Summary
Os métodos atuais de carregamento de placas de 96 poços para extrações de DNA podem ser propensos à contaminação. Detalhamos um novo método para carregar placas de 96 poços que reduz o risco de contaminação cruzada entre os poços. Nosso método ajudará outros pesquisadores a capitalizar a eficiência das técnicas de extração de DNA de alto rendimento e minimizar o risco de contaminação.
Abstract
Técnicas de sequenciamento de DNA de alto rendimento contribuíram substancialmente para avanços na nossa compreensão das relações entre comunidades microbianas, características de hospedagem e funções ecossistêmicas mais amplas. Com esse rápido aumento na amplitude e profundidade das capacidades de sequenciamento vieram métodos para extrair, amplificar, analisar e interpretar o DNA ambiental com sucesso com a máxima eficiência. Infelizmente, a realização de extrações de DNA rapidamente pode vir ao custo de aumentar o risco de contaminação entre as amostras. Em particular, extrações de alto rendimento que são baseadas em amostras contidas em uma placa de 96 poços oferecem um método relativamente rápido, em comparação com extrações de tubo único, mas também aumentam as oportunidades de contaminação cruzada bem-para-bem. Para minimizar o risco de contaminação cruzada entre as amostras, mantendo os benefícios das técnicas de extração de alto rendimento, desenvolvemos um novo método para carregar amostras ambientais em placas de 96 poços. Usamos filmes de vedação PCR perfurantes para cobrir cada placa enquanto carregamos amostras e adicionamos amostras primeiro aos tubos PCR antes de movê-las para poços; juntas, essas práticas reduzem o risco de deriva amostral e carregamento duplo não intencional de poços. O método descrito neste artigo fornece aos pesquisadores uma abordagem para maximizar as técnicas disponíveis de extração de alto rendimento, reduzindo o risco de contaminação cruzada inerente a placas de 96 poços. Fornecemos um esboço detalhado passo a passo de como passar da coleta de amostras para a extração de DNA, minimizando o risco de contaminação cruzada indesejada.
Introduction
Os recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento das comunidades microbianas estão fornecendo profundidade de sequenciamento sem precedentes e, consequentemente, um vislumbre não precedente do funcionamento e da diversidade do microbioma da Terra1. À medida que a capacidade de multiplex mais e mais amostras em uma única pista de sequenciamento aumenta, a extração de DNA de um único tubo tem o potencial de se tornar um passo limitante na geração de dados ecológicos. No entanto, novos métodos em extrações de DNA de alto rendimento prometem processar grandes quantidades de amostras ambientais com maior eficiência do que já foi possívelanteriormente 2. Esses métodos geralmente envolvem o uso de placas de 96 poços em vez de tubos únicos, aumentando assim o possível número de extrações que podem ocorrer simultaneamente. Assim, a praticidade e eficiência dos métodos de extração de alto rendimento são evidentes e foram implementadas para o processamento de amostras ambientais que vão desde o solo3,,4 e tecidos vegetais3,,5 até a matéria fecal humana2.
Embora esses métodos possam acelerar drasticamente ao longo do processamento de amostras e extração de DNA, a etapa inicial de carregar o solo e outras amostras ecológicas em placas de 96 poços é suscetível à contaminação de amostras cruzadas. Esse tipo de contaminação bem-a-poço pode ocorrer durante as extrações de DNA6,,7,,8, e os poços são particularmente vulneráveis nesta primeira etapa antes que as amostras sejam suspensas em uma solução tampão. McPherson et al.9 demonstram um método para carregar solos de rizosfera em placas de 96 poços usando funis e tampas de tiras PCR de 8 poços, mas embora seu método seja uma abordagem mais controlada para carregar placas, ainda fornece ampla oportunidade para contaminação de poços vizinhos ao carregar cada amostra. Além disso, os poços abertos permitem a chance de um pesquisador distraído colocar uma amostra no poço incorreto ou adicionar uma amostra em um poço que já foi carregado. Além disso, uma variedade de tipos de amostra se mostram inadequados para o carregamento com este método; amostras molhadas muitas vezes grudam nos funis e amostras secas 'saltam' entre poços devido à eletricidade estática.
Para reduzir as oportunidades de contaminação entre os poços na primeira etapa de extrações de DNA de alto rendimento, desenvolvemos uma nova abordagem para carregar amostras de solo em placas de 96 poços. Nossos métodos protegem os poços da exposição ambiental e nos impedem de carregar acidentalmente várias amostras em um poço (carregamento duplo). Acreditamos que o método relatado abaixo oferece a promessa de reduzir o potencial de contaminação e, como tal, fornece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços para extração subsequente de DNA.
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Protocol
1. Banco de laboratório e preparação de ferramentas para carregar uma placa de 96 poços
- Banco claro por neblina com 70% de etanol. Limpe e deixe o ar secar antes de pulverizar a parte superior do banco com 10% de alvejante. Limpe a parte de cima do banco seca.
- Esterilizar micro-scoopula, espátula e tesoura cirúrgica (curvada) mergulhando em 95% de etanol e, em seguida, expor a uma chama. Mergulhe cada um em 10% de alvejante e deixe secar o ar antes de usar.
NOTA: As ferramentas devem ser esterilizadas entre cada amostra.
2. Sub-amostragem e preparação da amostra
- Esterilizar luvas utilizando etanol antes da sub-amostragem.
- Homogeneize minuciosamente as amostras do solo antes da subamostra.
- Utilizando ferramentas esterilizadas, carregue um tubo de centrífuga de 2 mL rotulado com amostra até aproximadamente metade do total.
- Repita o passo 2.2 até que todas as 95 amostras tenham sido subamostradas em tubos de centrífugas de 2 mL rotulados. O poço96 deve ser usado como uma extração em branco.
NOTA: As etapas 2.3 e 2.4 são feitas para minimizar o espaço de armazenamento necessário e para evitar uma amostragem excessiva ou dupla. - Armazene tubos de subfíria de 2 mL no gelo até o carregamento da placa.
- Etiqueta 96 tubos PCR de tampa plana de 200 μL A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Coloque esses tubos em ordem em um rack de 96 poços.
- Atribua um ID de amostra com uma localização de poço (A1\u2012H12) e grave-o.
3. Preparação da placa
- Retire a tampa de borracha da placa de 96-bem(Figura 1A-1C) e coloque-a em um saco plástico estéril (ver Tabela de Materiais). Sele o saco plástico para evitar contaminação.
- Cubra a placa de 96 poços com filme de vedação(Figura 1D-1E); por exemplo, use um filme de vedação perfurante pré-cortado (veja a tabela de materiais). Certifique-se de vedação rodando com um rolo de borracha.
NOTA: Tapetes de silicone perfurados poderiam potencialmente oferecer uma opção reutilizável, desde que limpeza apropriada entre os usos, mas os tapetes de silicone que testamos facilmente se dividem ao longo dos piercings e não ofereceriam proteção igual a quaisquer placas seguintes. - Coloque a placa na geladeira (4 °C) para manter a calma.
4. Transferência de subamostras
NOTA: Veja a etapa 4.13 para modificações quando a amostra do solo for muito pequena.
- Coloque 24 das subamostras de 2 mL em um bloco de gelo para armazenamento a frio.
- Usando o nome da amostra e a folha de localização do poço, escolha o tubo PCR de tampa plana correto de 200 μL.
- Pegue um tubo de subfísia de 2 mL e vórtice para ~5 s para garantir a homogeneização.
- Utilizando as ferramentas esterilizadas de chama e alvejante carregam ~200 μL da primeira amostra no tubo PCR de tampa plana correta(Figura 1F).
- Repetir as etapas 4.2\u20124.4 até que todas as 24 amostras tenham sido carregadas. Em seguida, passar para o passo 4.6.
- Usando uma limpeza de papel alvejada, limpe a parte externa do tubo PCR de tampa plana de 200 μL.
- Inverta o tubo e toque no banco para mover a amostra para cima do tubo. Com uma tesoura branqueada e esterilizada por chamas, corte a parte inferior do tubo PCR para criar uma abertura para que a amostra caia na placa de 96 poços(Figura 1G).
- Localize o poço correto em uma placa de 96 poços e passe o tubo através da placa com a extremidade cortada voltada para cima até chegar tão bem. Incline a placa ligeiramente para facilitar a puncturação do filme de vedação perfurante pré-cortado, e somente quando o tubo estiver diretamente acima do bem correto inverta-o cuidadosamente para que a ponta de corte se encaixe no poço. Usando ferramentas esterilizadas, toque na parte superior do tubo PCR até que todo o solo tenha caído do tubo para o poço. Deixe o tubo dentro do poço com tampa fechada(Figura 1H-1J).
- Remova um tubo PCR de 200 μL de tampa plana de cada vez e adicione 750 μL de solução de contas a esse poço(Figura 1K). Empurre o tubo PCR de tampa plana de 200 μL todo o caminho até o poço e marque a parte superior com sharpie para indicar que este poço foi carregado. Repita isso para cada amostra.
- Uma vez adicionadas todas as 24 amostras e adicionadas soluções de contas, remova os tubos de subamostra de 2 mL e substitua por 24 tubos não amostrados.
- Repetir as etapas 4.1\u20124.10 até que todos os 95 poços tenham sido carregados com amostra ou solução em branco e contas. Remova os tubos sem passá-los sobre poços abertos(Figura 1L).
- Remova cuidadosamente o filme perfurado e substitua a tampa de borracha para proteger a placa até o início da extração(Figura 1M-1O).
- Para quantidades muito pequenas de solo que também são de grãos finos, adicione 750 μL de solução de contas ao tubo de amostra e use uma ponta de pipeta de furo largo para transferir todo o conteúdo para o poço apropriado. Coloque o tubo PCR na abertura para evitar o carregamento duplo.
NOTA: Tenha cuidado ao implementar esta modificação como material orgânico particulado ou pequenos fragmentos de rocha maiores do que o furo da ponta pipeta pode entupir a pipeta e dificultar a transferência da pasta amostral. - Conforme necessário congelar a -20 °C e armazenar placas carregadas com amostra e solução de contas até a extração planejada.
5. Comparação dos métodos de carregamento de placas
NOTA: Para verificar nosso novo método de carregamento de placas de extração de DNA de 96 poços, dividimos uma única placa de 96 poços em três seções. Utilizamos três métodos diferentes de carregamento de placas para comparar potencial para carregamento não intencional de solo e contaminação cruzada. Os três métodos utilizados foram os métodos descritos em McPherson et al.9, o protocolo padrão de carregamento10da Qiagen, e o protocolo que delineamos nesta publicação.
- Carregando terra na placa
- Selá uma placa de 96 poços em três blocos de quatro colunas. Carregue cada bloco usando um dos três métodos mencionados acima.
- Coloque o solo em todos os outros poços para que a amostra e os poços em branco sejam escalonados. Este arranjo permite a oportunidade máxima de carregamento inadvertido de amostras e contaminação cruzada.
- Congele a placa de 96 poços a -20 °C até a extração do DNA.
- Extração de DNA
- Extrair DNA de acordo com o protocolo de extração de placas de 96 poços do fabricante10.
- Armazene os extratos de DNA a -20 °C até uma análise mais aprofundada.
- Quantificação do DNA em poços em branco
- Descongele extratos de DNA à temperatura ambiente, vórtice e gire para baixo usando um rotador de placas.
- Medir e registrar concentrações de DNA de poços em branco usando um espectrofotômetro.
- Use o teste pós-hoc de ANVOA e Tukey para analisar diferenças na concentração média de DNA em poços em branco.
NOTA: Diferenças significativas foram relatadas em α = 0,05.
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Representative Results
Este novo método foi usado com sucesso para carregar placas de extração de DNA de 96 poços. A comparação dos métodos de carregamento de placas mostrou que nosso método tem a menor concentração de DNA nos poços em branco. A concentração de DNA nos poços em branco foi significativamente menor do que o método proposto pelo meu McPherson et al.9 (p < 0,05), embora as concentrações de DNA em nosso método não fossem estatisticamente diferentes do método padrão de Qiagen(Figura 2). Todos os três métodos produziram concentrações médias de DNA abaixo de 2 ng/μL, embora apenas nosso novo método produziu poços sem concentração de DNA mensurável.
Figura 1: Métodos passo a passo para carregar amostras em placas de 96 poços para extração de DNA, minimizando o potencial de contaminação cruzada entre os poços. As capas cinza escuras (presentes nas etapas A, B, N e O) representam a tampa de silicone que vem com o kit de extração. A tampa cinza clara (aplicada na etapa D, removida após a etapa L) representa a fita PCR perfurante usada para cobrir a placa durante o carregamento. Embora não retratado, as ferramentas devem ser esterilizadas antes do carregamento de cada amostra, e os tubos PCR devem ser limpos com alvejante antes de perfurar a fita PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: concentrações de DNA de poços em branco. A concentração de DNA é representada em ng/μL. As letras indicam diferenças significativas em pares nas concentrações de DNA em α = 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método reduz as oportunidades de contaminação cruzada bem--a-bem ao carregar placas de extração de amostras de alto rendimento e oferece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços além das estratégias de carregamento de placas existentes9,,10. A contaminação entre poços pode ser mais difundida em extrações de placas de 96 poços do que em extrações de tubo único, especialmente quando automatizada6,,7, e, embora não especificamente testada em qualquer metodologia, o risco de contaminação cruzada pode ser assumido mais alto quando os poços das placas de extração são deixados abertos durante a duração do carregamento da placa. Dada a maior oportunidade de contaminação cruzada em extrações à base de placas em comparação com extrações de tubo único, proteger poços com uma tampa estéril deve ser considerado um primeiro passo fundamental para carregar amostras em uma placa de 96 poços. Apesar dessa necessidade, as instruções fornecidas em kits de extração de alto rendimento simplesmente dizem para carregar a placa e para "evitar contaminação cruzada entre poços de amostra", mas não fornecem nenhuma informação adicional sobre como fazê-lo10. Para reduzir a contaminação, adicionando amostras a uma placa de extração de 96 poços, McPherson et al.9 sugerem cobrir a placa com tiras cortadas de fita de vedação PCR, descascando-as de volta para acessar cada poço. Esse método reduz o tempo total em que todos os poços estão abertos, mas os poços estão abertos por quantidades de tempo desiguais e alguns dos poços mais suscetíveis à contaminação — aqueles mais próximos da amostra que está sendo carregada — são expostos durante o evento de carregamento. Além disso, o peeling de fita adesiva PCR tem o potencial de criar eletricidade estática que resulte na transferência do solo de poço para poço e pode ser responsável pelas maiores concentrações de DNA em poços em branco observados em nossa extração. Além disso, essa metodologia exige que as amostras sejam passadas sobre poços descobertos antes de serem colocadas no poço de escolha, e nada impede um pesquisador de carregar acidentalmente duas amostras em um único poço (carregamento duplo) ou misturar a localização de duas ou mais amostras. Se pego, o carregamento duplo não representa nada mais do que um desperdício de recursos. Se, no entanto, um carregamento duplo ou mistura de locais amostrais passar despercebido, os resultados experimentais podem ser distorcidos7.
O método que delineamos acima fornece um meio controlado para carregar placas de extração de DNA de alto rendimento. Especificamente, nosso método reduz o risco de contaminação cruzada mantendo os poços cobertos o tempo todo. Os poços são inicialmente cobertos por fita de vedação e são então mantidos cobertos pelo tubo PCR usado para carregamento de amostras. Este método não só reduz o risco de contaminação cruzada, como também evita inteiramente o risco de carregar duas amostras em um único poço. Uma vez que carregamos uma amostra em um poço, o tubo PCR serve como um bloco, impedindo a adição de outra amostra. Rotulando todos os tubos com localização da placa (por exemplo, A1, A2... H11, H12) antes do carregamento das amostras, este método também fornece uma verificação final para garantir que todas as amostras tenham sido carregadas e nenhum poço tenha sido perdido. Embora este método forneça um meio mais controlado para carregar poços, qualquer pessoa que carregue uma placa deve tomar cuidado extra ao passar um tubo PCR cortado sobre a placa. Mesmo que os poços estejam selados, qualquer amostra de partículas que caiam sobre a superfície da placa selada poderia encontrar seu caminho em poços não intencionais quando o técnico perfurar o filme para carregar as amostras corretas nesses poços. Para evitar esse problema, inclinamos a placa de 96 poços para ~40° antes de perfurar a fita de vedação com o tubo PCR. Esta abordagem ajuda a manter a extremidade aberta do tubo ereto e longe dos poços incorretos.
Quando as amostras de solo são de quantidades muito pequenas e/ou extremamente finas, usar uma ponta de pipeta larga em vez de carregar amostras de solo em tubos PCR pode ser mais eficaz na transferência de cada amostra. Para esta modificação, a primeira solução tampão deve ser adicionada ao tubo de amostra e, em seguida, tanto a amostra quanto a solução pipeted na placa de 96 poços. Adicionar um tubo PCR a cada poço após esta etapa evitará o carregamento duplo. Como mencionado na seção de protocolo, ao utilizar essa modificação, o pesquisador ou técnico deve estar muito ciente da matéria orgânica particulada ou pequenos fragmentos de rocha, pois estes têm o potencial de entupir o furo da pipeta.
Embora nenhum método de carregamento de amostras possa eliminar totalmente o risco de contaminação da amostra, o método que descrevemos acima fornece um meio de reduzir esses riscos substancialmente e totalmente eliminar o risco de carregamento duplo e mistura de locais amostrais. No geral, acreditamos que este método é uma grande melhoria nas técnicas existentes para carregar placas de extração de DNA de alto rendimento e sugere que todos os microbiologistas que usam placas de extração de alto rendimento se movem para usar um método como o descrito acima.
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Disclosures
Os autores não relatam conflitos de interesse e não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Microbial Ecology Collaborative com financiamento do prêmio NSF #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
