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Biology

Un modèle à base de capsules pour l’infestation immature des stades de tiques dures sur des souris de laboratoire

Published: July 9, 2020 doi: 10.3791/61430

Summary

Dans cette étude, un système d’alimentation pour les stades nymphaux et larvaires de la tique dure a été développé à l’aide d’une capsule attachée à la souris de laboratoire. La capsule d’alimentation est faite à partir de matériaux flexibles et reste fermement attachée à la souris pendant au moins une semaine et permet une surveillance confortable de l’alimentation des tiques.

Abstract

Les tiques sont des parasites d’alimentation sanguine obligatoires à tous les stades de développement (à l’exception des œufs) et sont reconnues comme vecteurs de divers agents pathogènes. L’utilisation de modèles de souris dans la recherche sur les tiques est essentielle pour comprendre leurs interactions biologie et tiques-hôtes-pathogènes. Ici, nous démontrons une technique non laborieuse pour l’alimentation des stades immatures de tiques dures sur les souris de laboratoire. L’avantage de la méthode est sa simplicité, sa courte durée et sa capacité à surveiller ou à collecter des tiques à différents moments d’une expérience. En outre, la technique permet l’attachement de deux capsules individuelles sur la même souris, ce qui est bénéfique pour une variété d’expériences où deux groupes différents de tiques sont nécessaires pour se nourrir sur le même animal. La capsule non irritante et flexible est faite à partir de matériaux facilement accessibles et minimise l’inconfort des animaux expérimentaux. En outre, l’euthanasie n’est pas nécessaire, les souris récupèrent complètement après l’expérience et sont disponibles pour une réutilisation.

Introduction

Les tiques sont des vecteurs importants de plusieurs agents pathogènes et représentent un risque sérieux pour la santé animale et humaine1. La mise en place d’un système d’alimentation efficace est cruciale pour étudier leur biologie, les interactions tiques-hôte-pathogènes ou l’établissement de mesures de contrôle efficaces. Actuellement, plusieurs systèmes d’alimentation artificielle, qui évitent l’utilisation d’animaux vivants sont disponibles pour les tiques2,,3,4 et ceux-ci devraient être utilisés chaque fois que les conditions expérimentales le permettent. Cependant, dans divers contextes expérimentaux, ces systèmes ne parviennent pas à imiter de manière appropriée les caractéristiques physiologiques spécifiques et l’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour obtenir des résultats pertinents.

Les souris de laboratoire sont couramment utilisées pour l’étude de nombreux systèmes biologiques et sont couramment utilisées comme hôtes pour nourrir les tiques5,,6,7,8,9. Les deux méthodes les plus courantes pour nourrir les tiques immatures sur les souris comprennent les infestations libres et l’utilisation de chambres de confinement attachées à la souris. Les infestations gratuites sont principalement utilisées pour les stades larvaires et les tiques engorgées peuvent tomber dans une zone où elles peuvent être récupérées. Les chambres de confinement sont généralement composées de bouchons acryliques ou en polypropylène qui sont collés au dos de la souris. La première technique est un système naturel efficace pour l’alimentation des tiques, mais ne permet pas une surveillance étroite au cours de l’expérience parce que les tiques individuelles sont dispersées dans différentes parties du corps hôte. En outre, les tiques engorgées qui tombent à une zone de récupération peuvent être contaminées par des excréments et de l’urine10,11,12,13,14 qui peuvent gravement affecter la condition physique de la tique ou ils peuvent être endommagés ou mangés par la souris s’il n’y a pas de séparation entre l’animal et la zone de récupération15. Les systèmes de chambre permettent le confinement des tiques à une zone définie, cependant, le processus de collage est laborieux et les bouchons sont souvent faiblement adhérents à la colle et donc ils se détachent souvent au cours de l’expérience16,17,18,19. Les bouchons sont également raides, inconfortables, et conduisent à des réactions cutanées, qui empêchent la réutilisation des souris et nécessite leur euthanasie après l’expérience.

Dans notre étude précédente, nous avons développé avec succès un système efficace utilisant des chambres faites de mousse d’acétate d’éthylène-vinyle (EVA) pour nourrir les tiques sur les lapins de laboratoire20. Ici, nous avons adapté ce système à un modèle de souris et proposons une méthode simple et propre pour nourrir les stades immatures de tiques dures dans des capsules fermées à base de mousse EVA. Plus précisément, notre système utilise des capsules élastiques en mousse EVA collées aux souris rasées avec séchage rapide (3 min), colle en latex non irritante. Cette technique permet une fixation ferme et durable des capsules à la souris expérimentale, ainsi qu’une infestation/collecte efficace des tiques pendant tout le cours de l’expérience. La capsule plate est faite de matériaux flexibles et n’empêche pas la manipulation de la souris à des fins de collecte de sang ou à d’autres fins. Le système convient principalement aux stades de tique nymphé, mais avec une légère modification, il peut être utilisé pour nourrir les larves ainsi. La méthode peut être complétée par une seule personne expérimentée et une formation approfondie n’est pas nécessaire.

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Protocol

Veuillez noter que ce protocole ne peut être appliqué que lorsque toutes les mesures de bien-être et de sécurité sont respectées en laboratoire. Ce protocole a reçu l’autorisation d’utiliser des souris pour l’alimentation des tiques par le Comité d’éthique des expériences animalesCometh Anses/ENVA/UPEC, Numéros de permis E 94 046 08. Pour le point d’évaluation, les animaux ont été exposés au CO2 pendant 9 min en deux phases de 4 et 5 min chacun.

1. Préparation de la capsule

  1. Coller 2 mm d’épaisseur EVA-mousse et l’adhésif double mousse collante ensemble (Figure 1A).
  2. À l’aide d’un poinçon de trou en cuir de 20 mm de diamètre, couper un cercle des morceaux de mousse collés. Puis, à l’aide d’un poinçon trou de 12 mm de diamètre, couper l’intérieur pour créer le cercle de mousse double (Figure 1B).
    REMARQUE : L’épaisseur du cadre de la capsule doit être supérieure à 3 mm pour garantir une surface suffisante pour le processus de collage à la peau hôte (voir ci-dessous).
  3. Peler la bande de papier protectrice de la mousse double collante adhésive (figure 1C)et fixer un plastique circulaire transparent de 20 mm de diamètre (figure 1D).
    REMARQUE : Si vous nourrissez des larves, n’retirez pas la bande de papier protectrice de la mousse adhésive et passez directement à l’étape 2 du protocole. Collez l’anneau de mousse double, y compris la bande de papier de protection à la souris.
  4. Faire une fente ~ 1 cm dans le plastique transparent (Figure 1E).
  5. Créer au moins 10 petits trous avec une goupille entomologique (Figure 1F) pour permettre une évaporation excessive de l’humidité pendant l’expérience.
    REMARQUE : La capsule(figure 1G)a une hauteur totale de 4 mm (mousse EVA de 2 mm avec mousse adhésive de 2 mm) et peut être utilisée pour nourrir les nymphes et les larves de toutes les espèces de tiques dures. La taille de la capsule (figure 1H)de 20 mm de diamètre extérieur convient à la plupart des souches de souris, mais peut être modifiée si nécessaire.

2. Préparation des souris avant l’infestation de tiques

NOTE: Dans cette étude, 10 à 12 semaines de souris expérimentales femelles (souche C57BL/6 et BALB/cByJ) ont été maintenues dans des cages standard avec de la nourriture et de l’eau offertes ad libitum (supports ventilés à la ligne verte à -20 Pa) à l’Agence Français pour l’alimentation, l’environnement et la santé et la sécurité au travail (ANSES) installations d’animaux accrédités à Maisons-Alfort, France. Les animaux ont été surveillés deux fois par jour par des techniciens expérimentés pour toute réaction cutanée anormale, problèmes de santé ou complications.

  1. Souris anesthésiante avec isoflurane dans la chambre d’induction. Une fois anesthésié, placez la souris sur le tampon de manipulation et attachez-les à un cône de nez pour l’approvisionnement continu en isoflurane (Figure 2A). Surveiller le taux de respiration et réduire le niveau d’isoflurane pour s’assurer qu’il est inférieur à 80 respirations par minute.
    REMARQUE : Avant la manipulation, étiqueter la souris individuelle par une puce d’identification par tatouage ou par radiofréquence si nécessaire. Il est recommandé de garder les souris individuelles dans des cages séparées pour éviter les dommages causés par les capsules en mordant.
  2. Raser la partie antérieure de la souris de derrière les omoplates jusqu’à la zone juste derrière les oreilles (Figure 2A).
    REMARQUE : La surface rasée doit être supérieure à la surface de la capsule.
  3. Appliquer de la colle en latex non irritante sur l’ensemble du site de mousse EVA de la capsule préparée et attendre 1 min (figure 2B).
  4. Collez la capsule à la souris en arrière par légère pression constante de 3 min avec le doigt (s)(figure 2C),en particulier sur le côté gauche et droit de la capsule. Soulevez légèrement la capsule pour vérifier visuellement son attachement à la peau. Si des régions non attachées sont trouvées, appliquez plus de colle à l’aide d’une spatule et appuyez encore 3 minutes.

3. Infestation de tiques

  1. Pour l’infestation de nymphes, introduisez les nymphes individuelles dans la capsule par la coupe faite à l’étape 1.4 (Figure 2D).
    REMARQUE : Pour les espèces de tiques Ixodes, un maximum de 20 nymphes est recommandé par capsule.
  2. Presser légèrement la capsule de deux côtés pour permettre au plastique transparent de se plier pour faciliter l’introduction de nymphes individuelles à l’aide de forceps de dissection fine (Figure 2D). Poussez les nymphes individuelles par la coupe à l’intérieur de la capsule. Une fois à l’intérieur, tournez les forceps à 90° et retirez les forceps pour déposer les tiques à l’intérieur de la capsule.
  3. Pour les larves infestation enlever le glissement de papier de la capsule attachée (Figure 2E). Placez la seringue, contenant des larves (figure 2F),directement à l’intérieur de la capsule et déposez les tiques en poussant le piston de seringue. Tournez doucement le piston vers la peau pour enlever les larves restantes attachées.
    REMARQUE : Placez les larves dans une seringue de 1 mL avec l’extrémité coupée colmatée par un morceau de coton avant l’expérience.
  4. Une fois que les larves sont déposées sur la peau, fermez la capsule en attachant le plastique transparent (figure 2G).
  5. Appliquer la bande de plastique protectrice autour de la capsule (Figure 2H).
    REMARQUE : La bande en plastique protectrice a grandement amélioré la durabilité de la capsule pendant toute la durée de l’expérience (Figure 2I,J). Il est possible d’attacher deux capsules à une souris individuelle (Figure 2K). Dans ce cas, un minimum de 3 mm d’espace entre les capsules est nécessaire et la zone rasée doit être augmentée de manière appropriée.
  6. Retournez les souris dans la cage.

4. Collection de tiques

  1. Anesthésiez la souris comme à l’étape 2.1 ci-dessus.
  2. Faire une coupe en forme de croix (Figure 3A) au plastique avec un scalpel.
    REMARQUE : Cette coupe en forme de croix permet une collecte facile des tiques engorgées ou du détachement des tiques d’alimentation si nécessaire.
  3. Si nécessaire, reclusez la capsule en collant un patch en plastique adhésif sur le plastique transparent (diamètre de 20 mm, figure 3B).
    REMARQUE : Si la collecte des tiques à plusieurs points de temps est souhaitée, le même patch en plastique collant peut être utilisé. Si le protocole l’exige, on peut également euthanasier la souris, enlever la capsule et collecter/détacher les tiques (figure 3C).

5. Récupération des souris

  1. Gardez les souris en cage pendant une semaine supplémentaire.
  2. Laissez la capsule se détacher naturellement.
    NOTE: Dans ce cas, il faut environ 8-9 jours pour que les capsules tombent. Lorsque la capsule est enlevée, il est important de vérifier les réactions anormales sur la peau des souris. En cas d’irritation appliquer une lotion émollient, bien que normalement aucun traitement n’est nécessaire. Si le protocole éthique le permet, les souris récupérées (Figure 3D) peuvent être réutilisées pour une autre infestation de tiques ou différentes expériences.

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Representative Results

Nous proposons la méthode détaillée étape par étape pour nourrir les stades immatures de tiques dures dans des capsules de mousse EVA appliquées sur le dos d’une souris (figure 2). Ce protocole non laborieux convient à différents types d’expériences lorsque la surveillance et la collecte précises des tiques sont nécessaires. Les principaux avantages de cette méthode sont sa simplicité, ses matériaux facilement accessibles et rentables et sa courte durée. En outre, nous avons réussi à attacher deux capsules à un individu souris (Figure 2K) nous permettant de nourrir deux groupes différents de tiques sur le même animal. L’utilisation de la colle en latex très efficace, à séchage rapide et non irritante garantit que la capsule est fermement fixée dans les 3 min. En outre, la capsule est restée attachée pendant au moins une semaine (figure 2J) qui était assez de temps pour l’engorgement de la plupart des espèces immatures de tiques dures21,22,23,24. En raison de l’élasticité de la capsule, une manipulation supplémentaire de la souris pour la collecte de sang ou d’autres fins était très pratique. Cette procédure permet également la récupération complète des souris après les expériences (Figure 3D) donnant la possibilité de réutiliser les animaux et d’éviter l’euthanasie. Notre système a été utilisé avec succès pour nourrir les nymphes d’Ixodes ricinus (Figure 4). Un taux de réussite modéré à élevé a été atteint dans les souches de souris C57BL/6 et BALB/cByJ, respectivement. Dans les deux cas, toutes les nymphes ont terminé l’alimentation dans un délai de 4 à 5 jours, tandis que la majorité (~75%) déposé le quatrième jour.

Figure 1
Figure 1 : Préparation de capsules en mousse EVA. (A) Fixation de mousse EVA (noir) et de mousse double collante (blanche). (B) Coupe extérieure de 20 mm de diamètre et cercle intérieur de 12 mm à l’aide de poinçons de trou en cuir. (C) Retrait du ruban de protection du papier de la mousse double collante adhésive. (D) Fixation du plastique transparent à la capsule. (E) Couper la fente dans le plastique transparent à l’aide d’un scalpel. (F) Création de trous à l’aide d’une broche entomologique dans le plastique. (G-H) Dessin schématique des différentes parties de la capsule et des dimensions. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Coller la capsule aux souris et l’infestation de tiques. (A) Partie antérieure arrière de la souris de rasage. (B) Application de la colle en latex sur le côté EVA-mousse de la capsule. (C) Fixation de la capsule à la souris. (D) Placer la nymphe dans la capsule via la coupe dans le plastique transparent. (E) Éplucher le ruban de protection du papier de la mousse adhésife double collante avant l’infestation des larves. (F) Injections de larves à l’intérieur de la capsule à l’aide d’une seringue coupée. (G) Fermeture de la capsule avec le plastique transparent. (H) Placer une bande de plastique protectrice autour de la capsule. (I) Souris avec la capsule ci-jointe -1er jour. (J) Souris avec la capsule ci-jointe -7ème jour. (K) Souris avec deux capsules attachées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Collecte des tiques et récupération de souris. (A) Ouverture transversale de coupe pour la collecte de tiques. (B) Rescellement de la capsule avec patch en plastique adhésif. (C) Retrait de capsule d’une souris euthanasiée. Les flèches montrent les tiques attachées. (D) Souris récupérée après avoir déposé la capsule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Succès engorgement et durée d’alimentation des nymphes d’Ixodes ricinus se nourrissant de souris. (A) Pourcentage total de nymphes engorgées chez les souris C57BL/6 et BALB/cByJ. (B) Durée de l’engorgement nymphe chez les souris C57BL/6 et BALB/cByJ. Les (n) nombres pour les nymphes infestées sont de 130 et 25 pour 15 souris C57BL/6 et 5 souris balb/cByJ individuelles, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L’étape la plus critique dans le protocole est le collage ferme de la capsule à la peau de la souris. Par conséquent, la colle en latex doit être appliquée homogénéirement à toute la surface eva-mousse de la capsule et une pression constante pendant 3 minutes doit être appliquée, en particulier sur le côté gauche et droit de la capsule. Nous recommandons également le placement de la capsule aussi loin vers l’avant sur le dos que possible pour éviter son enlèvement par la souris en utilisant ses pattes arrière. Dans nos expériences, seule l’adhérence de la colle EVA-mousse et latex à la peau de la souris a été validée et nous ne pouvons pas garantir la réalisation des mêmes résultats en utilisant différents matériaux.

Au cours de nos expériences, le détachement de la capsule de la peau dans les sept premiers jours n’a pas été observé. Nous recommandons fortement de protéger la surface extérieure de la capsule à l’aide de la bande en plastique (Figure 2H). Si la bande protectrice est endommagée au cours de l’alimentation des tiques, elle peut être remplacée par une nouvelle. Le diamètre de la capsule peut être modifié pour différentes tailles de souche de souris. Nous suggérons de surveiller les tiques d’alimentation au moins deux fois par jour et de recueillir les tiques engorgées immédiatement après le détachement pour éviter leur dessiccation.

Le nombre de tiques infestées est limité par le diamètre de la capsule, ainsi que par la taille de l’hôte. Dans nos expériences, nous avons utilisé un maximum de 20 nymphes ou 100 larves de I. ricinus pour une souris. Pour les tiques de plus grande taille telles amblyomma ou Hyalomma sp., etc le nombre de tiques infestées devrait être réduit pour éviter de nuire à l’hôte de la perte de sang19,26,27. Par conséquent, cette technique ne convient pas au maintien des colonies d’élevage de tiques, où un grand nombre de tiques sont nécessaires pour se nourrir. À cette fin, les grands hôtes comme les lapins ou les moutons sont recommandés20,27 pour réduire les besoins globaux des animaux.

Notre technique convient à divers types d’expériences où un modèle de souris est nécessaire, et il est nécessaire de garder les tiques dans la zone fermée pour une collecte facile et / ou la surveillance de leurs paramètres biologiques. Par rapport à d’autres techniques10,11,12,13,14,15,16,17,18, ce protocole simple réduit considérablement le temps d’anesthésie globale (environ 5 minutes) par souris et le séchage rapide, colle en latex non irritant ne cause pas de dommages à l’animal.18 La capsule de mousse EVA hautement adhésive protège la zone d’alimentation des tiques et minimise le risque de tiques perdues, endommagées ou consommées, comme indiqué dans les systèmes d’infestation libre10,,11,12,13,15. Le grand avantage de la technique proposée est la capsule en forme plate et son attachement ferme et durable à la peau permettant une manipulation facile avec la souris si nécessaire. Une attention particulière a été accordée à l’utilisation de matériaux élastiques et non irritants pour réduire l’inconfort des animaux expérimentaux permettant la récupération complète de l’hôte de la souris après l’expérience (Figure 3D).

On s’attend à ce que la méthode soit utilisée pour une variété d’expériences lors de l’étude des interactions tick-host-pathogen, de la manipulation des tiques du système immunitaire de l’hôte, de l’évaluation de différentes mesures de contrôle des tiques ou de la biologie des tiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous reconnaissons l’assistance technique d’Alain Bernier Français’Institut national de la recherche agronomique (INRAE) et d’Océane Le Bidel (ANSES). L’étude a été soutenue par le DIM One Health - Région Île-de-France (Acronyme du projet: NeuroPaTick). Les souris ont été achetées par l’ANSES. Le Dr Jeffrey L. Blair est reconnu pour avoir examiné la version antérieure du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVA-foam 2 mm thick, (low density) Cosplay Shop EVA-45kg (950/450/2 mm) It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD)
Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches Amazon B0848S3S6T Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon.
Mice BALB/cByJ Charles River Strain code 627
Mice C57BL/6 Charles River Strain code 664
No-toxic Latex Glue Tear mender Fabric & Leather Adhesive Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU)
Punch Tool Hand Art Tool Amazon B07QPWNGBF Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap
PVC Binding Covers Transparent Amazon B078BNLSNP Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable
Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape Amazon B07RHDZ35J Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam
Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) Amazon B01DAA6X66

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Mateos-Hernández, L., Rakotobe, S., Defaye, B., Cabezas-Cruz, A., Šimo, L. A Capsule-Based Model for Immature Hard Tick Stages Infestation on Laboratory Mice. J. Vis. Exp. (161), e61430, doi:10.3791/61430 (2020).

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