Summary
Hier beschrieben wir ein Protokoll zur quantitativen Untersuchung der Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente (AIS) von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt.
Abstract
Neuronale Axon-Initialsegmente (AIS) sind Orte der Initiierung von Aktionspotentialen und wurden umfassend auf ihre molekulare Struktur, Anordnung und aktivitätsabhängige Plastizität untersucht. Giant Ankyrin-G, der Hauptorganisator von AIS, verbindet sich direkt mit membranübergreifenden spannungsgesteuerten Natrium- (VSVG) und Kaliumkanälen (KCNQ2/3) sowie 186 kDa-Neurofaszin, einem L1CAM-Zelladhäsionsmolekül. Riesen-Ankyrin-G bindet und rekrutiert auch zytoplasmatische AIS-Moleküle, einschließlich Beta-4-Spectrin und die Mikrotubuli-bindenden Proteine EB1 / EB3 und Ndel1. Riesiges Ankyrin-G reicht aus, um die AIS-Bildung in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Ankyrin-G enthält auch eine kleinere 190 kDa-Isoform, die sich an dendritischen Stacheln anstelle des AIS befindet, die nicht in der Lage ist, auf den AIS zu zielen oder den AIS in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Hier beschrieben wir ein Protokoll mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-Flox-Mäusen, die, wenn sie mit Cre-BFP transfiziert werden, einen Verlust aller Isoformen von Ankyrin-G aufweisen und die Bildung von AIS beeinträchtigen. In Kombination eines modifizierten Banker-Glia/Neuron-Co-Culture-Systems entwickelten wir eine Methode, um Ankyrin-G-Nullneuronen mit einem 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid zu transfizieren, das ausreicht, um die Bildung von AIS zu retten. Darüber hinaus verwenden wir eine quantifizierungsmethode, die von Salzer und Kollegen entwickelt wurde, um die Variation der AIS-Entfernung von den neuronalen Zellkörpern zu behandeln, die in Hippocampus-Neuronenkulturen auftritt. Dieses Protokoll ermöglicht quantitative Untersuchungen der De-novo-Assemblierung und des dynamischen Verhaltens von AIS.
Introduction
Das Axon-Anfangssegment befindet sich am proximalen Axon in den meisten Wirbeltierneuronen. Funktional ist AIS der Ort, an dem Aktionspotentiale aufgrund der hohen Dichte spannungsgesteuerter Natriumkanäle in diesem Bereich initiiert werden. AIS einiger exzitatorischer Neuronen werden auch von inhibitorischen Interneuronen durch die Bildung von GABAergen Synapsen1,2,3angegriffen. Daher ist AIS ein kritischer Ort, um Zellsignale zu integrieren und die Erregbarkeit von Neuronen zu modulieren. AIS ist normalerweise 20-60 μm lang und befindet sich innerhalb von 20 μm des Zellkörpers. Die Länge und Position von AIS variiert in Neuronen über Gehirnregionen hinweg sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien desselben Neurons4,5. Gesammelte Beweise deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung und Position von AIS dynamisch auf die Veränderung der neuronalen Aktivitätreagieren 4,5,6,7.
480 kDa Ankyrin-G ist der Master-Organizer von AIS. 480 kDa Ankyrin-G ist ein membranassoziiertes Adapterprotein, das direkt an spannungsgesteuerte Natriumkanäle sowie andere wichtige AIS-Proteine bindet, einschließlich Beta4-Spectrin, KCNQ2/3-Kanäle, die die Natriumkanalaktivität8,9und 186 kDa-Neurofascin modulieren, ein L1CAM, das GABAerge Synapsen zum AIS2,10leitet. 480 kDa Ankyrin-G teilt kanonische Ankyrindomänen, die in der kurzen 190 kDa Ankyrin-G-Isoform (ANK-Wiederholungen, Spectrin-Bindungsdomäne, regulatorische Domäne) gefunden werden, unterscheiden sich jedoch durch ein riesiges Exon, das nur in Wirbeltieren vorkommt und spezifisch in Neuronen exprimiert wird (Abbildung 1A)11,12. Die 480 kDa Ankyrin-G Neuronen-spezifische Domäne (NSD) wird für die AIS-Bildungbenötigt 12. Das 190 kDa Ankyrin-G fördert nicht die AIS-Assemblierung oder zielt AIS in Ankyrin-G-Null-Neuronen12. Allerdings sind 190 kDa Ankyrin-G am AIS konzentriert und enthalten 480 kDa Ankyrin-G12. Diese Fähigkeit des 190 kDa Ankyrin-G, auf vormontierte AIS von Wildtyp-Neuronen zu zielen, war eine Quelle der Verwirrung in der Literatur und hat die Wertschätzung der kritischen Spezialfunktionen des 480 kDa Ankyrin-G in der AIS-Assemblierung verlangsamt. Daher ist es wichtig, die AIS-Assemblierung in Ankyrin-G-Null-Neuronen zu untersuchen, denen ein vormontiertes AIS fehlt.
Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung des Aufbaus und der Struktur des AIS mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die alle Isoformen von Ankyrin-G13 eliminiert (Abbildung 1B). Durch die Transfektierung von Neuronen mit einem Cre-BFP-Konstrukt, bevor AIS zusammengesetzt wird, erzeugten wir Ankyrin-G-defiziente Neuronen, die völlig ohne AIS waren (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die Montage von AIS ist nach Co-Transfektion von 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid mit einem Cre-BFP-Plasmid vollständig gerettet. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die AIS-Assembly in einer nicht vormontierten AIS-Umgebung zu untersuchen. Wir modifizierten auch das Glia-Neuron-Co-Culture-System von Gary Banker ohne Verwendung von Antibiotika, das zuvor für embryonale Neuronen am Tag 18 entwickelt wurde, für die Anwendung auf postnatale Mausneuronen und passten eine AIS-Quantifizierungsmethode an durchschnittliche AIS-Messungen von mehreren Neuronen an, um die Variation von AIS14,15zu normalisieren.
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Protocol
HINWEIS: Diese Kulturmethode von Hippocampus-Neuronen aus postnatalen 0-Tage-ANK3-E22/23f/f-Mäusen wurde von Gary Bankers Glia/Neuron-Co-Culture-System adaptiert. Daher ist es wichtig, alle Schritte nach der Dissektion in einer sauberen Haube mit sterilisierten Werkzeugen durchzuführen. Dieses Protokoll dauert bis zu 1 Monat. Der Workflow wird in Abbildung 3angezeigt. Das Protokoll folgt den Tierrichtlinien der Duke University.
1. Zubereitung von Coverlips und neuronalen Beschichtungsschalen
- Mindestens eine Woche vor dem Kulturtag die Abdeckripp auf das Abdeckgestell laden und über Nacht in Salpetersäure (70% W/W) einweichen (könnte tagelang verlängert werden).
- Mit Salpetersäure behandelte Abdeckstücke mit destilliertem Wasser auf einem Low-Speed-Shaker in einem Glas 2 mal, jeweils 1 Stunde, waschen.
- Inkubieren Sie Coverlips in gesättigtem KOH, gelöst in 100% Ethanol über Nacht. Fügen Sie KOH in Ethanol hinzu, bis es nicht mehr gelöst ist.
- Wiederholen Sie den Waschschritt mit destilliertem Wasser. Decken Sie die Abdeckungen mit 100% Ethanol einmal für 10 Minuten ab.
- Übertragen Sie die Abdeckschichten vom Rack in ein Glasbecherglas. Decken Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie ab. Backen Sie Diedeckel über Nacht in einem 225 °C-Ofen, um die Abdecklippen zu sterilisieren. (Coverlips könnten wochenlang im Becherglas aufbewahrt werden).
- Legen Sie die Coverlips in eine Petrischale und tragen Sie dann 3-4 Wachspunkte auf die Coverlip auf, um als Füße zu dienen. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um in einer Glasflasche in gekochtes Wachs zu tauchen. Berühren Sie dann schnell den Coverlip, um einen Punkt zu erstellen. Eine 60 mm Petrischale kann 4 Abdecklippen aufnehmen. Eine 10 mm Petrischale kann ~10 Abdecklippen aufnehmen.
- 2 Tage vor dem Kulturtag Deckschichten (die Seite mit den Wachspunkten) mit Filter sterilisiert 1 mg/ml Poly-L-Lysin in 0,1 M Borsäure (pH 8,5) für mindestens 6 Stunden und spülen Sie mit Wasser 2 mal, jeweils 1 Stunde. Coverlips bleiben in der gleichen Petrischale.
- Beschichtungsmedium (MEM ergänzt mit Glukose 0,6% (wt/vol) und 10% (vol/vol) Pferdeserum) langsam auf Platten geben, ohne störende Coverlips. Legen Sie Platten bis zum Kulturtag in den Inkubator, um Neuronen zu säen.
2. Zubereitung von Gliazell-Feeder-Gerichten (2 Wochen vor dem Kulturtag)
- Sezieren Sie den Kortex aus einem postnatalen 1 Tag alten Mäusegehirn und schälen Sie die Hirnhäute ab.
- Das Kortexgewebe mit einer sauberen Schere in einer sauberen Petrischale in einer sauberen Bank so fein wie möglich hacken.
- Das gehackte Gewebe in 12 ml HBSS geben und 1,5 ml 2,5% Trypsin und 1% (wt/vol) DNase hinzufügen. Inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad für 15 min, schwingen Sie alle 5 min. Gut verdautes Gewebe wird klebrig und bildet einen großen Cluster. Triturieren Sie 10-15 mal mit einer 10 ml Pipette, um das Gewebe abzubauen und eine bessere Verdauung zu erhalten.
- Triturieren Sie das gut verdaute Gewebe 10-15 mal mit einer 5 mL Pipette, bis die meisten Brocken verschwinden und das Medium trüb wird. Durch ein Zellsieb gehen, um die verbleibenden Brocken zu entfernen, und 15 ml Gliamedium (Minimales essentielles Medium (MEM) ergänzt mit Glukose (0,6% wt / vol), 10% (vol / vol) Pferdeserum und Penicillin-Streptomycin (1x) hinzufügen, um die Verdauung zu stoppen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 120 x g für 5 Minuten und saugen Sie den Überstand an. Das Zellpellet mit frischem Gliamedium und Samen in Zellkulturschalen (ca. 105 Zellen/cm2) wieder aufspulieren.
- Ersetzen Sie medium am nächsten Tag durch frisches Gliamedium, um nicht befestigte Zellen zu entfernen.
- Füttern Sie die Gliagerichte alle 3-4 Tage mit frischem Glia Medium. Schlagen Sie den Kolben 5-10 Mal mit einer Hand, um lose anhaftende Zellen zu entfernen, bevor Sie das Medium wechseln.
- Nach 10 Tagen Kultur sollten Gliazellen fast konfluent sein. Gliazellen mit 0,25% Trypsin-EDTA lösen und etwa 105 Zellen in einer neuen 60 mm Zellkulturschale aussäen. Verbleibende Zellen könnten für die zukünftige Verwendung eingefroren werden.
- 3 Tage vor dem Kulturtag das Gliamedium auf neuronales Kulturmedium umstellen (Neurobasal-A Medium mit 1x GlutaMAX-I und 1x B27 Ergänzung).
3. Kultur Hippocampus-Neuronen
HINWEIS: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur ausgeführt.
- Sezieren Sie 6-8 Hippocampi von postnatalen 1-Tag alten Welpen von ANK3-E22/23f Mäusen mit HBSS-Medium in einer Petrischale bei raumtemperiertem Raum. Die Hippocampi mit einer Sezierschere in kleinere Stücke schneiden. Hippocampi von der Petrischale in ein 15 ml Röhrchen geben.
- Hippocampi 2x mit 5 ml HBSS in der Tube waschen. Lassen Sie die Hippocampi nach dem Waschen in 4,5 ml 1x HBSS.
- 0,5 ml 2,5% Trypsin in 4,5 ml HBSS geben und in einem 37 °C Wasserbad 15 Minuten lang inkubieren. Kehren Sie die Röhre alle 5 Minuten um. Gut verdaute Hippocampi sollten klebrig werden und eine Gruppe bilden. Bei Bedarf die Verdauung um weitere 5 Minuten verlängern.
- Hippocampi mit HBSS 3 mal für jeweils 5 Minuten waschen. Verwenden Sie kein Vakuum, um das HBSS zu entfernen. Es ist sehr einfach, die Hippocampi zu entfernen.
- Fügen Sie nach dem Waschen 2 ml HBSS hinzu und pipetetten Sie die Hippocampi 15 Mal mit einer Pasteur-Pipette auf und ab.
- Triturieren Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette (der Durchmesser des Offenen ist um die Hälfte verengt) 10 mal. Gehen Sie nicht über das 10-fache hinaus, auch wenn noch Brocken übrig sind. Überhören tötet Neuronen.
- Legen Sie das Rohr für 5 Minuten, bis alle Brocken auf den Boden gesetzt sind. Verwenden Sie vorsichtig eine 1 ml Pipettenspitze, um den Überstand, der die dissoziierten Neuronen enthält, auf Beschichtungsschalen (105 Zellen / 60 mm Schüssel) zu übertragen. Direkt in das vorinkubierte Beschichtungsmedium geben und die Platte vorsichtig schütteln.
- Wiederholen Sie Schritt 3.6-3.7 mit den verbleibenden Stücken, bis die meisten Brocken verschwunden sind.
- 2-4 Stunden nach der Aussaat die Beschichtungsschalen mit einem Lichtmikroskop überprüfen. Die Mehrheit der Neuronen sollte sich an der Decke befestigt haben. Die angebrachten Zellen sind rund und hell. Klappen Sie die Abdecklippen mit einer feinen Spitzenzette zu den Gliazell-Feederschalen mit vorkonditioniertem neuronalem Kulturmedium mit der Wachspunktseite nach unten.
- Neuronen können in den Gliazell-Futterschalen bis zu 1 Monat lang wachsen. Füttern Sie Neuronen alle 7 Tage mit 1 ml frischem neuronalem Kulturmedium.
- Optionaler Schritt: 1 Woche nach der Aussaat Cytosin-Arabinosid (1-β-D-Arabinofuranosylcytosin) zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzufügen, um die Gliaproliferation einzudämmen.
4. Störung des AIS durch Knockout von Ankyrin-G in einem früheren Stadium der Neuronenentwicklung
- Drehen Sie am 3 div (Tag in vitro)die Coverlips mit Wachspunkten mit der Seite nach oben zu einer Gliazell-Feederschale mit konditioniertem neuronalem Kulturmedium.
- Mischen Sie 0,25 μg Cre-BFP-DNA mit 0,5 μg Ankyrin-G-GFP (WT / Mutant) -DNA in einem 1,7-ml-Röhrchen, um 4 Coverlips zu transfizieren (~ 2: 1 Verhältnis der DNA-Kopienzahl). 100 μL Kulturmedium (z.B. Opti-MEM) hinzufügen, mischen und auf einem Rack ruhen lassen. Wenn nur Cre-BFP transfiziert wird, wird das GFP-Plasmid-Rückgrat verwendet, um die Gesamtmenge an DNA abzugleichen.
- Mischen Sie 3 μL Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamine 2000) (~ 3-fache DNA) mit 100 μL Kulturmedium in einem neuen 1,7 ml Röhrchen. Inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT.
- Mischen Sie 100 μL DNA-Lösung aus Schritt 4.2 mit 100 μL Transfektionsreagenz aus Schritt 4.3. Ruhen Sie sich für 5-10 Minuten auf einem Rack aus.
- Fügen Sie 50 μL DNA-Mix aus Schritt 4.4 direkt auf jeden Coverlip hinzu, indem Sie die Spitze direkt unter dem Medium einführen, ohne die Coverlips zu berühren. Pipette langsam, um die Ausbreitung des DNA-Mixes zu vermeiden.
- Bringen Sie die Schüssel langsam zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie für 30-45 Minuten.
- Drehen Sie die Coverlips zurück zur home Glia Feeder Dish mit Wachspunkten zur Seite nach unten und legen Sie die Platte zurück in den Inkubator.
5. Quantifizierung des Axon-Anfangssegments
- Fixieren Sie Neuronen auf 7-10 div und färben Sie mit AIS-Marker nach dem Standard-Immunzytochemie-Protokoll für das Protein von interessant.
- Sammeln Sie fluoreszierende Bilder mit der gewünschten Mikroskopie.
- Nehmen Sie Abschnitte der Z-Serie, um das Signal des gesamten AIS zu sammeln. Behalten Sie für alle Bilder die gleiche Z-Tiefe bei.
- Passen Sie die Laserintensität an, um den besten Dynamikbereich für die Pixelintensität zu erreichen.
- Stellen Sie sicher, dass alle AIS-Bilder mit demselben Mikroskop-Setup aufgenommen wurden.
- Überprüfen Sie immer das Signal von Cre-BFP.
- AIS-Quantifizierung
- Bild öffnen mit Fidschi (https://fiji.sc).
- Generieren Sie eine maximale Projektion von Bildern der Z-Serie.
- Subtrahieren Sie das leere Coverlip-Hintergrundsignal vom Bild.
- Zeichnen Sie eine Linie entlang des AIS. Die Breite der Linie sollte das AIS vollständig abdecken. Starten Sie die Linie, bevor das AIS-Signal über den Hintergrund ausgelöst wird, und stoppen Sie, nachdem es in den Hintergrund fällt.
- Messen Sie die mittlere Pixelintensität allein der Zeile und exportieren Sie sie in eine Tabelle (~ 10-15 AISs werden benötigt).
- Generieren Sie die durchschnittliche Intensitätskurve von AIS mit dem MATLAB-Skript, das von Berger et al.15adaptiert wurde.
- Für jedes Experiment sollten nur Cre und Cre plus Wildtyp 480 kDa Ankyrin-G transfizierte Neuronen als Negativ- und Positivkontrollen eingeschlossen werden, um sicherzustellen, dass der Knockout von AIS effizient ist und die Rettung erfolgreich ist.
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Representative Results
Ein vollständiger Satz von Experimenten sollte Cre-BFP nur Transfektion als Negativkontrolle, Cre-BFP plus 480 kDa Ankyrin-G Co-Transfektion als Positivkontrolle und eine nicht transfizierte Bedingung als Technikkontrolle enthalten. Bei der reinen Cre-BFP-Kontrolle fehlt transfizierten Neuronen die Akkumulation von AIS-Markern, einschließlich Ankyrin-G (ankG), Beta4-Spectrin (β4), Neurofascin (Nf) und spannungsgesteuerten Natriumkanälen (VSVG)(Abbildung 4A)16. Im Gegensatz dazu haben Cre und 480 kDa Ankyrin-G co-transfizierte Neuronen vollständig zusammengesetzte AIS, die durch die Gegenwart von AIS-Markern aufgedeckt wurden (Abbildung 4B). Es ist wichtig, die Qualität der Kultur durch den Vergleich mit den nicht transfizierten Gerichten zu bestätigen. Ungesunde Neuronen neigen dazu, eine abnormale AIS-Struktur zu zeigen, wie abgesetzte oder ektopische AIS (Abbildung 4C).
Dann zeigten wir ein Beispiel für die Bewertung, wie sich eine Ankyrin-G-Mutation der menschlichen neurologischen Entwicklungsstörung (ankG-K2864N) auf die AIS-Assemblierung auswirkt(Abbildung 5). 3 div ANK3-E22/23f/f Neuronen wurden mit Cre-BFP und Wildtyp 480 kDa Ankyrin-G (ankG-WT) oder 480 kDa Ankyrin-G baring human mutation (ankG-K2864) transfiziert. Neuronen wurden bei div7 fixiert und für Ankyrin-G gefärbt. Bilder wurden von 10-15 transfizierten Neuronen und 10-15 Kontrollneuronen auf den gleichen Coverlips gesammelt und mit maximaler Intensitätsprojektion verarbeitet. Dann zeichnen wir eine Linie am AIS wie gezeigt und messen die mittlere Intensität über die Linie. Nachdem wir die AIS-Intensität gemittelt haben, zeichnen wir die AIS-Intensität vom Soma bis zum distalen Axon auf. AIS-angereichertes Protein zeigte normalerweise einen schnellen Anstieg des Signals vom proximalen Axon und eine langsame Abnahme des Signals an das distale Axon. AIS, das von Ankyrin-G mit menschlicher Mutante zusammengesetzt wurde, zeigte eine Zunahme und Abnahme des Signals. Aber wenn sie mit dem nicht transfizierten AIS ausgerichtet ist, ist die Mutantenkurve breiter und der Höhepunkt der Kurve ist niedriger, was auf eine Strukturänderung von AIS hindeutet. Das Wildtyp-Ankyrin-G-AIS, das eng mit dem nicht transfizierten AIS übereinstimmt.
Abbildung 1: Die genomische Editierung von ANK3-E22/23-flox. (A) Schematische Darstellung von Proteindomänen für 3 Ankyrin-G-Isoformen. Die Position der codierten Bereiche von Exon 22 und 23 im kanonischen Bereich wird durch die Bindestrichlinie angezeigt. (B) Die Position der LoxP-Stellen in ANK3-E22/23-flox-Mäusen wird durch dreieckig angezeigt. In der Gegenwart der Cre-Rekombinase wird Exon 22 und 23 gelöscht und verursacht den Verlust der Expression aller 3 Isoformen von Ankyrin-G. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verlust von AIS in ANK3-E22/23-flox-Neuronen in der Gegenwart der Cre-Rekombinase. Ein Diagramm zeigt den Zeitrahmen der Ankyrin-G-Expression und AIS-Assemblierung in Wildtyp-Neuronen im Vergleich zu ANK3-E22/23f/f-Neuronen mit Cre-Transfektion bei 3 Div. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Workflow des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Eine vollständige Rettung von AIS durch 480kDa AnkG in ANK3-E22/23-flox Neuronen, die mit Cre transfiziert sind. 3 div Neuronen von ANK3-E22/23f/f Mäusen wurden mit Cre-BFP (A) oder mit einem Cre-BFP und Wildtyp 480 kDa Ankyrin-G-GFP (B)transfiziert. Neuronen wurden auf 7 div fixiert und für Ankyrin-G (ankG), β4-Spectrin (β4), Neurofascin (Nf) und spannungsgesteuerte Natriumkanäle (VSVG) gefärbt. Weiße Pfeilspitze zeigt auf den AIS eines transfizierten Neurons. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. Diese Figur wurde von Yang et al16adaptiert. (C) Es wurden zwei ungesunde Neuronen gezeigt, die mit tdTM und 480 kDa Ankyrin-G-GFP transfiziert wurden. Die Bildung von Aggregaten (weiß eingekreist und vergrößert) ist ein Zeichen für ungesunde Neuronen. Oben: 480 kDa Ankyrin-G erscheint im Nicht-AIS-Bereich (durch weiße Pfeilspitzen gespitzt. Unten: Neuron bildete 3 AIS und ektopische Ansammlung von Ankyrin-G auf Soma. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Quantifizierung des AIS-Strukturwandels. div3-Neuronen von ANK3-E22/23f/f-Mäusen wurden mit Cre-BFP und Wildtyp 480 kDa Ankyrin-G oder 480 kDa Ankyrin-G-K2864N transfiziert. Bei 7 div wurden Neuronen fixiert und für Ankyrin-G gefärbt. Repräsentative Bilder zeigen das Ankyrin-G-Signal am AIS. Die grüne linie und die gelbe linie geben an, wo die Linie für die AIS-Intensitätsmessung gezeichnet wurde. Weiße Strichlinie umkreiste den Zellkörper des transfizierten Neurons. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. Die durchschnittliche AIS-Intensität für beide Bedingungen wird allein auf die Entfernung dargestellt und mit nicht transfizierten Zellen ausgerichtet (n =10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Montage von AIS wird von 480 kDa Ankyrin-G organisiert. Ankyrin-G hat jedoch kürzere Isoformen, die auf den AIS von Wildtyp-Neuronen abzielen können, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation von Struktur-Funktions-Analysen der AIS-Assemblierung führen kann. Hier stellen wir eine Methode mit Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die es ermöglicht, die De-novo-Assemblierung des AIS zu untersuchen. Durch transfizierend mit Cre-BFP bei 3 div eliminieren wir alle endogenen Isoformen von Ankyrin-G. Wir konnten auch 480 kDa Ankyrin-G co-transfizieren, um die Bildung von AIS zu retten. Dies ermöglicht die Untersuchung der AIS-Bildung in einem sauberen System. Durch die weitere Einführung des Banker-Kultursystems, das die Lebensfähigkeit ohne Komplikationen des Überwachstums von Gliazellen verbessert, könnten wir eine hohe Transfektionseffizienz erreichen, die uns genügend Neuronen für die quantitative Messung von AIS-Dimensionen zur Verfügung stellt.
Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll. Der erste kritische Schritt besteht darin, das beste Zeitfenster für die Transfektion in Betracht zu ziehen, das früh genug sein muss, um die Montage von AIS zu verhindern, und spät genug, um die höchste Transfektionseffizienz zu erreichen. Wir haben eine 0-div-Elektroporationstransfektion ausprobiert, die nur mit Cre-BFP eine Transfektionseffizienz von etwa 10% ergab, aber wir konnten nie 480 kDa Ankyrin-G bei 0 div transfizieren. Wir vermuten, dass es an der größe des Plasmids (ca. 20 kb) liegt. Primär kultivierte Hippocampus-Neuronen haben ein enges Fenster für die Transfektion, das zwischen 3-5 Tagen liegt. Die Anhäufung von Ankyrin-G am AIS beginnt bei 3 div. Wenn wir Cre-BFP bei 3 div transfizieren, wurde keine AIS-Bildung in transfizierten Neuronen beobachtet (Abbildung 4A). Wir konnten 10-20 Neuronen mit 480 kDa Ankyrin-G aus einem 18 mm Coverlip transfizieren. Auch für das Co-Transfektions-Rettungsexperiment muss die gesamte DNA unter demselben Promotor erzeugt werden und das Verhältnis von Cre-BFP und 480 kDa Ankyrin-G-GFP muss übereinstimmen. In diesem Experiment verwendeten wir Hühner-Beta-Aktin-Promotor.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Modifikation der Banker-Kultur. Die Banker-Kultur wurde für die Kultivierung embryonaler Rattenneuronen entwickelt. Um das empfindlichere postnatale Hippocampus-Neuron der Maus besser zu unterstützen, schließen wir einen Schritt ein, hippocampi in kleinere Stücke zu schneiden, um die Trypsinisierungseffizienz zu verbessern. Die Zugabe einer KOH-Behandlung nach der Salpetersäurebehandlung reduzierte die Toxizität der Glasdeckel weiter, die Neuronen helfen, sich besser anzuheften und zu wachsen.
Eine verbleibende Herausforderung besteht darin, das Expressionsniveau von Ankyrin-G zu kontrollieren. Ein Dosierungsscreening half, die optimale Menge an Plasmid für die Transfektion zu bestimmen. In Zukunft ist es besser, einen neuronenspezifischen Promotor zu verwenden, um das Expressionsniveau zu steuern. Die aktuelle Datenanalyse hat die Position von AIS nicht gemessen. Diese Funktion sollte in Zukunft enthalten sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Gary Banker für den Vorschlag zum neuronalen Kulturprotokoll. Diese Arbeit wird vom Howard Hughes Medical Institute, einem Stipendium des NIH und einer George Barth Geller-Professur (V.B.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
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