Summary
I denne undersøgelse, en fodring system for nymphal og larve stadier af hård kryds blev udviklet ved hjælp af en kapsel knyttet til laboratoriet mus. Fodringskapslen er lavet af fleksible materialer og forbliver solidt fastgjort til musen i mindst en uge og giver mulighed for komfortabel overvågning af flåtfoder.
Abstract
Flåter er obligatoriske blodfodringsparasitter i alle udviklingsfaser (undtagen æg) og anerkendes som vektorer for forskellige patogener. Brugen af musemodeller i krydsforskning er afgørende for at forstå deres biologi og kryds-host-patogen interaktioner. Her demonstrerer vi en ikke-besværlig teknik til fodring af umodne stadier af hårde flåter på laboratoriemus. Fordelen ved metoden er dens enkelhed, korte varighed, og evnen til at overvåge eller indsamle flåter på forskellige tidspunkter af et eksperiment. Desuden giver teknikken mulighed for fastgørelse af to individuelle kapsler på samme mus, hvilket er gavnligt for en række forsøg, hvor to forskellige grupper af flåter er forpligtet til at fodre på det samme dyr. Den ikke-irriterende og fleksible kapsel er fremstillet af let tilgængelige materialer og minimerer ubehaget hos forsøgsdyrene. Desuden er dødshjælp ikke nødvendig, mus kommer sig helt efter forsøget og er tilgængelige til genbrug.
Introduction
Flåter er vigtige vektorer af flere patogener og udgør en alvorlig risiko for dyrs og menneskers sundhed1. Etablering af et effektivt fodringssystem er afgørende, når man studerer deres biologi, kryds-vært-patogen interaktioner, eller oprettelse af effektive kontrolforanstaltninger. I øjeblikket er flere kunstige fodringssystemer, som undgår brug af levende dyr til rådighed forflåter 2,3,4 ogdisse bør anvendes, når forsøgsbetingelserne tillader det. I forskellige forsøgsmiljøer efterligner disse systemer imidlertid ikke på passende vis de specifikke fysiologiske egenskaber, og det er nødvendigt at anvende levende dyr for at opnå relevante resultater.
Laboratoriemus er almindeligt anvendt til undersøgelse af mange biologiske systemer og anvendes rutinemæssigt som værter for fodring flåter5,,6,,7,8,9. De to mest almindelige metoder til fodring umodne flåter på mus omfatter gratis angreb og brug af indespærring kamre knyttet til musen. Gratis angreb bruges primært til larvestadier, og engorged flåter kan falde til et område, hvor de kan inddrives. Indespærring kamre er normalt består af akryl eller polypropylen hætter, som er limet til musens ryg. Den første teknik er et effektivt naturligt system til flåtfodring, men tillader ikke nøje overvågning under forsøget, fordi de enkelte flåter er spredt i forskellige dele af værtskroppen. Derudover kan engorged flåter, der falder til et genvindingsområde blive forurenet med afføring og urin10,11,,12,,13,14, der kan alvorligt påvirke flåten fitness eller de kan blive beskadiget eller spist afmusen,hvis der ikke er nogen adskillelse mellem dyret og genvindingsområdet15., Kammerbaserede systemer gør det muligt at indefænge flåter til et afgrænset område, men limningsprocessen erbesværlig,og hætterne er ofte svagt klæbende til limen, og derfor løsner de sig ofte under eksperimentet16,17,18,19. Hætterne er også stive, ubehagelige og fører til hudreaktioner, som forhindrer genbrug af musene og nødvendiggør deres dødshjælp efter forsøget.
I vores tidligere undersøgelse, vi med succes udviklet et effektivt system ved hjælp af kamre lavet af ethylen-vinyl acetat (EVA) skum til fodring flåter på laboratoriekaniner20. Heri tilpassede vi dette system til en musemodel og foreslår en enkel og ren metode til at fodre umodne hårde krydsstadier i lukkede kapsler fremstillet af EVA-skum. Specifikt bruger vores system elastiske EVA-skumkapsler limet til de barberede mus tilbage med hurtig tørring (3 min), ikke-irriterende latexlim. Denne teknik giver mulighed for fast og langvarig fastgørelse af kapsler til den eksperimentelle mus, samt effektiv flåtangreb / indsamling i løbet af hele eksperimentet. Den flade kapsel er lavet af fleksible materialer og hindrer ikke manipulation af musen til blodtapning eller andre formål. Systemet er velegnet primært til nymphal kryds faser, men med mindre ændringer kan det bruges til fodring larver så godt. Metoden kan udføres af en enkelt erfaren person, og omfattende uddannelse er ikke påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk, at denne protokol kun kan anvendes, når alle velfærds- og sikkerhedsforanstaltninger er opfyldt i laboratoriet. Denne protokol fik tilladelse til at bruge mus til tick fodring af den etiske komité for dyreforsøgComEth Anses / ENVA / UPEC, Permit Numbers E 94 046 08. Til endepunktet blev dyrene eksponeret for CO 2 i9 min i to faser af 4 og 5 min.
1. Forberedelse af kapslen
- Stik 2 mm tykt EVA-skum og det klæbende dobbeltklæbende skum sammen (Figur 1A).
- Brug en 20 mm diameter læder hul punch, skære en cirkel fra sticked skum stykker. Derefter, ved hjælp af en 12 mm diameter hulning, skære interiøret til at skabe den dobbelte skum cirkel(Figur 1B).
BEMÆRK: Kapslens rammetykkelse skal være større end 3 mm stor for at sikre tilstrækkelig overflade til limningsprocessen til værtshuden (se nedenfor). - Skræl beskyttelsesstriben fra detklæbende dobbeltklæbendeskum ( Figur 1C ) og fastgør en gennemsigtig cirkulær plast med en diameter på 20 mm ( Figur1D).
BEMÆRK: Hvis du fodrer larver, må beskyttelsespapirstrippen ikke fjernes fra det klæbende skum og flyttes direkte til trin 2 i protokollen. Lim dobbelt skumringen, herunder beskyttende papirstrimmel til musen. - Lav en ~ 1 cm slids i den gennemsigtige plast (Figur 1E).
- Der skal skabes mindst 10 små huller med en entomologisk stift (Figur 1F) for at tillade overdreven fugtfordampning under forsøget.
BEMÆRK: Kapslen (Figur 1G) har en samlet højde på 4 mm (2 mm EVA-skum sammen med 2 mm klæbende skum) og kan bruges til at fodre nymfer og larver af alle de hårde flåtarter. Kapselstørrelsen (Figur 1H) med en ydre diameter på 20 mm er egnet til de fleste musestammer, men kan om nødvendigt ændres.
2. Fremstilling af musene før flåtangreb
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 10-12 uger gamle kvindelige forsøgsmus (stamme C57BL/6 og BALB/cByJ) opretholdt i standardbure med mad og vand, der tilbydes ad libitum (Green line ventilerede stativer på -20 Pa) hos det franske agentur for fødevarer, miljø og sikkerhed (ANSES) akkrediterede dyrefaciliteter i Maisons-Alfort, Frankrig. Dyrene blev overvåget to gange dagligt af erfarne teknikere for unormale hudreaktioner, helbredsproblemer eller komplikationer.
- Bedøve mus med isofluran i induktionskammeret. Når bedøvelsen er bedøvet, skal du placere musen på manipulationspuden og fastgøre den til en næsekeve til kontinuerlig isofluranforsyning (figur 2A). Overvåg vejrtrækningshastigheden, og reducer isofluranniveauet for at sikre, at det er mindre end 80 vejrtrækninger i minuttet.
BEMÆRK: Før manipulationen skal den enkelte mus mærkes ved hjælp af tatovering eller radiofrekvensidentifikationschip, hvis det er nødvendigt. Det anbefales at holde de enkelte mus i separate bure for at undgå kapselskader ved at bide. - Barber den forreste del af musen bag skulderbladene op til området lige bag ørerne (Figur 2A).
BEMÆRK: Det barberede område skal være større end kapseloverfladen. - Påfør ikke-irriterende latex lim på hele EVA-skum stedet af den forberedte kapsel og vente i 1 min (Figur 2B).
- Lim kapslen til musen tilbage med et let 3 min konstant tryk med fingeren (e)(Figur 2C),især på venstre og højre side af kapslen. Løft kapslen en smule for visuelt at kontrollere dens fastgørelse til huden. Hvis der findes løsgængere, skal du anvende mere lim ved hjælp af en spatel og trykke på i yderligere 3 minutter.
3. Flåtangreb
- For nymfe angreb, indføre de enkelte nymfer i kapslen via snittet i trin 1.4 (Figur 2D).
BEMÆRK: For Ixodes kryds arter anbefales maksimalt 20 nymfer pr. kapsel. - Tryk kapslen lidt fra to sider for at lade den gennemsigtige plast bøje for lettere indførelse af individuelle nymfer ved hjælp af fine dissektionsforrøjelsesfrøjer (Figur 2D). Skub de enkelte nymfer via snittet inde i kapslen. Når du er inde, drej snålen i 90° og træk snålen ud for at aflejre flåter inde i kapslen.
- Ved angreb af larver skal du fjerne papirsedlen fra den påsatte kapsel (Figur 2E). Anvend sprøjten med larver(Figur 2F) direkte inde i kapslen, og aflejr flåter ved at trykke på sprøjtestemplen. Drej forsigtigt stemplet mod huden for at fjerne de resterende påsatte larver.
BEMÆRK: Læg larver i en 1 ml sprøjte med skåret ende tilsluttet af et stykke bomuld før forsøget. - Når larverne er aflejret på huden, lukkes kapslen ved at fastgøre den gennemsigtige plast (Figur 2G).
- Påfør det beskyttende plastbånd omkring kapslen( Figur 2H).
BEMÆRK: Det beskyttende plastbånd forbedrede i høj grad kapslens holdbarhed i hele forsøgets varighed (figur 2I, J). Det er muligt at fastgøre to kapsler til en enkelt mus (Figur 2K). I dette tilfælde kræves der mindst 3 mm afstand mellem kapslerne, og det barberede område skal øges på passende vis. - Aflever musene til buret.
4. Indsamling af flåter
- Bedøve musen som i trin 2.1 ovenfor.
- Lav et korsformet snit (Figur 3A) til plasten med en skalpel.
BEMÆRK: Dette krydsformede snit gør det nemt at opsamlinge engorged flåter eller afmontere fodertøderne, hvis det er nødvendigt. - Hvis det er nødvendigt, skal kapslen lukkes igen ved at sætte et klæbende plastplast plaster fast på den gennemsigtige plast (20 mm diameter, figur 3B).
BEMÆRK: Hvis der ønskes samling af flåter på flere tidspunkter, kan den samme klæbende plastplaster anvendes. Hvis protokollen kræver det, kan man også aflive musen, fjerne kapslen og samle/afmontere flåterne (Figur 3C).
5. Genopretning af musene
- Hold musene i bur i yderligere en uge.
- Lad kapslen løsne sig naturligt.
BEMÆRK: I dette tilfælde tager det ca. 8-9 dage, før kapslerne falder af. Når kapslen er fjernet, er det vigtigt at kontrollere for unormale reaktioner på huden af musene. I tilfælde af irritation anvende en blødgørende lotion, selv om normalt ingen behandling er påkrævet. Hvis den etiske protokol tillader det, kan de genvundne mus (Figur 3D) genbruges til et andet flåtangreb eller forskellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi foreslår den detaljerede trinvise metode til fodring af umodne hårde flåtstadier i EVA-skumkapsler, der påføres en mus ryg (Figur 2). Denne ikke-besværlige protokol er velegnet til forskellige typer af eksperimenter, når præcis kryds overvågning og indsamling er påkrævet. De vigtigste fordele ved denne metode er dens enkelhed, let tilgængelige omkostningseffektive materialer, og kort varighed. Desuden lykkedes det os at fastgøre to kapsler til en mus person(Figur 2K) giver os mulighed for at fodre to forskellige grupper af flåter på det samme dyr. Brugen af den yderst effektive, hurtigtørrende og ikke-irriterende latexlim sikrer, at kapslen sidder godt fast inden for 3 min. Kapslen forblev også fastgjort i mindst en uge (Figur 2J), hvilket var nok tid til engorgement af de fleste af de umodne hårde flåtarter21,22,23,24. På grund af kapslens elasticitet var yderligere manipulation af musen til blodtapning eller andre formål meget praktisk. Denne procedure giver også mulighed for fuldstændig genindvinding af musene efter forsøgene (Figur 3D), hvilket giver mulighed for at genbruge dyrene og undgå dødshjælp. Vores system er blevet anvendt til at fodre Ixodes ricinus nymfer(Figur 4). En moderat til høj engorgement succesrate blev opnået i C57BL/6 og BALB / cByJ mus stammer, henholdsvis. I begge tilfælde alle nymfer færdig fodring inden for 4 - 5 dage, mens de fleste (~ 75%) faldt af på den fjerde dag.
Figur 1: EVA-skum kapsel forberedelse. (A) Fastgørelse af EVA-skum (sort) og klæbende dobbelt klæbrig skum (hvid). BB) Skæring 20 mm i diameter ydre og 12 mm indercirkel ved hjælp af læderhulsslag. (C) Fjernelse af papirbeskyttelsesbåndet fra det klæbende dobbeltklæbende klæbrige skum. dD) Fastgørelse af den gennemsigtige plast til kapslen. (E) Skæring af slidsen i den gennemsigtige plast med en skalpel. (F)Oprettelse af huller ved hjælp af en entomologisk stift i plasten. (G-H) Skematisk tegning af de forskellige dele af kapslen og dimensioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Limning af kapslen til musene og flåtangreb. ( A) Barbering musens ryg forreste del. (B) Påføring af latex lim på EVA-skum side af kapslen. (C) Fastgørelse af kapslen til musen. DD) Placering af nymfen i kapslen via snittet i den gennemsigtige plast. (E) Skrælning af papirbeskyttelsesbåndet fra det klæbende dobbeltklæbende skum før angreb af larver. (F) Injektioner af larver inde i kapslen med en afskåret sprøjte. (G) Lukning af kapslen med den gennemsigtige plast. (H) Placering af et beskyttende plastbånd omkring kapslen. (I)Mus med vedlagte kapsel -1. (J)Mus med den tilhørende kapsel -7. (K)Mus med to kapsler fastgjort. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tick indsamling og mus opsving. aA) Skære cross-form åbning for tick indsamling. (B) Genforsegling af kapslen med klæbende plastplast. (C) Kapsel fjernelse fra en aflivet mus. Pile viser de vedhæftede flåter. (D) Genvundet mus efter faldet kapsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Engorgement succes og fodring varighed af Ixodes ricinus nymfer fodring på mus. a) Samlet procentdel af engorged nymfer i C57BL/6 og BALB/cByJ mus. BB) Varighed af nymfe engorgement i C57BL/6 og BALB/cByJ mus. De (n) numre for angrebne nymfer er 130 og 25 for 15 individuelle C57BL/6 og 5 individuelle BALB / cByJ mus, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trin i protokollen er fast limning af kapslen til musehuden. Derfor bør latexlimen påføres ensartet på hele kapslens EVA-skumoverflade, og der skal påføres konstant tryk i 3 minutter, især på venstre og højre side af kapslen. Vi anbefaler også placering af kapslen så langt frem på bagsiden som muligt for at undgå, at den fjernes af musen ved hjælp af dens bageste poter. I vores eksperimenter er kun vedhæftning af EVA-skum og latex lim til musehuden blevet valideret, og vi kan ikke garantere opnåelse af samme resultater ved hjælp af forskellige materialer.
Under vores eksperimenter blev der ikke observeret løsrivelse af kapslen fra huden inden for de første syv dage. Vi anbefaler på det kraftigste, at du beskytter kapslens yderflade ved hjælp af plastbåndet(Figur 2H). Hvis beskyttelsesbåndet er beskadiget i løbet af krydsfodring, kan det udskiftes med en ny. Kapslens diameter kan ændres til forskellige musestammestørrelser. Vi foreslår at overvåge fodring flåter mindst to gange dagligt og til at indsamle engorged flåter umiddelbart efter udstationering for at undgå deres udskænkning.
Antallet af angrebne flåter er begrænset af kapslens diameter, samt værtens størrelse. I vores eksperimenter brugte vi maksimalt 20 nymfer eller 100 larver af I. ricinus til en mus. For større størrelse flåter såsom Amblyomma eller Hyalomma sp., etc antallet af angrebne flåter bør reduceres for at undgå skade på værten fra blodtab19,26,27. Derfor er denne teknik ikke egnet til vedligeholdelse af flåtopdræt kolonier, hvor et stort antal flåter er forpligtet til at fodre. Til dette formål anbefales større værter som kaniner eller får20,27 for at reducere det samlede dyrebehov.
Vores teknik er velegnet til forskellige typer af eksperimenter, hvor en musemodel er påkrævet, og det er nødvendigt at holde flåter i lukket område for nem indsamling og / eller overvågning af deres biologiske parametre. Sammenlignet medandre teknikker 10,11,12,13,14,15,16,17,18, denne enkle protokol i høj grad reducerer den samlede anæstesi tid (ca. 5 minutter) per mus og hurtig tørring, ikke-irriterende latex lim ikke forårsager skade på dyret. Den meget klæbende EVA-skum kapsel beskytter flåt fodring område og minimerer risikoen for tabt, beskadiget, eller spist flåter som rapporteret i gratis angrebssystemer10,,11,,12,13,15. Den store fordel ved den foreslåede teknik er den flade form kapsel og dens faste langvarige tilknytning til huden giver nem manipulation med musen, hvis det kræves. Der er lagt særlig vægt på brugen af elastiske og ikke-irriterende materialer for at mindske ubehaget for forsøgsdyrene, hvilket giver mulighed for fuldstændig genindvinding af museværten efter forsøg (figur 3D).
Metoden forventes anvendt til en række forskellige forsøg, når man studerer kryds-vært-patogen interaktioner, kryds manipulation af værtsre immunforsvar, evaluering af forskellige kryds kontrolforanstaltninger eller kryds biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender den tekniske bistand fra Alain Bernier French National Institute of Agricultural Research (INRAE) og Océane Le Bidel (ANSES). Undersøgelsen blev støttet af DIM One Health - Région Île-de-France (Akronym for projektet: NeuroPaTick). Musene blev købt af ANSES. Dr. Jeffrey L. Blair er anerkendt for at gennemgå den tidligere version af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
- Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
- Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
- Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26 (2012).
- Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286 (2017).
- Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
- Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
- Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47 (2009).
- Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39 (2013).
- Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
- Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
- Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
- Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
- Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
- Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
- Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311 (2020).
