Summary
目前装载 96 孔板进行 DNA 提取的方法容易受到污染。我们详细介绍了一种装载96孔板的新方法,该方法可降低井中交叉污染的风险。我们的方法将帮助其他研究人员利用高通量DNA提取技术的效率,并最大限度地降低污染风险。
Abstract
高通量DNA测序技术极大地促进了我们对微生物群落之间的关系、宿主特性和更广泛的生态系统功能的理解。随着测序能力的广度和深度的迅速提高,人们以最高效率成功提取、放大、分析和解释环境DNA的方法。不幸的是,快速进行DNA提取可能会增加样品污染风险。特别是,与单管萃取相比,基于 96 井板中所含样品的高通量萃取提供了相对快速的方法,但也增加了井中交叉污染的机会。为了最大限度地降低样品交叉污染的风险,同时保留高通量萃取技术的好处,我们开发了一种将环境样品装入 96 孔板的新方法。我们使用可穿透的PCR密封膜覆盖每个板,同时加载样品,并首先将样品添加到PCR管,然后再将它们移动到井中;这些做法共同降低了样品漂移和意外双载井的风险。本文概述的方法为研究人员提供了一种方法,以最大限度地提高可用的高通量提取技术,同时降低96孔板固有的交叉污染风险。我们提供了如何从样品收集到DNA提取的详细分步概述,同时最大限度地降低不必要的交叉污染风险。
Introduction
微生物群落高通量测序的最新进展提供了无与伦比的测序深度,因此,对地球微生物群1的功能和多样性有着前所未有的一瞥。随着将越来越多的样品多能复用到单个测序通道上的能力增加,单管DNA提取有可能成为生成生态数据中速率限制的步骤。然而,高通量DNA提取中的新方法有望以比之前更高的效率处理大量环境样品。这些方法通常涉及使用96孔板而不是单管,从而增加可能同时发生的萃取量。因此,高通量萃取方法的实用性和效率明显,已用于处理从土壤3、4,和植物组织,3、5到人类粪便2等环境样品。4
虽然这些方法可以显著加快样品处理和DNA提取的速度,但将土壤和其他生态样品装入96孔板的初始步骤容易受到交叉样品污染。这种类型的井井污染可能发生在DNA提取6,7,8,,8和井特别脆弱,在这第一步样品悬浮在缓冲溶液之前。6,McPherson等人演示了一种使用漏斗和8孔PCR带盖将土壤装入96孔板的方法,但是,虽然它们的方法是一种更可控的装载板的方法,但它仍然为装载每个样品时邻近井的污染提供了充足的机会。此外,开放式井允许分心的研究人员将样品放入不正确的井中,或将样本添加到已加载的井中。此外,各种样品类型证明不适合用这种方法加载;由于静电,湿样品通常粘在漏斗和干样品之间"跳跃"。
为了在高通量DNA提取的第一步减少油井污染的机会,我们开发了一种将土壤样品装入96孔板的新方法。我们的方法既保护油井免受环境暴露,又可防止我们意外地将多个样品装进一个油井(双装)。我们相信,下面报告的方法有望减少污染的可能性,因此提供了一种更可控的方法,用于加载96孔板,以便随后提取DNA。
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Protocol
1. 用于装载 96 井板的实验室台和工具准备
- 用 70% 乙醇雾化工作,清除台面。在用 10% 漂白剂喷洒工作台顶之前,请擦拭并让空气干燥。擦干工作台顶。
- 通过浸入95%乙醇,然后暴露在火焰中,对微铲、铲子和手术剪刀(弯曲)进行灭菌。将每个浸在 10% 漂白剂中,并在使用前晾干。
注:每个样品之间应对工具进行灭菌。
2. 子取样和样品制备
- 在亚采样前使用乙醇消毒手套。
- 在亚采样之前,将土壤样品完全均质化。
- 使用灭菌工具,将标有 2 mL 的离心管与样品一起装载,直到大约半满。
- 重复步骤 2.2,直到所有 95 个样品都已分采样到标签的 2 mL 离心管中。第 96井 应用作提取空白。
注:步骤 2.3 和 2.4 用于最小化所需的存储空间,并防止过度采样或双采样。 - 将 2 mL 亚样品管存放在冰上,直到装入板。
- 标签 96 无菌 200 μL 平盖 PCR 管 A1\u2012A12, B1\u2012B12,......H1\u2012H12.将这些管子放入 96 井机架中。
- 分配具有井位置(A1\u2012H12)的样品 ID 并记录它。
3. 板准备
- 从 96 孔板(图1A+1C)中拆下橡胶盖并将其放入无菌塑料袋中( 参见材料表)。密封塑料袋以防止污染。
- 用密封膜盖住96井板(图1D+1E);例如,使用预切割的可穿孔密封膜(参见 材料表)。使用橡胶辊滚动,确保密封。
注:可穿孔硅胶垫可能提供可重复使用的选择,在用途之间提供适当的清洁,但我们测试的硅胶垫很容易沿穿孔分离,不会提供平等保护,以任何以下板。 - 将板放在冰箱 (4 °C) 中以保持凉爽。
4. 子样本的转移
注:当土壤样本非常小时,请参阅步骤 4.13 进行修改。
- 将 2 mL 子样本中的 24 个放入冰块中进行冷库。
- 使用样品名称和井位表选择正确的 200 μL 平盖 PCR 管。
- 采取2 mL子样品管和涡流为+5s,以确保均质化。
- 使用火焰和漂白剂消毒工具将第一个样品的 ±200 μL 负载到正确的平盖 PCR 管中(图 1F)。
- 重复步骤 4.2\u20124.4,直到加载所有 24 个样本。然后转到步骤 4.6。
- 使用漂白浸纸擦拭,清洁 200 μL 平盖 PCR 管的外盖。
- 反转管子,轻按工作台,将样品移动到管的顶部。使用漂白和火焰消毒剪刀,夹住 PCR 管的底部,为样品进入 96 孔板(图1G) 创建开口。
- 在 96 井板上找到正确的井,并通过管穿过板,切割端朝上,直到到达该井。稍微倾斜板,以方便刺穿预切割的可刺穿密封膜,只有当管正上方正确的井小心倒合,使切割尖端适合井。使用灭菌工具,轻拍 PCR 管的顶部,直到所有土壤从管中掉入井中。将管子盖紧放在井内(图1H+1J)。
- 一次拆下一个平顶 200 μL PCR 管,并将 750 μL 的珠子溶液添加到该井中(图 1K)。将 200 μL 平盖 PCR 管一直推入井中,并用锐利标记顶部,以指示该井已装好。对每个样本重复此项。
- 加载所有 24 个样品并添加珠子溶液后,拆下 2 mL 子样品管,然后更换为 24 个未采样管。
- 重复步骤 4.1\u20124.10,直到所有 95 孔都装有样品或空白和珠子溶液。拆下管子,而不将其穿过打开的井(图1L)。
- 小心地拆下可刺穿的薄膜并更换橡胶盖以保护板,直到开始提取(图 1M=1O)。
- 对于非常少量的同样细粒度的土壤,在样品管中加入 750 μL 的珠溶液,并使用宽孔移液器尖端将所有内容物转移到适当的孔中。将 PCR 管放入开口,以防止双重加载。
注:在实施这种修改时要小心,因为颗粒有机物或大于移液器尖端孔的小岩石碎片会堵塞移液器,使样品浆料的转移变得困难。 - 根据需要在-20°C下冷冻,并储存装有样品和珠子溶液的板,直到计划提取。
5. 板载方法比较
注:为了验证我们装载96孔DNA提取板的新方法,我们将单个96孔板分为三个部分。我们使用三种不同的板加载方法比较土壤意外装载和交叉污染的可能性。我们使用的三种方法是麦克弗森等人9中概述的方法、Qiagen的默认加载协议10,以及本出版物中概述的协议。
- 将土壤加载到板中
- 将 96 井板分成三个四柱块。使用上述三种方法之一加载每个块。
- 将土壤装载到其他井中,使样品和空白井交错。这种安排允许最大限度地利用意外样品装载和交叉污染的机会。
- 将96井板冷冻在-20°C,直到DNA提取。
- DNA提取
- 根据制造商的96井板提取协议10提取DNA。
- 将DNA提取物储存在-20°C,直到进一步分析。
- 空白井中DNA的定量
- 在室温下解冻DNA提取物,涡流,并使用板微调器向下旋转。
- 使用分光光度计测量和记录空白井的DNA浓度。
- 使用 ANVOA 和 Tukey 的后期测试来分析空白井中平均 DNA 浓度的差异。
注:在 ± = 0.05 中报告了显著差异。
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Representative Results
这种新方法成功地用于装载96孔DNA提取板。对板载荷方法的比较表明,该方法在空白井中DNA浓度最低。空白井中的DNA浓度明显低于我提出的McPherson 等人9(p<0.05)的方法,尽管我们方法中的DNA浓度与Qiagen默认方法(图2)没有统计学上的不同。所有三种方法产生的DNA均在2纳克/μL以下,尽管只有我们新方法生产出没有可测量DNA浓度的井。
图1:逐步将样品装入96孔板进行DNA提取的方法,同时最大限度地减少井中交叉污染的可能性。深灰色盖(在步骤 A、B、N 和 O 中显示)表示提取套件附带的硅盖。浅灰色盖(在步骤 D 中应用,在步骤 L 之后拆下)表示用于在装载时盖住板的可穿透 PCR 胶带。虽然没有图,但工具应在加载每个样品之前进行消毒,在刺穿 PCR 胶带之前,应用漂白剂擦拭 PCR 管。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:空白井的DNA浓度。DNA浓度以ng/μL表示。字母表示DNA浓度在±0.05时存在显著对比。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这种方法减少了在装载高通量样品提取板时实现井对井交叉污染的机会,并提供了一种更可控的方法,可以装载超过现有板装量策略9、10的96,孔板。在96孔板提取中,井间污染比单管萃取更普遍,尤其是在自动6、7,7时,尽管没有在任何方法中进行过专门测试,但当提取板的油井在板装过程中保持打开状态时,交叉污染的风险可能最高。与单管萃取相比,在基于板的萃取中,交叉污染的机会增加,使用无菌盖保护油井应被视为将样品装入 96 孔板的关键第一步。尽管有这种需要,高通量萃取套件中提供的说明只是说要装载板并"避免样品井之间的交叉污染",但没有提供任何额外的信息,说明如何做到这一点10。为了减少污染,同时将样品添加到96井的提取板中,McPherson等人建议用PCR密封胶带的切割条盖住该板,剥皮,然后进入每口井。此方法减少了所有油井打开的总时间,但油井的开孔时间不相等,并且一些最容易受到污染的油井(那些最接近装载的样品的油井)在装载过程中暴露。此外,PCR密封胶带的剥离有可能产生静电,导致土壤从井转移到井中,并可能导致我们提取中观察到的空白井中的DNA浓度较高。此外,这种方法要求在将样品放入选择井之前将样品通过未覆盖的油井,并且没有什么能阻止研究人员意外将两个样品装入一口井(双载)或混合两个或多个样品的位置。如果捕获,双重加载只是浪费资源。但是,如果样品位置的双重加载或混合被忽视,实验结果可能会失真7。
我们上面概述的方法提供了一种控制方法,用于加载高通量DNA提取板。具体来说,我们的方法通过时刻保护油井来降低交叉污染的风险。油井最初用密封胶带覆盖,然后由用于样品装载的PCR管覆盖。此方法不仅可降低交叉污染的风险,而且可完全防止将两个样品装入一个井的风险。一旦我们将样品装入井中,PCR 管就充当块,防止添加另一个样品。通过标记所有管板位置(例如,A1,A2...H11,H12)在装载样品之前,此方法还提供最终检查,以确保所有样品已加载,没有遗漏任何孔。虽然这种方法提供了一种更可控的装井方法,但装载板的任何人在通过切割 PCR 管时应格外小心。即使油井是密封的,当技师刺穿薄膜将正确的样品装入这些孔时,任何落到密封板表面的样品颗粒都可能进入意外的孔中。为了避免此问题,在使用 PCR 管刺穿密封胶带之前,我们将 96 井板倾斜至 [40°] 。这种方法有助于保持管的开端直立,远离不正确的井。
当土壤样品数量非常少和/或粒度极细时,使用宽孔移液器尖端而不是将土壤样品装入PCR管中,对于转移每个样品可能更有效。对于此修改,应将第一个缓冲液添加到样品管中,然后将样品和溶液都管线入 96 井板中。在此步骤之后,将 PCR 管添加到每个井中,可防止双重加载。如协议部分所述,在使用这种修改时,研究人员或技术人员应非常清楚颗粒有机物或小岩石碎片,因为这些碎片有可能堵塞移液器的孔。
虽然没有一种样品加载方法可以完全消除样品污染的风险,但我们上面概述的方法提供了一种方法,可以大幅降低这些风险,并完全消除样品位置的双重装载和混合风险。总的来说,我们认为这种方法是对现有加载高通量DNA提取板的技术的一次大改进,并建议所有使用高通量提取板的微生物学家都采用上述方法。
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Disclosures
提交人报告没有利益冲突,也没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了微生物生态合作组织的支持,NSF奖资助#EPS-1655726。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
References
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