Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Скелетный фенотип анализ условной модели удаления Stat3 мыши

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61390
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает канонический метод для понимания критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo. Этот метод использует трансгенную модель мыши и некоторые канонические методы для анализа скелетного фенотипа.

Abstract

Трансгенные модели мыши являются мощными для понимания критических генов, контролирующих дифференциацию и активность остеокласта, а также для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения остеопороза. Катепсин K (Ctsk)-Cre мышей были широко использованы для функциональных исследований остеокластов. Препонент сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) актуален в гомеостазе костей, но его роль в остеокластах in vivo остается плохо определенной. Чтобы обеспечить in vivo доказательства того, что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей, мы создали остеокласт конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) и проанализировал его скелетный фенотип. Микро-КТ сканирование и 3D реконструкция подразумевает увеличение костной массы у условного нокаут мышей. Для обнаружения метаболизма костей были выполнены окрашивание, кальциин и ализарин красного двойного окрашивания, а также тартратостойкий кислотный фосфатаза (TRAP). Короче говоря, этот протокол описывает некоторые канонические методы и методы для анализа скелетного фенотипа и изучения критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo.

Introduction

Скелетная кость является основным несущим органом человеческого тела и находится под давлением как внутренней, так и внешней среды во время ходьбы и физическихупражнений 1. На протяжении всей своей жизни, кости постоянно проходят через самообувека, которая уравновешивается остеобластов и остеокластов. Процесс очистки остеокластов старых костей и остеобластов, образующих новую кость, поддерживает гомеостаз и механическую функцию скелетнойсистемы 2. Нарушение баланса может вызвать заболевания костного обмена веществ, такие как остеопороз. Остеопороз, вызванный избыточной остеокластической активностью, широко распространен во всем мире и наносит существенныеэкономические потери обществу 2,3,4. В соответствии с ограниченным числом препаратов, доступных для леченияостеопороза и их риск побочных эффектов 4, важно раскрыть детали формирования остеокласта и деятельности.

Остеокласты, полученные из моноцитов / макрофаг гематопоэтической линии имеют несколько ядер (может иметь от 2 до 50 ядер) и большие (обычно больше, чем 100 мкм в диаметре)2. Хотя изучение механизмов и скрининг препаратов на остеокластические расстройства были широко улучшены с помощью культуры остеокласта in vitro, сложные органические реакции делают in vivo необходимым доказательством для целенаправленной терапии. Из-за генетического и патофизиологического сходства между мышами и людьми, генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения заболеваний человека in vivo6. Система Cre-loxP является широко используемой технологией для редактирования генов мыши и позволила исследователям исследовать генные функции в тканевой/клеточной манере5. Катепсин K (CSTK) является протеазы цистеина выделяется остеокластов, которые могут ухудшить костного коллагена8. Хорошо известно, что CTSK избирательно выражается в зрелых остеокластов; таким образом, Ctsk-Cre мышей считаются полезным инструментом для функциональных исследований остеокластов и был использован6.

Сигнал превудактор и активатор транскрипции (STAT) семьи является классическим и весьма значительным в иммунитете и прогрессиирака и развития 7,8. Среди семи STATs, STAT3, как сообщается, наиболее актуальным для кости гомеостаза9,10. Несколько исследований in vivo сообщили, что специфическая инактивация STAT3 при остеобластах уменьшаетформирование костей 9,10. Тем не менее, веские данные об участии STAT3 в формировании остеокласта и метаболизме костей в виво по-прежнему ограничены. Недавно мы предоставили доказательства in vivo с остеокластом конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, далее называется Stat3Ctsk), что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей11. В настоящем исследовании мы описываем методы и протоколы, которые мы использовали для анализа изменений в костной массе, костной гистоморфологии, костной анаболии и катаболизма мышей Stat3Ctsk для изучения влияния остеокласт-специфического удаления STAT3 на гомеостаз костей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, касающиеся животных, описанных здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Школы медицины Шанхайского университета Цзяотонг.

1. Разведение остеокластных специфических мышей удаления Stat3

ПРИМЕЧАНИЕ: Stat3fl/fl мыши были получены коммерчески. Мыши Ctsk-Cre были предоставлены С. Като (Токиоский университет, Токио, Япония12). Мышей разводили и поддерживали в особых условиях, свободных от патогенов (SPF) в институциональном животноводм учреждении в стандартизированных условиях.

  1. Соедините сексуально зрелого самца мыши с двумя самками мышей того же возраста. После 18 дней, проверить ежедневные проверки для новорожденных. Отделять беременных самок мышей и держать его в покое, если это необходимо. Изменение мышей мужского пола среди различных клеток размножения, если самки мышей не были беременны в течение 1 месяца после спаривания.
  2. Пересеким мышей Stat3fl/fl на мышах Ctsk-Cre (F0). Клип хвосты для генотипирования и держать мужчин Stat3fl /; Ctsk-Cre мышей, пока они не сексуально зрелые, который составляет около 6 недель (F1). Используйте следующие грунтовки: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTTGTTCTC.
  3. Крест 6-недельный мужчина Stat3fl/; Ctsk-Cre мышей с самками Stat3fl/fl мышей. Клип хвосты для генотипирования и сохранить мужской Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre мышей, пока они не сексуально зрелые, что составляет около 6 недель (F2).
  4. Крест 6-недельный мужчина Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre мышей с самками Stat3fl/fl мышей (F3). Обрезать хвосты для генотипирования и заменить старые мышей разведения с молодыми мышами во времени (F3'N).

2. Коллекция specimen

  1. Euthanize шесть пар 8-недельный мужчина Stat3fl/fl и Stat3Ctsk littermate мышей отдельно с углекислым газом удушья.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока CO2 вытесняет 30% объема клетки в минуту (например, для 45 см х 30 см х 30 см клетки скорость потока CO2 составляет 40 л/мин).
  2. Поместите мышей в положение лежа. Аккуратно вывихите двусторонние тазобедренные суставы вручную. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы отрезать кожу вертикально от дистальной голени, а затем вскрыть всю кожу от задней конечности.
  3. Отрежьте суставную связку правого тазобедренного сустава и коленного сустава ножницами, чтобы отделить заднюю конечность. Вырезать trochanter и соединение малоберцовой кости, а затем погрузить заднюю конечность в 4% параформальдегида. Держите правые задние конечности для шага 3. Соответствующим образом вырезать кости на обоих концах, чтобы полностью погрузиться и исправить костного мозга с 4% параформальдегида.
  4. Разрежьте ножницами суставную связку левого тазобедренного сустава и коленного сустава, аккуратно удалите мягкую ткань и тщательно отделите голени и бедренную кость. Погрузите голени и бедренной кости отдельно в 75% этанола. Держите бедренную кость для шага 4 и tibiae для шага 6. Убедитесь, что трочантер нетронутыми.

3. Подготовка раздела Парафин

  1. Зафиксировать правую заднюю конечность в 4% параформальдегид при 4 КК для 48 ч.
  2. Decalcify: Аккуратно мыть образцы с 1x PBS в течение 10 мин 3 раза. Декалькордировать образцы в 15% EDTA (150 г ЭДТА в 800 мл ddH2O и 100 мл 10x PBS) с ультразвуковым десятичным усилителем в течение 3 до 4 недель, пока кости могут быть согнуты. Заменить свежей наклейкой жидкости через день.
  3. Аккуратно мыть образцы 3x с 1x PBS, а затем погрузить их в 75% этанола при 4 градусов по Цельсию на ночь.
  4. Обезвоживание: На второй день, последовательно погрузить образцы в 95% этанола, 100% этанола и ксилена, каждый в течение 1 ч в два раза.
  5. Погрузите образцы в 1/2 ксилена 1/2 парафина в течение 30 мин. Погрузите образцы в парафин при 65 градусов по Цельсию за ночь.
  6. Встраивание: Выберите подходящий встраивающий бак для встраивания. Поместите голени равномерно под. Поместите бедренную кость и голени под углом 90 градусов. После того, как парафин полностью остынет и затвердеет, удалите его из встраиваемого бака. Номер образцов и хранить их на -20 градусов по Цельсию на ночь.
  7. Вырезать 5 мкм толщиной разделов непрерывно с помощью микротома. Вырезать 20-40 разделов. Распределите секции на 37 градусов по Цельсию воды, придерживаться их микроскоп слайды, и выпекать при температуре 42 градусов по Цельсию на ночь.

4. Микро-КТ сканирование и анализ

  1. Сканирование левой бедренной кости с помощью микро-КТ сканера. Разрешение: 10 мкм; Напряжение: 70 кВ; Ток: 114 ЗА; Fliter: 0,5 мм Al; Шаг вращения: 0,5 градуса.
  2. Реконструкция 3D-изображений корковой кости и трабекулярной кости с помощью поддерживающего программного обеспечения сканера по указанию производителя. ROIs находятся в общей ширине 1 мм трабекулярной кости близко к дистальной пластины роста и в общей сложности 1 мм широкий раздел корковой кости в середине бедренной кости.
  3. Рассчитайте количественные параметры микроархитектуры: минеральная плотность костной ткани (BMD), фракция объема костной ткани (BV/TV), трабекулярная толщина (Tb.Th.), трабекулярное число (Tb.N.), трабекулярное разделение (Tb.Sp.) и толщина коры кости (Ct.Th.).

5. TRAP окрашивание

  1. Выпекать парафиновые секции при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  2. Dewax: Погрузите секции в ксилен в течение 10 мин. Выполните этот шаг 3x со свежим ксиленом.
  3. Регидратировать: Погрузите секции последовательно в 100% этанола, 95% этанола, 70% этанола, и ddH2O, каждый в течение 5 мин в два раза.
  4. Подготовьте окрашивающий раствор с помощью комплекта окрашивания TRAP, следуя инструкциям производителя, и подогрейте до 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РЕШЕНИЕ ДЛЯ окрашивания TRAP должно быть свежеприготовлено непосредственно перед каждым анализом.
  5. Добавьте к каждому образцу раствор для окрашивания 50–100 йл и инкубировать во влажной камере при 37 градусов по Цельсию в течение 20–30 минут. Проверьте состояние окрашивания остеокластов под световым микроскопом каждые 5 минут, пока не будут видны красные многоядерные остеокласты. Завершите реакцию ddH2O.
  6. Счетчик в гематоксилиновом растворе по 30 с. Создайте стабильный синий цвет путем погружения в 1% раствор аммиака в течение 1 мин. Промыть медленно проточной водопроводной водой.
  7. Намонтировать секции с coverslips с использованием нейтрального бальзама и сухой ночь.
  8. Захват 3-5 областей, представляющих интерес с помощью микроскопа. Проанализируйте трабекулярный периметр по изображению J: измерьте длину планки масштаба (Ls) спомощьюинструмента «прямая линия» как L1, затем измерьте длину трабекулярного периметра спомощьюинструмента «сегментированная линия» как L2, физической длины (Lp) » Ls'L2 /L1). Подсчитайте количество TRAP-положительных клеток с более чем тремя ядрами.

6. Кальцеин и ализарин красная двойная маркировка

  1. Препарат: Интраперитонально вводят 20 мг/кг кальцеина (1 мг/мл в растворе NaHCO3) на день 0, и 25 мг/кг ализарин красный S (AL, 2 мг/мл в H2O) на 4-й день. Жертвоприношения мышей на 7-й день. Тщательно отмежеваться от голени и зафиксировать в 4% параформальдегид при 4 градусов по Цельсию на 48 ч.
  2. Обезвоживание: После фиксации, аккуратно мыть голени 3x с 1x PBS. Последовательно погружайте образцы в 95% этанола, 100% этанола и ксилена в течение 5 мин два раза отдельно.
  3. Погрузите образцы в ацетон на 12 ч, в 1/2 ацетона 1/2 смолы на 2 ч, а в чистую смолу в сушильной печи на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смола была подготовлена коммерчески доступной смолой (например, Embed 812 Resin) в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Вставлять: Добавить чистую смолу в подходящий кремнезем гель встраивания танка и место образцов мягко, чтобы избежать пузырьков. Полимеризируйте смолу в сушильной печи при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 48 ч.
  5. Разрежьте образцы на 5 мкм толщиной секций непрерывно с вращающимся микротомом. Храните остальные образцы с desiccant при комнатной температуре.
  6. Придерживайтесь разделов с пинцетом в капле 75% алкоголя. Намонтировать секции с крышками с использованием нейтрального бальзама. Захват красный и зеленый флуоресценции маркировки с флуоресценции микроскопа.
  7. Измерьте ширину между двумя линиями маркировки (Ir.L.Wi), однотехтным трабекулярным периметром (sL.Pm), двух помеченным трабекулярным периметром (dL.Pm) и общим трабекулярным периметром (Tb.Pm). Рассчитайте скорость минерального аппозиции (MAR) и скорость формирования костей (BFR/BS). МАР и Ir.L.Wi/interval дней. BFR/BS( dL.Pm±sL.pm/2)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя настоящий протокол, остеокласт конкретных Stat3 удаления мышей были созданы для изучения влияния удаления STAT3 на остеокласт дифференциации. Stat3Ctsk мышей и их wildtype (WT) littermates были выведены и хранятся после генотипирования. Макрофаги костного мозга были изолированы и выуклились в остеокласты, и было продемонстрировано удаление STAT3 у мышей Stat3Ctsk (рисунок 1).

Реконструкция беморы и количественный анализ с помощью микро-КТ показали, что костная масса мышей Stat3Ctsk была увеличена по сравнению с мышами WT(рисунок 2).

Гистоморфология бедренной кости от wt и Stat3Ctsk мышей была рассмотрена через Окрашивание H'E(рисунок 3).

Остеокластогенная активность у мышей была обнаружена при окрашивание TRAP. Остеокласты были TRAP(вино красный или фиолетовый) клетки с несколькими ядрами и огромный размер (Рисунок 4A). Количество TRAP иостеокластов было ниже в Stat3Cts kмышейпо сравнению с WT мышей(рисунок 4B), что указывает на то, что STAT3 дефицит нарушения остеокласт формирования.

Остеогенез у мышей представлен минеральной скоростью аппозиции (MAR) и измеряется кальцином и ализарином красной двойной маркировкой(рисунок 5). Кальцеин и ализарин красный были последовательно интраперитонически вводили. Таким образом, область между кальциеном (зеленым) и ализарин красным (красным) линиями флуоресценции представляет собой новообразованную кость в течение четырех дней. Как показано на рисунке 5, удаленный STAT3 у остеокластов не повлиял на костную анаболию.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация остеокласта конкретных Stat3 удаления мыши модели поколения и генетически модифицированных мышей. (A)Схематическая диаграмма удаления Stat3 в катепсине K (Ctsk)-выражение остеокластов через систему Cre-loxP. (B) Разведение прогресс остеокласт конкретных Stat3 удаления мышей. Stat3fl/fl мыши были пересечены к мышам Ctsk-Cre (F0) для того чтобы произвести heterozygous Stat3fl/»; Мыши Ctsk-Cre (F1). Мужской Stat3fl/; Ctsk-Cre мышей держали и перешли к женщинам Stat3fl/fl мышей для создания гомозиготных Stat3fl/fl; Мыши Ctsk-Cre (F2). Мужской Stat3fl/fl; Ctsk-Cre мышей держали и перешли к женщинам Stat3fl/fl мышей для создания Stat3fl/fl; Мышей Ctsk-Cre и мышей Stat3fl/fl. (C)Генотипирование для различных генотипов мышей. Stat3 мутант: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Западная помарка STAT3 в остеокластах, обучиненых макрофагами костного мозга от мышей Stat3fl/fl и Stat3Ctsk. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Трехмерная реконструкция и количественный анализ параметров микроархитектуры в бедренной кости мышей с помощью микро-КТ сканирования. (A)Трехмерно реконструированные микро-КТ изображения трабекулярной кости бедренной кости от 8-недельных WT и Stat3Ctsk мышей. Область интереса (ROI) была в общей ширине 1 мм трабекулярной кости близко к дистальной пластины роста. (B ) 3D реконструированные микро-CT изображения корковой кости бедренной кости от 8-недельного WT и Stat3Ctsk мышей. ROI был в общей сложности 1 мм широкий участок корковой кости от середины бедренной кости. (C-H) Количественные параметры микроархитектуры микроКТ: минеральная плотность костной ткани (BMD), фракция объема костной ткани (BV/TV), трабекулярная толщина (Tb.Th.), трабекулярное число (Tb.N.), трабекулярное разделение (Tb.Sp.) и толщина коры кости (Ct.Th.). Бары ошибок представляют среднее ± SD, n-4, P<0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Гистоморфология бедренной кости от WT и Stat3Ctsk мышей выставлены через Окрашивание НЗЕ. М-образная пунктирная кривая указывает на слой хряща. Относительное высокое силовое поле корковой кости обучено пунктирными линиями и выставлено ниже. Относительное высокое силовое поле трабекулярной кости обведено пунктирными линиями и выставлено внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Остеокластогенез в бедренной кости мышей, представленных через TRAP окрашивания. (A)TRAP окрашивание бедренной кости от 8-недельных WT и Stat3Ctsk мышей. TRAP- многоядерные остеокласты показаны черными треугольниками. Относительное высокое силовое поле остеокластов, обведенное пунктирными линиями, выставлено ниже, демонстрируя несколько ядер и огромный размер. (B)Подсчитаноколичество TRAP и мультинуклеатных остеокластов. Бары ошибок представляют среднее ± SD, n'5, P<0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Остеогенез в бедренной кости мышей, представленных через кальцеин и ализарин красная двойная маркировка. (A) Семинедельные мыши последовательно вводили кальциин на 0-й день, с ализарин красным на 4-й день, а затем пожертвовал на 7-й день. Область между кальциеном (зеленым) и ализариновым красным (красным) линиями флуоресценции представляет собой недавно сформированную корковую кость в течение четырех дней. (B) Скорость минерального аппозиции (MAR) и скорость формирования костей (BFR/BS), рассчитанная на расстоянии двух линий, представляют остеогенную активность корковой кости. (C)Область между кальциеном (зеленым) и ализарин красными (красными) линиями флуоресценции представляют собой новообразованную трабекулярную кость за четыре дня. (D) MAR и BFR/BS представляют остеогенную активность трабекулярной кости. Бары ошибок представляют среднее ± SD, n'5, P<0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизма и фармацевтического лечения болезни человека13. Мышей Ctsk-Cre широко используются для функциональных исследований остеокластов6. В настоящем исследовании описаны протоколы методов анализа скелетного фенотипа и изучения критических генов, контролирующих активность остеокласта в виво.

Гистологический анализ является лучшим интуитивным методом для обнаружения метаболизма костей. А качество парафиновых секций является основой гистологического анализа. Достаточно времени для полной фиксации и декалькации костной ткани крайне важно, так как костные ткани могут быть фрагментированы. Исследователи упором на бедренной кости и голени должны поместить бедренной кости и голени на 90 "угол в встраивании шаг. Для проведения надежного и качественного гистологического анализа мы выбрали секции сагиттаального парафина, в которых слой хряща был симметричным, и показали четкую М-образную линию в окрашивание НЗЕ, которая представляет собой подходящий угол и глубину этих непрерывных секций. С другой стороны, если вам нужно наблюдать коленных суставов и прилегающих суставных связок, бедренной кости и голени должны быть помещены под углом 120 ".

TRAP служил в течение десятилетий в качестве биохимического маркера для остеокластнойфункции 14, так как это преимущественно выражается востеокластов 15,16. Два субстрата обычно используются для оценки кислотной активности фосфатазы. Фосфат Naphthol-ASBI (N-ASBI-P) является отличным субстратом для остеокласт-специфической TRAP isoform 5b. Тем не менее, пара-нитрофенил фосфат (pNPP) также может быть гидролизован нетип 5 TRAPs17. Таким образом, нафтал-ASBI фосфорной кислотно-парарозанилин метод гистохимической демонстрации TRAP является весьма специфическимв тканях разделов 17,18,19. Макрофаг фосфатазы (кислотная фосфатаза) имеет рН оптимальный 5,0-6,0, при котором он в основном тартрат устойчивы20. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы в протоколе TRAP окрашивания анализа, секции тканей, повторно окрашенные гематоксилином, не были размазаражены соляной кислотой. Важно отметить, что, хотя остеобласты и остеоциты вблизи костнойремоделирования областях также выразить TRAP 21, только огромные TRAP-положительные клетки с более чем тремя ядрами были рассмотрены в качестве остеокластов. В этом исследовании, Stat3Ctsk мышей показали ингибируется остеокластной активности(рисунок 4).

Кальцеин является флуорохром (зеленая флуоресценция), который широко используется для обозначения роста скелета во время кальцификации. Он может связываться с кальцием и быть включены в недавно сформированные кристаллы карбонатакальция 22. Аналогичным образом, кальциин, ализарин красный (красная флуоресценция), и тетрациклин (желтая флуоресценция) были встроены в кости для оценкироста с времени воздействия 23,24. Многие исследования в прошлом использовали одиночные флуорохромы (обычно кальцеин) для обозначения кости, но наблюдатели могут быть легко путать между вновь образованной кости и старой кости, особенно в нерегулярных трабекулярной кости. Поэтому мы предлагаем исследователям вводить в мышей два различных типа фторхромов, чтобы отличить более новую кость от старой. Согласно нашим тестам, кальцин в сочетании с ализарином может достичь наиболее достаточного и прочного контраста. В этом исследовании, кальцеин-ализарин красная маркировка была использована для обнаружения остеогенной скорости костной ткани и оказалось, что остеобласт активность не влияет на Stat3Ctsk мышей (рисунок 5).

Короче говоря, чтобы понять критические гены, контролирующие активность остеокласта, этот протокол описывает канонический метод генерации трансгенной модели мыши. Этот протокол также описывает некоторые типичные методы для анализа скелетного фенотипа. В этом исследовании, удаление STAT3 нарушения формирования остеокласта и увеличение костной массы. Эти методы могут быть интересны для тех, кто является новым для исследования скелетных тканей. Тем не менее, больше характеристик скелетной системы обеспокоены для дальнейшего изучения, таких как механическое свойство25. И мы всегда должны следить за развитием новых методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим профессора Вайгуо Цзоу и С. Като за реагенты и мышей, а также сотрудников лаборатории Цзоу за полезные дискуссии. Мы также благодарим Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы за помощь. Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайская встреча на высшем уровне - Плато Дисциплины, ФОНД SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования команды высокого уровня инноваций для Школы медицины Шанхайского университета Цзяо Тонг , Междисциплинарный исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Шанхайская школа медицины университета ЦзяоТанг (JYJC201902). И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай "Восходящие звезды медицинского таланта" Программа развития молодежи и "Чэнь Син" проекта из Шанхайского университета Цзяотун.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde solution Sangon biotech Co., Ltd. E672002
Acetone Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 80000360
Alizarin Sigma-Aldrich A5533
Ammonia solution Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Ctsk-Cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA Electron Microscopy Sciences 13710
DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 60-00-4
EMBED 812 RESIN Electron Microscopy Sciences 14900
fluorescence microscope Olympus IX73
Hematoxylin solution Beyotime Biotechanology C0107
Micro-CT Scanco Medical AG μCT 80
NaHCO3 Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 10018918
Neutral balsam Sangon biotech Co., Ltd. E675007
NMA Electron Microscopy Sciences 19000
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
rotary microtome Leica RM2265
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
xylene Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  4. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
  5. Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
  6. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  7. Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
  8. Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
  9. Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
  10. Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
  11. Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
  12. Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
  13. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
  14. Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
  15. Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
  16. Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
  17. Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
  18. Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
  19. Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
  20. Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
  21. Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
  22. Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
  23. Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
  24. Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
  25. Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).

Tags

Биология выпуск 161 скелетный фенотип метаболизм костей маркировка остеокласты STAT3 трансгенные мыши
Скелетный фенотип анализ условной <em>модели удаления Stat3</em> мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong,… More

Yang, Y., Chen, Q., Zhou, S., Gong, X., Xu, H., Hong, Y., Dai, Q., Jiang, L. Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model. J. Vis. Exp. (161), e61390, doi:10.3791/61390 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter