Summary
Los métodos actuales para la carga de placas de 96 pozos para extracciones de ADN pueden ser propensos a la contaminación. Detallamos un nuevo método para cargar placas de 96 pozos que reduce el riesgo de contaminación cruzada entre pozos. Nuestro método ayudará a otros investigadores a capitalizar la eficiencia de las técnicas de extracción de ADN de alto rendimiento y minimizar el riesgo de contaminación.
Abstract
Las técnicas de secuenciación de ADN de alto rendimiento han contribuido sustancialmente a los avances en nuestra comprensión de las relaciones entre las comunidades microbianas, las características del huésped y las funciones más amplias del ecosistema. Con este rápido aumento en la amplitud y profundidad de las capacidades de secuenciación han llegado métodos para extraer, amplificar, analizar e interpretar el ADN ambiental con éxito con la máxima eficiencia. Desafortunadamente, realizar extracciones de ADN rápidamente puede venir a costa de aumentar el riesgo de contaminación entre las muestras. En particular, las extracciones de alto rendimiento que se basan en muestras contenidas en una placa de 96 pozos ofrecen un método relativamente rápido, en comparación con las extracciones de un solo tubo, pero también aumentan las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo. Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre muestras, conservando al mismo tiempo los beneficios de las técnicas de extracción de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo método para cargar muestras ambientales en placas de 96 pozos. Usamos películas de sellado de PCR perforables para cubrir cada placa mientras cargamos muestras y agregamos muestras primero a los tubos de PCR antes de moverlas a pozos; juntos, estas prácticas reducen el riesgo de deriva de la muestra y la doble carga no intencionada de pozos. El método descrito en este artículo proporciona a los investigadores un enfoque para maximizar las técnicas de extracción de alto rendimiento disponibles y, al mismo tiempo, reducir el riesgo de contaminación cruzada inherente a las placas de 96 pozos. Proporcionamos un esquema detallado paso a paso de cómo pasar de la recolección de muestras a la extracción de ADN, minimizando al mismo tiempo el riesgo de contaminación cruzada no deseada.
Introduction
Los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de las comunidades microbianas están proporcionando una profundidad de secuenciación sin precedentes y, en consecuencia, una visión poco preciada del funcionamiento y la diversidad del microbioma de la Tierra1. A medida que aumenta la capacidad de multiplexar más y más muestras en un solo carril de secuenciación, la extracción de ADN de un solo tubo tiene el potencial de convertirse en un paso de limitación de velocidad en la generación de datos ecológicos. Sin embargo, los nuevos métodos en extracciones de ADN de alto rendimiento prometen el procesamiento de grandes cantidades de muestras ambientales con mayor eficiencia de la que ha sido posibleanteriormente 2. Estos métodos a menudo implican el uso de placas de 96 pozos en lugar de tubos individuales, aumentando así el número posible de extracciones que pueden ocurrir simultáneamente. Como tal, la practicidad y eficiencia de los métodos de extracción de alto rendimiento son evidentes y se han implementado para el procesamiento de muestras ambientales que van desde el suelo3,4 y los tejidos vegetales3,5 a la materia fecal humana2.
Si bien estos métodos pueden acelerar drásticamente el procesamiento de muestras y la extracción de ADN, el paso inicial de cargar el suelo y otras muestras ecológicas en placas de 96 pozos es susceptible a la contaminación de la muestra cruzada. Este tipo de contaminación a pozo puede ocurrir durante las extracciones de ADN6,7,8, y los pozos son particularmente vulnerables en este primer paso antes de que las muestras se suspenden en una solución tampón. 9 demuestran un9 método para cargar suelos de rizosfera en placas de 96 pozos utilizando embudos y cubiertas de tiras de PCR de 8 pozos, pero si bien su método es un enfoque más controlado para las placas de carga, todavía proporciona una amplia oportunidad para la contaminación de los pozos vecinos al cargar cada muestra. Además, los pozos abiertos permiten la posibilidad de que un investigador distraído coloque una muestra en el pozo incorrecto o agregue una muestra a un pozo que ya se ha cargado. Además, una variedad de tipos de muestras resultan ser poco adecuadas para la carga con este método; las muestras húmedas a menudo se pegan a los embudos y las muestras secas "saltan" entre los pozos debido a la electricidad estática.
Para reducir las oportunidades de contaminación entre pozos en el primer paso de las extracciones de ADN de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo enfoque para cargar muestras de suelo en placas de 96 pozos. Nuestros métodos protegen los pozos de la exposición ambiental y nos impiden cargar accidentalmente varias muestras en un pozo (doble carga). Creemos que el método reportado a continuación ofrece la promesa de reducir el potencial de contaminación y como tal proporciona un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos para la extracción posterior del ADN.
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Protocol
1. Banco de laboratorio y preparación de herramientas para cargar una placa de 96 pozos
- Despeje la parte superior del banco al nebar la niebla con el 70% de etanol. Limpie y deje secar al aire antes de rociar la parte superior del banco con 10% de lejía. Limpie la parte superior del banco.
- Esterilice la micro-scoopula, la espátula y las tijeras quirúrgicas (curvadas) sumergiéndose en etanol al 95% y luego exponga a una llama. Sumerja cada uno en 10% de lejía y deje secar al aire antes de usarlo.
NOTA: Las herramientas deben esterilizarse entre cada muestra.
2. Submuestreo y preparación de muestras
- Esterilice los guantes con etanol antes del submuestreo.
- Homogeneizar las muestras de suelo a fondo antes de la submuestreo.
- Con herramientas esterilizadas, cargue un tubo centrífugo de 2 ml etiquetado con la muestra hasta aproximadamente la mitad de lleno.
- Repita el paso 2.2 hasta que las 95 muestras hayan sido submuestradas en tubos centrífugos de 2 ml etiquetados. Elpozo 96 debe utilizarse como una extracción en blanco.
NOTA: Los pasos 2.3 y 2.4 se realizan para minimizar el espacio de almacenamiento necesario y evitar el muestreo excesivo o doble. - Almacene tubos de submuestra de 2 ml sobre hielo hasta que se cargue la placa.
- Etiqueta 96 tubos de PCR estériles de 200 l de tapa plana A1-u2012A12, B1-u2012B12, .... H1-u2012H12. Coloque estos tubos en orden en un bastidor de 96 pozos.
- Asigne un identificador de muestra con una ubicación de pozo (A1-u2012H12) y regístrelo.
3. Preparación de placas
- Retire la cubierta de goma de la placa de 96 pozos (Figura 1A–1C) y colóquela en una bolsa de plástico estéril (ver Tabla de materiales). Selle la bolsa de plástico para evitar la contaminación.
- Cubra la placa de 96 pozos con película de sellado (Figura 1D–1E); por ejemplo, utilice una película de sellado perforable precortado (véase la Tabla de materiales). Asegurar el sello rodando con un rodillo de goma.
NOTA: Las alfombrillas de silicona perforables podrían ofrecer potencialmente una opción reutilizable, proporcionando una limpieza adecuada entre los usos, pero las esteras de silicona que probamos se dividen fácilmente a lo largo de las perforaciones y no ofrecerían la misma protección a las siguientes placas. - Coloque la placa en el frigorífico (4oC) para mantener la mente fresca.
4. Transferencia de subsesc muestras
NOTA: Consulte el paso 4.13 para ver las modificaciones cuando la muestra de suelo es muy pequeña.
- Coloque 24 de las subsondas de 2 ml en un bloque de hielo para almacenamiento en frío.
- Usando el nombre de la muestra y la hoja de ubicación del pozo, elija el tubo de PCR de tapa plana de 200 l correcto.
- Tome un tubo de submuestra de 2 ml y un vórtice durante 5 s para garantizar la homogeneización.
- El uso de herramientas esterilizadas con llama y lejía se carga 200 ml de la primera muestra en el tubo de PCR de tapa plana correcto (Figura 1F).
- Repita los pasos 4.2-u20124.4 hasta que se hayan cargado las 24 muestras. A continuación, vaya al paso 4.6.
- Con una toallita de papel sumergida en lejía, limpie el exterior del tubo de PCR de tapa plana de 200 l.
- Invierta el tubo y toque en el banco para mover la muestra a la parte superior del tubo. Con tijeras blanqueadas y esterilizadas con llama, sujete la parte inferior del tubo PCR para crear una abertura para que la muestra caiga en la placa de 96 pozos(Figura 1G).
- Localice el pozo correcto en una placa de 96 pozos y pase el tubo a través de la placa con el extremo cortado hacia arriba hasta llegar a ese pozo. Incline ligeramente la placa para facilitar la punción de la película de sellado perforable precortado, y sólo cuando el tubo está directamente por encima del pozo correcto cuidadosamente invertirlo para que la punta cortada encaje en el pozo. Usando herramientas esterilizadas, toque la parte superior del tubo PCR hasta que todo el suelo haya caído del tubo en el pozo. Deje el tubo dentro del pozo con la tapa cerrada (Figura 1H–1J).
- Retire un tubo pcR de 200 l de tapa plana a la vez y agregue 750 ml de solución de perlas a ese pozo(Figura 1K). Empuje el tubo de PCR de tapa plana de 200 l hasta el pozo y marque la parte superior con sharpie para indicar que este pozo se ha cargado. Repita esto para cada muestra.
- Una vez que se hayan cargado las 24 muestras y añadido la solución de perlas, retire los tubos de submuestra de 2 ml y sustitúyalos por 24 tubos sin muestrear.
- Repita los pasos 4.1-u20124.10 hasta que los 95 pozos se hayan cargado con la muestra o en blanco y solución de perlas. Retire los tubos sin pasarlos sobre pozos abiertos(Figura 1L).
- Retire cuidadosamente la película perforable y reemplace la cubierta de goma para proteger la placa hasta el inicio de la extracción(Figura 1M–1O).
- Para cantidades muy pequeñas de tierra que también son de grano fino, agregue 750 s de solución de perlas al tubo de muestra y utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir todo el contenido al pozo adecuado. Coloque el tubo PCR en la abertura para evitar la doble carga.
NOTA: Tenga cuidado al implementar esta modificación, ya que la materia orgánica de partículas o pequeños fragmentos de roca más grandes que el agujero de la punta de la pipeta pueden obstruir la pipeta y dificultar la transferencia de la suspensión de la muestra. - Según sea necesario, congele a -20 oC y almacene las placas cargadas con la solución de la muestra y el cordón hasta la extracción planificada.
5. Comparación de los métodos de carga de placas
NOTA: Para verificar nuestro novedoso método para la carga de placas de extracción de ADN de 96 pozos, dividimos una sola placa de 96 pozos en tres secciones. Utilizamos tres métodos diferentes de carga de placas para comparar el potencial de carga involuntaria del suelo y la contaminación cruzada. Los tres métodos que utilizamos fueron los métodos descritos en McPherson et al.9, el protocolo de carga predeterminado10de Qiagen y el protocolo que describimos en esta publicación.
- Carga de tierra en la placa
- Seccione una placa de 96 pozos en tres bloques de cuatro columnas. Cargue cada bloque utilizando uno de los tres métodos mencionados anteriormente.
- Cargue el suelo en cada otro pozo para que la muestra y los pozos en blanco se tambalee. Esta disposición permite la máxima oportunidad para la carga involuntaria de muestras y la contaminación cruzada.
- Congele la placa de 96 pozos a -20 oC hasta la extracción de ADN.
- Extracción de ADN
- Extraiga ADN según el protocolo de extracción de placas de 96 pozos10del fabricante.
- Conservar los extractos de ADN a -20 oC hasta su posterior análisis.
- Cuantificación del ADN en pozos en blanco
- Descongelar extractos de ADN a temperatura ambiente, vórtice y girar hacia abajo usando un spinner de placa.
- Mida y registre las concentraciones de ADN de pozos en blanco utilizando un espectrofotómetro.
- Utilice la prueba post-hoc de ANVOA y Tukey para analizar las diferencias en la concentración media de ADN en pozos en blanco.
NOTA: Se notificaron diferencias significativas en el valor de 0,05.
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Representative Results
Este novedoso método se utilizó con éxito para cargar placas de extracción de ADN de 96 pozos. La comparación de los métodos de carga de placas mostró que nuestro método tenía la concentración de ADN más baja en los pozos en blanco. La concentración de ADN en los pozos en blanco fue significativamente menor que el método propuesto mi McPherson et al.9 (p < 0.05), aunque las concentraciones de ADN en nuestro método no eran estadísticamente diferentes del método predeterminado Qiagen (Figura 2). Los tres métodos produjeron concentraciones medias de ADN por debajo de 2 ng/L, aunque sólo nuestro nuevo método produjo pozos sin concentración de ADN mensurable.
Figura 1: Métodos paso a paso para cargar muestras en placas de 96 pozos para la extracción de ADN, minimizando al mismo tiempo el potencial de contaminación cruzada entre pozos. Las cubiertas grises oscuras (presentes en los pasos A, B, N y O) representan la cubierta de silicio que viene con el kit de extracción. La cubierta gris claro (aplicada en el paso D, eliminada después del paso L) representa la cinta PCR perforable utilizada para cubrir la placa durante la carga. Aunque no se muestran en la imagen, las herramientas deben esterilizarse antes de cargar cada muestra, y los tubos de PCR deben limpiarse con lejía antes de perforar la cinta PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Concentraciones de ADN de pozos en blanco. La concentración de ADN se representa en ng/l. Las letras indican diferencias significativas por pares en las concentraciones de ADN en el valor de 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este método reduce las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo mientras se cargan placas de extracción de muestras de alto rendimiento y ofrece un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos más allá de las estrategias de carga de placas existentes9,,10. La contaminación entre pozos puede ser más generalizada en extracciones de placas de 96 pozos que en extracciones de un solo tubo, especialmente cuando seautomatizan 6,7, y, aunque no se prueba específicamente en ninguna metodología, el riesgo de contaminación cruzada se puede asumir más alto cuando los pozos de las placas de extracción se dejan abiertos durante la duración de la carga de la placa. Dada la mayor oportunidad de contaminación cruzada en extracciones basadas en placas en comparación con las extracciones de un solo tubo, la protección de pozos con una cubierta estéril debe considerarse un primer paso clave en la carga de muestras en una placa de 96 pozos. A pesar de esta necesidad, las instrucciones proporcionadas en los kits de extracción de alto rendimiento simplemente dicen que se cargue la placa y "evitar la contaminación cruzada entre los pozos de muestras", pero no proporcionan ninguna información adicional sobre cómo hacerlo10. Para reducir la contaminación mientras se agregan muestras a una placa de extracción de 96 pozos, McPherson y9 sugieren cubrir la placa con tiras cortadas de cinta de sellado PCR, pelarlas de nuevo para acceder a cada pozo. Este método reduce el tiempo total que todos los pozos están abiertos, pero los pozos están abiertos por cantidades desiguales de tiempo y algunos de los pozos más susceptibles a la contaminación (los más cercanos a la muestra que se está cargando) se exponen durante el evento de carga. Además, el pelado de la cinta de sellado PCR tiene el potencial de crear electricidad estática que resulta en la transferencia del suelo de pozo a pozo y podría ser responsable de las mayores concentraciones de ADN en pozos en blanco observados en nuestra extracción. Además, esta metodología requiere que las muestras se pasen sobre los pozos descubiertos antes de ser colocadas en el pozo de elección, y nada impide que un investigador cargue accidentalmente dos muestras en un solo pozo (doble carga) o mezcle la ubicación de dos o más muestras. Si se detecta, la doble carga no plantea más que un desperdicio de recursos. Sin embargo, si una doble carga o mezcla de ubicaciones de muestras pasa desapercibida, los resultados experimentales pueden distorsionarse7.
El método que delineamos anteriormente proporciona un medio controlado para cargar placas de extracción de ADN de alto rendimiento. Específicamente, nuestro método reduce el riesgo de contaminación cruzada al mantener los pozos cubiertos en todo momento. Los pozos están inicialmente cubiertos por cinta de sellado y luego se mantienen cubiertos por el tubo pcR utilizado para la carga de muestras. Este método no solo reduce el riesgo de contaminación cruzada, sino que también evita por completo el riesgo de cargar dos muestras en un solo pozo. Una vez que cargamos una muestra en un pozo, el tubo PCR sirve como un bloque, evitando la adición de otra muestra. Etiquetando todos los tubos con la ubicación de la placa (por ejemplo, A1, A2... H11, H12) antes de cargar muestras, este método también proporciona una comprobación final para asegurarse de que todas las muestras se han cargado y no se han perdido pozos. Mientras que este método proporciona un medio más controlado para cargar pozos, cualquier persona que cargue una placa debe tener especial cuidado al pasar un tubo PCR cortado sobre la placa. A pesar de que los pozos están sellados, cualquier partícula de muestra que caiga sobre la superficie de la placa sellada podría encontrar su camino en pozos no deseados cuando el técnico perfora la película para cargar las muestras correctas en esos pozos. Para evitar este problema, inclinamos la placa de 96 pozos a 40o antes de perforar la cinta de sellado con el tubo PCR. Este enfoque ayuda a mantener el extremo abierto del tubo erguido y lejos de los pozos incorrectos.
Cuando las muestras de suelo son de cantidades muy pequeñas y/o extremadamente finas, el uso de una punta de pipeta de diámetro ancho en lugar de cargar muestras de suelo en tubos de PCR puede ser más eficaz en la transferencia de cada muestra. Para esta modificación, la primera solución de búfer debe agregarse al tubo de muestra y, a continuación, tanto la muestra como la solución se canalizan en la placa de 96 pozos. Añadir un tubo PCR a cada pozo después de este paso evitará la doble carga. Como se menciona en la sección de protocolo, al utilizar esta modificación, el investigador o técnico debe ser muy consciente de la materia orgánica de partículas o pequeños fragmentos de roca, ya que estos tienen el potencial de obstruir el agujero de la pipeta.
Si bien ningún método de carga de muestras puede eliminar por completo el riesgo de contaminación de la muestra, el método que describimos anteriormente proporciona un medio para reducir estos riesgos sustancial y totalmente eliminar el riesgo de doble carga y mezcla de ubicaciones de muestras. En general, creemos que este método es una gran mejora en las técnicas existentes para cargar placas de extracción de ADN de alto rendimiento y sugerimos que todos los microbiólogos que utilizan placas de extracción de alto rendimiento pasan a utilizar un método como el descrito anteriormente.
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Disclosures
Los autores no reportan conflictos de intereses y no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por microbial Ecology Collaborative con financiación del premio NSF #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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