Detaljerte undersøkelser om myggstadier av malariaparasitter er avgjørende for å designe effektive overføringsblokkeringsstrategier. Denne protokollen demonstrerer hvordan du effektivt kan dyrke smittsomme gametocytter og deretter mate disse gametocyttene til mygg for å generere myggstadier av P. falciparum.
Malaria er fortsatt et av de viktigste folkehelseproblemene, noe som forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet. Malaria er en myggbåren sykdom som overføres gjennom en smittsom bite fra den kvinnelige Anopheles mygg. Malariakontroll vil til slutt stole på en rekke tilnærminger, som inkluderer måter å blokkere overføring til, gjennom og fra mygg. For å studere myggstadier av malariaparasitter i laboratoriet, har vi optimalisert en protokoll for å dyrke svært smittsomme Plasmodium falciparum gametocytter, et parasittstadium som kreves for overføring fra den menneskelige verten til myggvektoren. P. falciparum gametocytes modnes gjennom fem morfologisk distinkte trinn, som tar ca 1-2 uker. Gametocyttkulturen beskrevet i denne protokollen er fullført på 15 dager og er smittsomme for mygg fra dag 15-18. Disse protokollene ble utviklet for å opprettholde en kontinuerlig syklus av infeksjon kompetente gametocytter og for å opprettholde uavbrutt tilførsel av mygg stadier av parasitten. Her beskriver vi metodikken til gametocyttkulturen og hvordan man infiserer mygg med disse parasittene ved hjelp av glassmembranmatere.
Malaria er forårsaket av Plasmodium parasitter og overføres til vertebratvertene sine via smittsom bite av kvinnelige Anopheles mygg. Ifølge rapporten fra Verdens helseorganisasjon (WHO) for 2019 var det anslagsvis 405 000 dødsfall, fra totalt 228 millioner tilfeller av malaria1. De fleste malariarelaterte dødsfallene var konsentrert i den afrikanske regionen, spesielt blant barn under fem år. Mens den totale forekomsten av malaria har gått ned globalt fra 2010, har nedgangen de siste årene platået og det haster med ytterligere kontrollstrategier for å eliminere sykdommen.
Sykliske aseksuelle blodstadier av malariaparasitter forårsaker sykdomspatogenese og en liten undergruppe av disse skiller seg ut i kvinnelige og mannlige gametocytter. Plasmodium falciparum gametocytes er unike i naturen som de tar 7-10 dager å utvikle gjennom fem morfologisk distinkte stadier. Umodne gametocytter fra stadium I til IV er beslaglagt i benmargsparenchyma og forblir i stor grad fraværende fra perifersirkulasjon 2,3,4,5. Erytrocytter smittet med modne stadium V gametocytter frigjøres i blodet og sirkulerer fritt for å bli tatt opp av mygg. En gang inne i mygg midgut aktiveres gametocytter, gjennom en temperaturendring og eksponering for midgutmiljøet, forvandles til kvinnelige og mannlige gameter og begynner utviklingen av myggstadiene, som kulminerer med de smittsomnde stadiene av sporozoitter i myggspyttkjertlene6,7.
Siden Trager og Jenson8 beskrev en standardisert metode for kultur P. falciparum, studier på de aseksuelle blodstadiene har sterkt avansert. Mangelen på et pålitelig kultursystem for seksuelle stadier har imidlertid gjort det vanskelig å studere P. falciparum gametocytter, overføringsbiologi og myggstadier. De siste årene har det blitt publisert flere metoder som har hjulpet laboratorier med å etablere gametocyttkulturer9,10,11,12. Dette manuskriptet beskriver standardisert og pålitelig protokoll til kulturen P. falciparum gametocytes som kan representere en verdifull ressurs for malariaforskningssamfunnet. Denne metoden muliggjør robust produksjon av modne og smittsomme gametocytter som sammen med en standardisert myggfôringsprotokoll resulterer i svært pålitelig mygginfeksjonsevne. Disse metodene ble etablert for å opprettholde uavbrutt tilførsel av gametocytter og myggstadiumparasitter. I dette manuskriptet beskriver vi en grundig gametocyttkulturprotokoll (Figur 1), fremstilling av glassmembranmatere og infeksjon av mygg ved hjelp av disse membranmatere (figur 2), disseksjon av midgut (figur 3) og spyttkjertel av mygg (figur 4), og kvantifisering av infeksjon i mygg etter midgut og spyttkjertel disseksjon.
Metoder beskrevet her har blitt vellykket brukt ved Johns Hopkins Malaria Research Institute i mer enn 10 år15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocytter produsert ved hjelp av denne protokollen har blitt brukt til høy gjennomstrømning gametocytocidal analyser<s…
The authors have nothing to disclose.
Forfattere takker Bloomberg Philanthropies for økonomisk støtte til Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten ekspertisen fra JHMRI insekt- og parasitologikjerneanlegg.
10% Sugar solution | |||
10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
37°C Incubator | |||
50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
70% Ethanol | |||
9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
cell counter | |||
Circulating water bath | |||
fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
Glass desiccator | |||
Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
Micro Pipette | |||
Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
Mosquito cups | Neptune cups | ||
N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
Parafilm | |||
PBS | |||
Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
Pipet tips | |||
Pipetman | |||
Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
Slide warmer | |||
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
water bath | |||
Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |