Summary
在中子捕获治疗（BNCT）中使用的中子混合束激活的辐射诱导DNA损伤反应尚未完全确定。该协议提供了一个分步程序，通过使用中子混合束照射后，通过人体结肠癌细胞系中的免疫荧光染色来检测修复蛋白质的辐射诱导 foci （RIF）。
Abstract
手稿的目的是提供一个逐步的协议，用于执行免疫荧光显微镜，以研究中子-伽马混合束在波龙中子捕获疗法（BNCT）中使用的辐射诱导DNA损伤反应。具体来说，建议的方法用于检测修复蛋白活化，可以使用DNA双链断裂（DNA-DSB）特有的抗体，将修复蛋白活化结果可视化为活体。在与中子混合束照射后，通过结肠癌细胞（HCT-116）的免疫荧光评估DNA修复源。DNA-DSB 是最基因毒性病变，在哺乳动物细胞中通过两种主要途径进行修复：非同源端连接通路 （NHEJ） 和同源重组修复 （HRR）。53BP1 与 DNA-DSB 编号相关，是放射生物学中常用标记物（如 +-H2AX）常用的，其免疫化学染色频率被认为是监测DNA-DSB诱导和修复的高效敏感标记。确定 +-H2AX foci 吸引修复蛋白，导致 DSB 附近的修复因子浓度更高。为了监测细胞水平的DNA损伤，计划对来自NHEJ通路和RAD52的DNA-PKcs代表性修复蛋白来源的存在进行免疫荧光分析。我们开发并引入了可靠的免疫荧光染色方案，用于检测辐射诱发的DNA损伤反应，其抗体具有NHEJ和HRR通路修复因子的特异性，并观察到辐射诱导的致病（RIF）。该方法可用于研究中子混合束辐射时高度激活的修复蛋白，从而表明修复途径的主导地位。
Introduction
在中子捕获治疗（BNCT）中使用的中子混合束激活的辐射诱导DNA损伤反应尚未完全确定。该协议提供了一个分步程序，通过免疫荧光染色（例如，在与中子混合束照射后在人类结肠癌细胞系中）检测修复蛋白的辐射诱导 foci （RIF）。
电离辐射（IR）诱发多种不同类型的DNA损伤（DNA-DSB，DNA-SSB，DNA碱损伤），其中DNA双链断裂是最基因毒性的DNA病变1。未修复的断点可导致细胞死亡，而失修的断发则增加了染色体重新排列、变异和失去决定性遗传信息的概率。对 DSB 作出反应的损伤响应途径包括DNA修复途径，如非同源端连接（NHEJ），一种需要Ku 70/80、DNA+PKcs、Xrcc4和DNA连结酶IV作为关键因子,,2、3、4、5、635的机制6。24在哺乳动物中，第二个主要DNA修复途径是同源重组修复（HRR）通路，需要关键成分——Rad52 epistasis基因家族——Rad51、Rad52、Rad54、Rad55、Rad57和Rad587。Rad51 和 Rad54 是与真核生物复制应力和 DNA 断裂相关的修复机制中涉及的关键人类重组因素。有趣的是，观察到HRR通路的降低调节增强了NHEJ通路，它容易出现错误，指向与基因组稳定性相关的HR通路8。
DSB形成的第一步是α-H2AX组蛋白的磷酸化在Ser-139由阿塔夏泰朗吉西亚突变激酶（ATM）从PI3激酶家族7,7，8。有趣的是，H2AX磷酸化可以通过免疫荧光技术很容易地可视化为foci（+-H2AX foci），使用特异性磷酸化H2AX6抗体。DSB 的数量和 +-H2AX foci 之间有 1：1 的关系，因此，DSB 标记 α-H2AX 通过对 foci 形成、大小和数量 6、7、8、9、10、116,7,8,9,10的特性进行了广泛的研究。α-H2AX foci的形成导致DNA损伤反应（DDR）蛋白和染色质改变因子的招募和积累，例如53BP1（p53结合蛋白1）、MDC1（DNA损伤检查点的中介）、BRCA1、Mre11/Rad50/Nbs1、PARP-1和许多其他修复因子，从而形成辐射诱导的 foci（RIF）。所有这些蛋白质通过直接或间接结合1、11、12与+-H2AX,11共同结合。
通过适当的敏感测试来检测DNA损伤和修复是十分重要的，因此，要更加重视高精确技术的发展。在DNA损伤和修复研究的背景下，该方法对于基因组DNA损伤的敏感检测、损伤类别描述以及DNA损伤和修复机制的量化至关重要。为了检测DNA受损的单细胞，彗星测定在放射生物学研究中是常用的。其他可用的细胞遗传学方法可识别染色体畸变，包括二心、易位、中心片段、环和色度型畸变，以及微核染色体损伤 （Mn）。放射生物学中最常用的方法是多中心染色体测定，因为它对辐射的特异性很高。例如，PCR，一种经典的分子方法，无法识别检测到的DNA损伤的类型。在这种情况下，免疫测量方法通过敏感性水平，因为反应是特异性的抗原和抗体之间。免疫荧光成像为不同蛋白质在不同叶层的出现提供了视觉证据，以响应DNA损伤剂，如电离辐射16。然而，通过实时PCR很容易检测到损伤和修复蛋白mRNA水平的激活水平，这是DNA损伤反应17背景下进一步分子研究的正确定量方法。
考虑到 +-H2AX foci 吸引修复因子 18，以监测细胞水平的 DNA 损伤和修复，我们根据对 NHEJ 通路 （DNA-PKcs） 和 HRR 通路 Rad52 代表性修复蛋白 foci 的分析，开发出可靠的免疫荧光染色程序。
在这里，我们建议使用这些蛋白质的免疫检测作为监测DNA-DSB诱导和修复的高效和敏感的程序。到目前为止，除了+-H2AX和53BP1标记19外，还没有关于DNA-DSB的数据，这些数据基于BNCT中子混合束照射后细胞水平上修复蛋白的临界。我们建议对HCT-116结肠癌细胞系进行适应，因为它本身富含DSB foci，作为DNA损伤分析的标准细胞系，因为RIF很容易检测。这种粘附细胞系易于维护，适合辐照程序。建议的程序基于大量与+-H2AX染色的一般免疫荧光程序相关的先前研究。然而，它包括有关选择适当的抗体与测试稀释每个代表性蛋白质属于每个修复路径的所有细节。此外，它描述了BNCT治疗中独特的中子混合光束的利用。然而，我们建议扩大研究与这两种方法，免疫荧光染色第一，然后，与高成本分子分析之前执行4,4，17。
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Protocol
1. 细胞培养和实验的制备
- 维护人类结肠癌细胞，HCT-116，根据供应商的建议，在75厘米2培养瓶的单层含有10 mL的配制麦考伊的5a中法化，辅以10%的胎儿牛血清和1%的抗生素抗霉菌溶液。
- 在37°C的加湿5%CO2环境中生长细胞，直到每2至3天进行一次中基更新的70%的汇合。
- 获得BNCT光束（例如中子束加10BPA）和BNCT效应，将癌细胞作为重粒子杀死，并在辐射前一天将大部分能量沉积在含蛋白质的癌细胞中， 在细胞培养基中加入 Boron 输送剂 – 例如，10BPA、4-Borono-L-phenylalanine （10 μg 10B/mL， 0.925 mM 最终） 12~16 h（最大吸收量）在辐照之前，如先前研究的结肠癌细胞和甲状腺癌细胞20，21。
注：如果使用另一个细胞系，在BNCT研究中不存在数据，则测试每个细胞系的细胞吸收，以获得最佳的 boron 浓度。通过采用电感耦合等离子光学发射光谱（ICP-OES）测量10个BPA细胞吸收量，由Dagrosa组21执行。 - 12-16小时 Boron 输送后，吸气介质，用 10 mL 的 1x PBS 清洗细胞。然后通过向细胞中加入2 mL的 Trypsin-EDTA 溶液，在37°C下孵育5分钟，增强细胞分离，从而对细胞进行多解。当细胞开始分离时，通过添加 10 mL 的完整介质来停止尝试素操作。
- 在 15 mL 管中吸升细胞悬浮液，并使用自动细胞计数器计算细胞，将 10 μL 的 0.4% trypan 蓝色添加到 10 μL 的细胞，在计数幻灯片上混合并等分 10 μL。将细胞悬浮液稀释至介质的1 x 106 6细胞/mL浓度。每个冷冻管的细胞悬浮液的等分 1 mL。
- 准备热致发光剂量计（TLD），用于测量中子流感的伽马射线剂量和金箔，并在照射前将TLD附着在冷冻管或细胞培养瓶上。
- 在培养瓶或冷冻管中，用推荐的最小热中子通量 5.9 x 1011 （n/cm-2 min+1）4照射 1 x 106 6细胞/mL。
注：设置辐照时间之前，以获得推荐的中子通量。 - 辐照后，在 35 mm Petri 盘或 6 个孔盘中的 22 x 22 mm 盖玻片上播种 1 mL 辐照细胞（1 x10 6细胞/mL），辅以 2 mL 所需的介质。在加湿的 5% CO 2 环境中，在 37 °C 下孵育细胞最多3 小时，让它们附着在盖玻片上。在倒置显微镜下，以 20 倍的客观性不时观察细胞的附着。
注：对于HCT-116细胞，最小密度为600，000个细胞种子。为了快速进一步染色过程，使用腔室幻灯片，相应地降低细胞密度。
2. 细胞固定
- 在细胞的照射和孵育后，从附着的细胞中去除介质，用2.5 mL的PBS清洗细胞一次。
- 用 1 mL 的 70% 乙醇修复细胞， 在 RT 下 10 分钟。
注：或者使用1%-3.7%的甲状甲醛（PFA）进行固定，如先前建议的19。此处暂停协议。将固定细胞存放在乙醇中，温度为-20°C，不超过数周，用于进一步分析和免疫荧光染色。
3. 细胞的渗透化
- 固定后，从培养皿中去除乙醇，用 2.5 mL 的 1x PBS 进行洗涤。
注：不要让细胞在冲洗步骤之间干燥。 - 轻轻加入 1 mL 的 0.2% 的 Triton X-100/PBS，用培养皿中的细胞覆盖盖玻片。
- 在 Rt 孵育 5 分钟。
- 用 2.5 mL 的 1x PBS 清洗细胞 3 倍。
注：如果需要，将 PBS 中的 Triton X-100 的百分比提高至 0.5%（更多可检测的 foci，取决于测试的细胞系）。使用 PBST（PBS，带 0.5% Tween）执行额外的洗涤，以避免不特异性结合。 - 块渗透步骤与1 mL的2%BSA（牛血清分数V白蛋白）稀释在PBS和孵育至少30分钟或1小时与1%BSA。
注：此步骤可以省略，取决于使用的抗体类型。或者，使用参考文献4中建议的 5% FBS 。
4. 免疫荧光染色
- 按照推荐的建议，在PBS中加入适当数量的原抗体（抗ɣ-H2AX、抗DNA-PKcs和抗Rad52）稀释（2%牛血清分数V白蛋白）（参见表1，建议稀释）（每个样品需要100μL）。
| 原抗体 | 功能 | 推荐稀释 | 存储 [C] |
| 防ɣ-H2AX | DNA-DSB 的检测 | 1：1000 （PBS-BSA） | 4 |
| 抗DNA-PKcs | 检测属于 NHEJ 的 DNA-PKcs 蛋白的 RIF | 1：200 （PBS-BSA） | -20 |
| 防拉德52 | 检测属于HRR的Rad52蛋白的RIF | 1：200 （PBS-BSA） | -20 |
| 二次抗体 | 不知情 | ||
| 防老鼠 Igg Fitc | ɣ-H2AX foci | 1：400 （PBS-BSA） | 4 |
| 山羊防兔 IgG H&L （亚历克萨氟尔 488） | 用于 Nhej 和 Hrr 修复蛋白质 foci | 1：500 （PBS-BSA） | -20 |
表1：建议使用第4节中使用的抗体的稀释和说明。
- 用蒸馏水用保湿木质素覆盖Petri盘，以保持塑料盒中的湿度，并在孵化器37°C下孵育30分钟。
注意：可以在这里暂停协议。孵育可以在4°C下进行过夜。 - 孵育后，使用2.5 mL的PBS进行3次洗涤。
注：请勿在冲洗步骤期间让幻灯片干燥。 - 加入适当数量的二次抗体（抗小鼠IgG FITC，山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488）在PBS中用BSA稀释（见表1）（每个样品需要100μL）。为此，以下步骤在黑暗中工作。
- 再次盖住培养皿，用保湿木质素在塑料盒中保持湿度，并在培养箱中至少孵育30分钟，在37°C下。
- 孵育后，使用2.5 mL的PBS进行3次洗涤。
- 将 PBS 中稀释的 100 μL DAPI 加入到 1 μg/mL 的最终浓度中，以对抗核。
- 孵育不久，最多2分钟在RT。
- 孵育后，使用2.5 mL的PBS进行3次洗涤。
- 拆下 PBS，轻轻将盖玻片放在安装介质的顶部，避免形成气泡，并用指甲油密封盖玻片的边缘。等到清漆干燥并涂上盖玻片。
- 在荧光显微镜下进行图像分析之前，等待安装介质的硬化（长达 3 小时）。
注意：可以在这里暂停协议。在黑暗中将玻璃滑梯存放在 4 °C 的塑料盒中。
5. 图像采集和分析
- 使用荧光显微镜在 100 倍目标下使用浸入油获取图像。
- 使用荧光显微镜分析核中的 foci，该显微镜配备以下过滤器：Alexa Fluor 488：激发+发射 （nm）： 496/519，发射颜色为绿色;DAPI：激发+发射（nm）：358×461，发射颜色蓝色。
注：沿单粒子轨道分析 DSB 可能需要高级显微镜，如具有更高分辨率的共声激光扫描显微镜。
- 使用荧光显微镜分析核中的 foci，该显微镜配备以下过滤器：Alexa Fluor 488：激发+发射 （nm）： 496/519，发射颜色为绿色;DAPI：激发+发射（nm）：358×461，发射颜色蓝色。
- 使用适当的成像软件（如 ImageJ 或 Image Pro3、20）保存采集的图像和过程。
注：建议使用用于自动分析或开发/购买单个生物信息软件的单个宏和插件。 - 如果使用 Image-Pro 软件进行 foci 分析，在 TIFF 文件中处理图像：选择计数/大小按钮，然后单击"类型"[选择测量类型（例如，直径或面积）]，单击"范围"[设置测量范围]，必要时单击拆分对象。要调整亮度，请单击"亮"[调整保持]。然后单击计数Count [红色按钮]。
- 要导出数据，请单击数据表 |统计 |导出到 Excel。在电子表格软件中，使用所需的统计分析绘制图形。
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Representative Results
首先，我们分析了DNA-DSB、结肠癌细胞中的+H2AX foci、非辐射和中子混合束辐射的标准标记。+-H2AX foci 显示为不同的荧光点，并显示 DNA-DSB 的形成（因为每个 +-H2AX 荧光点表示单个 DSB）（参见图 1）。
图1：细胞系HCT-116（无辐射）和中子混合光束照射后结肠癌细胞中α-H2AX foci模式的代表性图像。中子混合束照射在前一天用双巴基（N+BPA）治疗的细胞中以2.6 Gy的剂量进行。（A） 左侧面板表示核的DAPI染色。右面板，绿色 foci （Alexa 488），对应于 +-H2AX 的免疫检测。黄色箭头表示穿过原子核的 α 粒子轨迹（比例杆 = 10 μm）。（B） 代表图，说明观察到的无线电诱导 foci 大小的增加。α-H2AX foci 直径的均值由 Image-Pro 软件自动执行。请单击此处查看此图的较大版本。
有趣的是，在中子混合束（N+BPA）的辐照细胞中，剂量约为2.6 Gy （1，33 Gy （+） = 1，26 Gy （N），我们观察到α-H2AX foci的直径水平较高（图1B）。此外，检测到一条高 LET α粒子的轨迹（由于BNCT核反应）穿过细胞核（黄色箭头）（图1A）。不同类型的辐射可能导致不同的影响：LET辐射越高，DNA-DSB越复杂，α-H2AX foci越高，作为辐射诱导的 foci18可见的修复蛋白区域水平越高。
因此，我们测试了DNA-PKcs（来自NHEJ修复通路）和Rad52（来自HR通路）的代表性修复蛋白水平，在相同的条件下，这是以前在BNCT光束的情况下没有执行过的。在与控制细胞（无辐射）进行比较后，我们能够在中子混合后检测DNA-PKcs在DNA断裂时叶径的高均值（见图2）。
图2：DNA-PKcs和Rad52修复细胞系HCT-116（无辐射）和中子混合束照射后结肠癌细胞模式的代表性图像。中子混合束照射在前一天用双巴基（N+BPA）治疗的细胞中以2.6 Gy的剂量进行。（A） 左侧面板表示核的DAPI染色。中间面板表示辐射引起的 foci 的检测。右面板是合并的图像。（B） 代表图，说明观察到的无线电诱导 foci 大小的增加。使用图像分析软件自动执行Rad52和DNA-PKcs foci直径的均值。请单击此处查看此图的较大版本。
在这种情况下，我们观察到中子混合束在辐照HCT-116细胞中聚类DNA-DSB，因为DNA-PKcs是特定于更复杂的 foci。在辐照细胞中，通过中子混合束，这些源只在细胞核内观察到更加复杂、更大、强度更高的聚类（图2A，B）。就Rad52而言，其效果没有DNA-PKcs那么强烈，它表明NHEJ通路在这类辐射中占主导地位。此外，根据文献资料，复杂的DSB被慢慢修复，DNA-PKcs只被招募到寿命较长的复杂DSB，这表明中子混合束导致复杂的DSB的形成，并通过DNA-PKcs修复，然而，需要更多的研究在分子水平，以确认这些以前获得的结果22。
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Discussion
α-H2AX和53BP1的源点、免疫化学染色频率常用于放射生物学，与DNA-DSB编号相关，被认为是监测DNA-DSB19诱导和修复的高效敏感标记。+-H2AX 和 53BP1 的共染色程序是检测 DNA-DSB 的标准程序。 α-H2AX foci 的形成与 53BP1 的招募有关，53BP1 是 DNA 损伤反应的调节器23。然而，不同的细胞系在 +-H2AX /53BP1 foci 11 的背景水平可能有所不同。已经证明，+-H2AX foci吸引修复因子18，积累更高的修复蛋白浓度接近DSB站点。DNA-DSB越复杂，+-H2AX foci越高，修复蛋白水平越高。它激活一系列修复路径，如果修复因子在 DSB 站点中以较高浓度积累，则使用特定抗体可轻松检测，并且建议的协议允许它们易于可视化。在这里，我们演示了一种方法，利用免疫荧光技术研究BNCT治疗细胞水平的生物效应，利用免疫荧光技术对人类结肠癌细胞的DNA修复的影响。作者开发并引入了具有特定抗体的分步可靠方案，用于检测基于免疫荧光染色的DNA修复通路，其抗体针对来自NHEJ和HRR通路修复因子的抗体，并观察到辐射诱导的源膜（RIF）。此外，作者建议使用HCT-116结肠癌细胞系作为DNA损伤分析的标准细胞系，以及用于DNA修复抗体测试的控制细胞系，因为该细胞系本身富含DSB foci。DNA-DSB是容易检测的，不同的细胞系，特别是癌细胞，如宫颈细胞系代表不同背景水平的H2AX foci，强度24。
协议有两个主要的关键步骤，细胞固定和免疫控制程序。作者建议将细胞固定在70%乙醇中，因为它能长期保存细胞，并在冷冻室中孵育不超过几个星期。此外，此步骤至关重要，因为这可能是照射程序执行后暂停点，例如，在另一个机构/建筑/另一天。另一个关键步骤是抗体的适当浓度。作者在表格中附上了经测试的初级抗体和二级抗体的浓度。
所提出的程序提供了一个逐步的协议，以获得可靠的结果，但是，一些参数可以改变实验的结果，如使用抗体的正确选择，用于固定和渗透步骤的不同试剂，孵育时间，试剂的关键百分比，洗涤步骤，在黑暗中工作，以及适当的荧光显微镜。作者解释如何在笔记中获得可靠和可重复的结果。
这种技术的一个小限制是获得像中子源这样的辐射源，但是，该协议可以用作检测不同类型辐射后获得的DNA修复通路一般协议，并可被视为各种辐射类型的通用协议，例如，比较低 LET 和高 LET 辐射修复通路。
我们提供一种通用的、随时可用的方法，可用于细胞水平，以分析BNCT治疗中的生物效应。在BNCT中，非放射性的 Boron-10（例如，使用4-Borono-L-phenylalanine，BPA + Boron输送剂处理后）被照射为低能热中子，由于核反应，α粒子和高L的锂-7核产生25，26。,26因此，我们的协议可用于分析细胞水平的生物效应，也可用于其他高让光束（如质子束治疗27中使用的质子）和在强子治疗28中使用的碳离子等代表的辐射。我们观察到，在高 LET 辐射和混合光束领域需要更详细的研究，并且需要了解 DNA 修复过程才能开发有效的抗癌疗法，因此，我们制定了一种方案，允许研究中子混合光束激活的辐射诱发 DNA 损伤反应。此外，检测DNA损伤反应和DNA修复的免疫荧光法可能是评估和检测肿瘤的潜在方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
由中子/伽马辐射组成的中子混合束从波兰国家核研究中心的玛丽亚研究反应堆进入。K.M.O.得到波兰国家科学中心（Miniatura 2）第#2018/02/X/NZ5/02849号赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
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