizarina(Figura 5). Calcein e alizarin vermelho foram sequencialmente injetados intraperitoneally. Portanto, a área entre as linhas de fluorescência de calcein (verde) e alizarina vermelha (vermelha) representa osso recém-formado ao longo de quatro dias. Como mostrado na Figura 5,o STAT3 excluído nos osteoclartos não influenciou o anabolismo ósseo.

Figure 1
Figura 1: Ilustração da geração específica do modelo de modelo de desestat3 e camundongos geneticamente modificados. (A) Diagrama esquemático da exclusão de Stat3 em osteoclastas expressantes de cathepsin K (Ctsk) através do sistema Cre-loxP. (B) Progresso de reprodução de camundongos de exclusão Stat3 específicos do assinoto. Os ratos Stat3fl/fl foram cruzados para ratos Ctsk-Cre (F0) para gerar stat3fl/+heterozigosos; Camundongos Ctsk-Cre (F1). Stat3masculino fl/+; Os camundongos Ctsk-Cre foram mantidos e cruzados para camundongos Stat3fl/fl fêmeas para gerar stat3fl/flhomozigosos ; Camundongos Ctsk-Cre (F2). Stat3fl/flmasculino; Os camundongos Ctsk-Cre foram mantidos e cruzados para ratos stat3fl/fl fêmeas para gerar Stat3fl/fl; Camundongos Ctsk-Cre e ratos Stat3fl/fl. (C) Genotipagem para vários genótipos de camundongos. Stat3 mutante: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Mancha ocidental de STAT3 em osteoclastos cultivados com macrófagos de medula óssea de Stat3fl/fl e Stat3Ctsk ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Reconstrução tridimensional e análise quantitativa de parâmetros de microarquitetura em femora de camundongos utilizando micro-tomografia computadorizada. (A) Imagens microcálidas tridimensionalmente reconstruídas do osso trabecular de femora de 8 semanas de idade WT e Stat3Ctsk ratos. A região de interesse (ROI) estava em uma largura total de 1 mm de osso trabecular próximo à placa de crescimento distal. (B) 3D reconstruído imagens micro-CT de osso cortical de femora de 8 semanas de idade WT e Stat3Ctsk ratos. O ROI estava em uma seção total de 1 mm de largura de osso cortical do meio da femora. (C-H) Parâmetros quantitativos de microarquitetura da micro-TC: densidade mineral óssea (DMO), fração de volume ósseo (VB/TV), espessura trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separação trabecular (Tb.Sp.) e espessura óssea cortical (Ct.Th.). As barras de erro representam a média ± SD, n=4, *P<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Histomorfologia de femora de WT e Stat3Ctsk camundongos exibidos via mancha H&E. A curva pontilhada em forma de M indica uma camada de cartilagem. O campo relativo de alta potência do osso cortical é encaixotado com linhas pontilhadas e exibido abaixo. O campo relativo de alta potência do osso trabecular é circulado com linhas pontilhadas e exibido na parte inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Osteoclastogênese em femora de camundongos representados via coloração TRAP. (A) Mancha TRAP de femora de camundongos WT e Stat3Ctsk de 8 semanas de idade. TRAP+ osteoclastas multinucleadas são indicadas por triângulos negros. Campo relativo de alta potência de osteoclastos circulados com linhas pontilhadas são exibidos abaixo, demonstrando múltiplos núcleos e um tamanho enorme. (B) Foram contados os números de TRAP+ osteoclastas multinucleadas. As barras de erro representam a média ± SD, n=5, *P<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Osteogênese em femora de camundongos representados via calcein e rotulagem dupla vermelha alizarina. (A) Camundongos de sete semanas de idade foram sequencialmente injetados com calcein no dia 0, com alizarin vermelho no dia 4, e depois sacrificados no dia 7. A área entre as linhas de fluorescência de calcein (verde) e alizarin vermelho (vermelho) representa um osso cortical recém-formado ao longo de quatro dias. (B) Taxa de apposição mineral (MAR) e taxa de formação óssea (BFR/BS) calculadas pela distância das duas linhas representam a atividade osteogênica do osso cortical. (C) A área entre as linhas de fluorescência de calcein (verde) e alizarina vermelha (vermelha) representa o osso trabecular recém-formado em quatro dias. (D) MAR e BFR/BS representam a atividade osteogênica do osso trabecular. As barras de erro representam a média ± SD, n=5, *P<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente usados para estudar o mecanismo e o tratamento farmacêutico da doença humana13. Os camundongos Ctsk-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos6. O presente estudo descreveu os protocolos dos métodos para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.

A análise histológica é o melhor método intuitivo para detectar o metabolismo ósseo. E a qualidade das seções de parafina é a base da análise histológica. Tempo suficiente para fixação total e descalcificação do tecido ósseo é extremamente essencial, uma vez que os tecidos ósseos podem ser fragmentados. Os pesquisadores com foco na femora e na tíbia devem colocar o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90° na etapa de incorporação. Para realizar análises histológicas confiáveis e de alta qualidade, escolhemos seções de parafina sagital em que a camada de cartilagem era simétrica e mostrava uma linha clara em forma de M na coloração de H&E, que representa o ângulo e a profundidade adequados dessas seções contínuas. Por outro lado, se você precisar observar as articulações do joelho e o ligamento articular adjacente, o fêmur e a tíbia devem ser colocados em um ângulo de 120°.

O TRAP atua há décadas como marcador bioquímico para a função osteoclasta14,uma vez que é predominantemente expresso nos osteoclartos15,16. Dois substratos são geralmente usados para avaliar a atividade de fosfates ácida. Fosfato de naftol-ASBI (N-ASBI-P) é um excelente substrato para o isóforme TRAP 5b específico do osteoclato. No entanto, o fosfato para-nitrofenil (pNPP) também pode ser hidrolisado por TRAPs não-tipo 517. Portanto, o método de ácido fosfórico-pararosanilina naftol-ASBI para demonstração histoquímica de TRAP é altamente específico nas seções teciduais17,18,19. O fosfattase macfago (fosfattase ácido) tem um pH ótimo de 5,0-6.0, no qual é principalmente resistente ao tartarato20. Assim, recomendamos que no protocolo de ensaio de coloração TRAP, as seções teciduais re-manchadas pela hematoxilina não devem ser descoloridas com ácido clorídrico. É importante ressaltar que, embora os osteoblastos e oscitos próximos a áreas de remodelação óssea também expressem o TRAP21, apenas enormes células TRAP-positivas com mais de três núcleos foram consideradas como osteoclastos. Neste estudo, os camundongos Stat3Ctsk apresentaram atividade osteoclasta inibida(Figura 4).

Calcein é um fluorocromático (fluorescência verde) que é amplamente utilizado para indicar o crescimento esquelético durante a calcificação. Pode se ligar ao cálcio e ser incorporado nos cristais carbonato de cálcio recém-formados22. Da mesma forma, calceína, vermelho alizarin (fluorescência vermelha) e tetraciclina (fluorescência amarela) foram incorporados no osso para estimar o crescimento a partir do momento da exposição23,24. Muitos estudos no passado usaram fluorochromes únicos (geralmente calcein) para rotular osso, mas observadores podem ser facilmente confundidos entre o osso recém-formado e o osso velho, especialmente em osso trabecular irregular. Portanto, sugerimos que os pesquisadores injetem dois tipos diferentes de fluorochromes em camundongos para distinguir o osso mais novo do osso mais antigo. De acordo com nossos testes, calcein juntamente com alizarin pode alcançar o contraste mais suficiente e duradouro. Neste estudo, a rotulagem vermelha calcein-alizarin foi utilizada para detectar a taxa osteogênica do tecido ósseo e descobriu-se que a atividade do osteoblasto não foi influenciada nos camundongos Stat3Ctsk (Figura 5).

Em suma, para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta, este protocolo descreve um método canônico para gerar um modelo de camundongo transgênico. Este protocolo também descreve algumas técnicas típicas para analisar o fenótipo esquelético. Neste estudo, a exclusão do STAT3 prejudicou a formação osteoclasta e aumentou a massa óssea. Essas técnicas podem ser interessantes para aqueles que são novos na pesquisa de tecidos esqueléticos. No entanto, mais características do sistema esqueleto estão relacionadas a um estudo mais aprofundado, como a propriedade mecânica25. E nós sempre precisamos manter os olhos no desenvolvimento de novas técnicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Prof. Weiguo Zou e à S. Kato pelos reagentes e ratos e aos membros do laboratório Zou por discussões úteis. Agradecemos também ao Laboratório de Estomatologia Digitalizada e Centro de Pesquisa de Anomalias Craniofaciais do Hospital do Nono Povo de Xangai pela assistência. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, o fundo SHIPM-mu do Instituto de Medicina de Precisão de Xangai, Shanghai Nona Escola Popular de Medicina, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], o Projeto de Incentivo da Equipe de Inovação de Alto Nível para a Escola de Medicina da Universidade de Xangai Jiao Tong , o Fundo de Pesquisa Interdisciplinar do Hospital do Nono Povo de Xangai, Shanghai JiaoTong University School of Medicine [JYJC201902]. E L.J. é um estudioso dos Talentos Médicos Da Juventude, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program e o projeto "Chen Xing" da Universidade de Xangai Jiaotong.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão <em>stat3</em> condicional
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Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

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