Summary
이 연구에서는 실험실 마우스에 부착된 캡슐을 사용하여 하드 틱의 님프및 애벌레 단계를 위한 먹이 시스템이 개발되었습니다. 수유 캡슐은 유연한 재료로 만들어졌으며 적어도 일주일 동안 마우스에 단단히 부착되어 있어 진드기 공급에 대한 편안한 모니터링을 가능하게 합니다.
Abstract
진드기는 발달의 모든 단계에서 의무적인 혈액 공급 기생충 (계란 제외) 및 각종 병원체의 벡터로 인식됩니다. 진드기 연구에서 마우스 모델의 사용은 그들의 생물학 및 진드기 호스트 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 중요합니다. 여기서 우리는 실험실 마우스에 단단한 진드기의 미숙한 단계의 공급에 대한 비 힘든 기술을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 단순성, 짧은 기간 및 실험의 다른 시점에서 진드기를 모니터링하거나 수집하는 기능입니다. 또한, 이 기술은 동일한 마우스에 두 개의 개별 캡슐을 부착할 수 있으며, 이는 두 개의 서로 다른 진드기 그룹이 동일한 동물에게 먹이를 주도록 요구되는 다양한 실험에 유익합니다. 자극적이지 않고 유연한 캡슐은 쉽게 접근할 수 있는 재료로 만들어졌으며 실험 동물의 불편함을 최소화합니다. 더욱이, 안락사는 필요하지 않으며, 마우스는 실험 후에 완전히 회복되고 재사용이 가능합니다.
Introduction
진드기는 몇몇 병원체의 중요한 벡터이고 동물과 인간 건강에 심각한 리스크를 나타냅니다1. 효과적인 공급 시스템을 설정하는 것은 생물학, 진드기 숙주 병원체 상호 작용을 연구하거나 효과적인 통제 조치를 수립할 때 중요합니다. 현재, 살아있는 동물의 사용을 피하는 몇몇 인공 공급 시스템은 진드기2,,3,,4에 유효하며 실험 조건이 허용할 때마다 활용되어야 합니다. 그러나, 다양한 실험 환경에서 이러한 시스템은 특정 생리적 특징을 적절히 모방하지 못하며 살아있는 동물의 사용은 관련 결과를 얻기 위해 필요하다.
실험실 마우스는 일반적으로 많은 생물학적 시스템의 연구에 사용되며 정기적으로 진드기 를 공급하기위한 호스트로활용5,,6,,7,,8,,9. 마우스에 미숙한 진드기를 공급하는 두 가지 가장 일반적인 방법은 무료 감염과 마우스에 부착 된 감금 챔버의 사용을 포함한다. 무료 감염은 주로 애벌레 단계에 사용되며, engorged 진드기는 복구 할 수있는 영역으로 떨어질 수 있습니다. 감금 챔버는 일반적으로 마우스의 뒷면에 붙어 아크릴 또는 폴리 프로필렌 캡으로 구성되어 있습니다. 첫 번째 기술은 진드기 공급에 효과적인 자연 시스템이지만 개별 진드기가 숙주 신체의 다른 부분에 분산되기 때문에 실험 중에 면밀한 모니터링을 허용하지 않습니다. 또한, 회복부위에 떨어뜨리는 진드기는 대변과,,소변(10,11,12,,13,,14)으로 오염되어 진드기의 체력에 심각한 영향을 미칠 수 있거나 동물과 회복영역(15)의 분리가 없는 경우 마우스에 의해 손상되거나 먹을 수 있다.15 챔버 기반 시스템은 정의된 영역에 진드기의 감금을 허용하지만, 접착제 공정은 힘들고 캡은 종종 접착제를 약하게 부착하여 실험16,,17,,18,,19동안 종종 분리된다. 캡은 또한 뻣뻣하고 불편하며 피부 반응으로 이어지므로 마우스의 재사용을 방지하고 실험 후 안락사를 필요로합니다.
이전 연구에서는 실험실 토끼20에진드기를 먹이기 위한 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA) 폼으로 만든 챔버를 사용하여 효과적인 시스템을 성공적으로 개발했습니다. 본 원에서, 우리는 마우스 모델에이 시스템을 적응하고 EVA-폼으로 만든 폐쇄 캡슐에 미숙한 하드 틱 단계를 공급하는 간단하고 깨끗한 방법을 제안한다. 특히, 당사시스템은 면도된 마우스에 접착된 탄성 EVA-foam 캡슐을 빠른 건조(3분) 비자극성 라텍스 접착제로 사용합니다. 이 기술은 실험 마우스에 캡슐의 단단하고 오래 지속되는 부착뿐만 아니라 실험의 전체 과정에서 효과적인 진드기 감염 / 수집을 할 수 있습니다. 플랫 캡슐은 유연한 재료로 만들어졌으며 혈액 수집 또는 기타 목적을 위해 마우스조작을 방해하지 않습니다. 이 시스템은 주로 님프 틱 단계에 적합하지만 약간의 수정으로 유충을 먹이는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 경험이 풍부한 한 사람이 완료 할 수 있으며 광범위한 교육이 필요하지 않습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 실험실에서 모든 복지 및 안전 조치를 충족할 때만 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동물 실험에 대한 윤리위원회에 의해 진드기 공급에 마우스를 사용하는 권한을 받았다ComEth Anses / ENVA / UPEC, 허가 번호 E 94 046 08. 종점에 대해, 동물들은 각각 4분과 5분의 2단계로 9분 동안CO2에 노출되었다.
1. 캡슐 의 준비
- 2mm 두께의 EVA 폼과 접착제 더블 끈적 끈적한 거품을 함께 붙입니다(그림1A).
- 20mm 직경의 가죽 홀 펀치를 사용하여 스틱 폼 조각에서 원을 자른다. 이어서, 직경 12mm의 구멍 펀치를 사용하여 내부를 잘라 이중 폼원(도 1B)을만듭니다.
참고: 캡슐의 프레임 두께는 3mm 이상의 크기로 숙주 피부에 접착 공정에 충분한 표면을 보장해야 합니다(아래 참조). - 접착제 이중 끈적 끈적한폼(도 1C)에서보호 용지 스트립을 껍질을 벗기고 직경 20mm(도1D)의투명한 원형 플라스틱을 부착합니다.
참고: 유충을 먹이는 경우 접착제 폼에서 보호 용지 스트립을 제거하고 프로토콜의 2단계로 직접 이동하지 마십시오. 보호 용지 스트립을 포함하여 이중 폼 링을 마우스에 붙입니다. - 투명 플라스틱에 ~ 1cm 슬릿을만듭니다(그림 1E).
- 실험 중에 과도한 수분 증발을 허용하기 위해 곤충학적핀(도 1F)으로최소 10개의 작은 구멍을 생성합니다.
참고:캡슐(도 1G)은총 높이 4mm(2mm EVA-foam와 2mm 접착제 폼)를 가지며 모든 하드 틱 종의 님프와 애벌레를 공급하는 데 사용할 수 있습니다. 캡슐크기(도 1H)의20mm 외경은 대부분의 마우스 균주에 적합하지만 필요한 경우 수정할 수 있습니다.
2. 진드기 감염 전에 마우스의 준비
참고: 이 연구에서는 10-12주 된 여성 실험 마우스(균주 C57BL/6 및 BALB/cByJ)는 ad libitum 프랑스 식품, 환경 및 산업 보건 및 안전 기구(ANSES)의 프랑스 식품, 환경 및 산업 보건 및 안전 기관에서 음식과 물을 제공하는 표준 케이지에서 유지되었습니다( ANSES) 프랑스 식품, 환경 및 직업 건강 및 안전(ANSES) 공인 동물 시설. 동물은 어떤 이상한 피부 반응, 건강 문제 또는 합병증을 위해 경험이 풍부한 기술자에 의해 매일 두 번 감시되었습니다.
- 유도 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시합니다. 일단 마취되면, 조작 패드에 마우스를 배치하고 연속 이소플루란 공급(도 2A)에대한 코 콘에 부착. 호흡 속도를 모니터링하고 이소플루란 수준을 줄여 분당 80회 미만의 호흡을 보장합니다.
참고: 조작 전에 필요한 경우 문신 또는 무선 주파수 식별 칩을 사용하여 개별 마우스에 레이블을 지정합니다. 물린 캡슐 손상을 피하기 위해 개별 마우스를 별도의 케이지에 보관하는 것이 좋습니다. - 어깨 블레이드 뒤에서 귀 바로 뒤에 있는 영역까지 마우스의 전방 부분을 면도합니다(그림2A).
참고: 면도 영역은 캡슐 표면보다 커야 합니다. - 준비된 캡슐의 전체 EVA-foam 부위에 자극적이지 않은 라텍스 접착제를 바르고 1분(도2B)을기다립니다.
- 특히 캡슐의 왼쪽과 오른쪽에 손가락(2C)을 사용하여 캡슐을Figure 2C마우스에 약간의 3분 일정한 압력으로 접착합니다. 캡슐을 약간 들어 올려 피부에 부착된 것을 시각적으로 확인합니다. 부착되지 않은 영역이 발견되면 주걱을 사용하여 더 많은 접착제를 바르고 3분 동안 누릅니다.
3. 진드기 감염
- 님프 감염의 경우, 1.4 단계(도 2D)에서만든 컷을 통해 캡슐에 개별 님프를 소개합니다.
참고: 익소드 진드기 종의 경우 캡슐 1개당 최대 20개의 님프를 권장합니다. - 투명 플라스틱이 미세 해부 집게(도 2D)를사용하여 개별 님프의 쉽게 도입 할 수 있도록 약간 양쪽에서 캡슐을 짜내. 캡슐 내부의 컷을 통해 개별 님프를 밀어 넣습니다. 일단 안으로 들어가면 집게를 90°로 돌리고 집게를 꺼내 캡슐 내부의 진드기를 빼냅니다.
- 애벌레 감염의 경우 부착된캡슐(도 2E)에서종이 전표를 제거합니다. 주사기를 밀어 캡슐 내부에 애벌레(도2F)를함유한 주사기를 직접 놓고 주사기 플런저를 밀어 내기를 한다. 플런저를 피부 쪽으로 부드럽게 돌려 나머지 애벌레를 제거합니다.
참고: 실험 전에 면 조각에 의해 연결 된 절단 끝1 mL 주사기에 애벌레를 배치 합니다. - 애벌레가 피부에 증착되면 투명플라스틱(도 2G)을부착하여 캡슐을 닫습니다.
- 캡슐 주위에 보호 플라스틱 밴드를 적용(그림 2H).
참고 : 보호 플라스틱 밴드는 실험의 전체 기간 동안 캡슐의 내구성을 크게 향상(도 2I, J). 하나의 개별마우스(도 2K)에2개의 캡슐을 부착할 수 있습니다. 이 경우 캡슐 사이의 최소 3mm 공간이 필요하며 면도 영역을 적절하게 늘려야 합니다. - 마우스를 케이지로 되돌려 놓습니다.
4. 진드기 컬렉션
- 위의 단계 2.1에서와 같이 마우스를 마취시화합니다.
- 메스가 있는 플라스틱에 십자가 모양의컷(그림 3A)을만듭니다.
참고: 이 교차 모양의 컷은 필요한 경우 먹이 진드기의 간편한 수집 또는 먹이 진드기의 분리를 가능하게 합니다. - 필요한 경우 투명 플라스틱(직경 20mm, 도 3B)에접착제 플라스틱 패치를 부착하여 캡슐을 다시 닫습니다.
참고: 여러 시간 지점에서 진드기 를 수집하는 것이 원하는 경우 동일한 끈적끈적한 플라스틱 패치를 사용할 수 있습니다. 프로토콜이 필요한 경우, 하나는 마우스를 안락사시키고 캡슐을 제거하고진드기(도 3C)를수집/분리할 수도 있다.
5. 마우스의 회복
- 마우스를 1주일 더 케이지에 보관하십시오.
- 캡슐을 자연적으로 분리하십시오.
참고 : 이 경우 캡슐이 떨어지기까지 약 8-9 일이 걸립니다. 캡슐을 제거하면 마우스의 피부에 비정상적인 반응을 확인하는 것이 중요합니다. 자극의 경우 일반적으로 치료가 필요하지 않지만 연화제 로션을 적용합니다. 윤리적 프로토콜이 허용하는 경우, 회수된마우스(도 3D)는다른 진드기 감염 또는 상이한 실험에 대해 재사용될 수 있다.
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Representative Results
마우스 뒷면에 적용된 EVA-foam 캡슐에서 미숙한 하드 틱 스테이지를 공급하기 위한 상세한 단계별 방법을 제안합니다(그림2). 이 비힘든 프로토콜은 정밀한 진드기 모니터링 및 수집이 필요할 때 다양한 유형의 실험에 적합합니다. 이 방법의 주요 장점은 단순성, 쉽게 접근 할 수있는 비용 효율적인 재료 및 짧은 기간입니다. 또한, 동일한 동물에 두 개의 서로 다른 진드기 그룹을 공급할 수 있도록 한 마우스개인(도 2K)에2개의 캡슐을 부착하는 데 성공했습니다. 매우 효과적이고 빠른 건조 및 자극적이지 않은 라텍스 접착제를 사용하면 캡슐이 3 분 이내에 단단히 부착됩니다. 또한, 캡슐은 미성숙 하드 진드기 종21,22,,23,,24의대부분을 기르기에 충분한 시간이었다 적어도 일주일(도 2J)에부착 남아 있었다., 캡슐 탄성으로 인해 혈액 수집 또는 기타 목적을 위해 마우스를 추가로 조작하는 것이 매우 편리했습니다. 이 절차는 또한 실험 후 마우스의 완전한 회복을 허용(도 3D)동물을 재사용하고 안락사를 피할 수있는 기회를 제공. 우리의 시스템은 성공적으로 익소드 리시누스 님프(그림 4)를공급하는 데 사용되었습니다. C57BL/6 및 BALB/cByJ 마우스 균주에서 각각 중등도에서 높은 성공률을 달성했습니다. 두 경우 모두 모든 님프가 4 - 5 일 이내에 수유를 마쳤으며 대다수 (~75 %)가 4일째 하차했다.
그림 1: EVA-폼 캡슐 제제. (A)EVA 폼(블랙)과 접착제 이중 끈적끈적한 폼(화이트)의 부착. (B)가죽 구멍 펀치를 사용하여 직경 20mm 바깥쪽과 12mm 이너 서클을 절단합니다. (C)접착제 이중 끈적끈적한 거품으로부터 용지 보호 테이프를 제거합니다. (D)캡슐에 투명 플라스틱의 부착. (E)메스가 있는 투명 플라스틱의 슬릿을 절단합니다. (F)플라스틱에 곤충학적 핀을 사용하여 구멍의 생성. (G-H) 캡슐과 치수의 다른 부분의 회로도 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 캡슐을 마우스에 접착하고 진드기 감염. (A) 면도 마우스의 뒤쪽 전방 부분.(B)캡슐의 EVA-foam 측에 라텍스 접착제의 적용. (C)마우스에 캡슐의 부착. (D)투명 플라스틱의 컷을 통해 캡슐에 님프를 배치합니다. (E)애벌레 감염 전에 접착제 이중 끈적 끈적한 거품으로부터 용지 보호 테이프를 벗기는. (F)컷 주사기를 사용하여 캡슐 내부의 애벌레 주사. (G)투명 플라스틱으로 캡슐을 닫습니다. (H)캡슐 주위에 보호 플라스틱 밴드를 배치. (I)부착 된 캡슐마우스 - 1st day. (J)부착 된 캡슐마우스 - 7일. (K)두 캡슐이 부착 된 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 진드기 수집 및 마우스 복구. (A)틱 컬렉션의 교차 모양 개구부를 절단합니다. (B)접착제 플라스틱 패치로 캡슐을 재밀봉. (C)안락사 마우스에서 캡슐 제거. 화살표는 연결된 진드기를 표시합니다. (D)캡슐을 떨어뜨린 후 마우스를 회수했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 쥐에게 먹이를 주는 익소드 리시누스 님프의 성공과 먹이 주기 지속 시간. (A)C57BL/6 및 BALB/cByJ 마우스에서 잉어된 님프의 총 백분율. (B)C57BL/6 및 BALB/cByJ 마우스에서 님프 옹기의 지속. 감염된 님프의 (n) 숫자는 각각 15개의 개별 C57BL/6 및 5개의 개별 BALB/cByJ 마우스에 대해 각각 130 및 25입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 캡슐을 마우스 피부에 단단히 붙이는 것입니다. 따라서 라텍스 접착제는 캡슐의 전체 EVA-foam 표면에 균질하게 적용되어야 하며 3분 동안 일정한 압력을 가해야 하며, 특히 캡슐의 왼쪽과 오른쪽에 적용되어야 한다. 또한 후면 발을 사용하여 마우스에 의한 제거를 피하기 위해 가능한 한 앞으로 캡슐을 배치하는 것이 좋습니다. 실험에서 EVA 폼과 라텍스 접착제가 마우스 피부에 부착된 것만 검증되었으며, 다양한 재료를 사용하여 동일한 결과의 달성을 보장할 수 없습니다.
우리의 실험 도중, 첫번째 7 일 안에 피부에서 캡슐의 분리는 관찰되지 않았습니다. 플라스틱 대역(도2H)을이용하여 캡슐의 외부 표면을 보호하는 것이 좋습니다. 보호 밴드가 진드기 공급 과정에서 손상된 경우 새 밴드로 교체할 수 있습니다. 캡슐의 직경은 다른 마우스 변형 크기에 대해 수정될 수 있다. 우리는 먹이 진드기를 적어도 하루에 두 번 모니터링하고 탈취를 피하기 위해 분리 직후 에랑이오드 진드기를 수집하는 것이 좋습니다.
감염된 진드기의 수는 캡슐 직경뿐만 아니라 숙주 크기에 의해 제한됩니다. 우리의 실험에서 우리는 한 마우스에 대한 최대 20 님프 또는 100 I. 리시누스의 애벌레를 사용했다. 더 큰 크기의,진드기등의 암블리옴마 또는 히알롬마 스프 등, 감염된 진드기의 수는 혈액손실(19,26, 27)으로부터호스트에게 해를 끼치지 않도록 감소시켜야 한다.,27 따라서,이 기술은 진드기 의 많은 숫자가 공급해야하는 진드기 사육 식민지의 유지 보수에 적합하지 않습니다. 이를 위해 토끼나 양과 같은 더 큰 호스트는 전체 동물 요구 사항을 줄이기 위해20,,27을 권장합니다.
우리의 기술은 마우스 모델이 필요한 다양한 유형의 실험에 적합하며 생물학적 매개 변수를 쉽게 수집 및 / 또는 모니터링할 수 있도록 밀폐 된 영역에 진드기를 유지할 필요가 있습니다. 다른기술(10)10,11, 12,,12,13,,14,,15,,16,,17,,18에비해, 이 간단한 프로토콜은 마우스당 전체 마취 시간(약 5분)을 크게 감소시키고 빠른 건조, 자극적이지 않은 라텍스 접착제는 동물에게 해를 끼치지 않는다. 고응도 EVA-폼 캡슐은 진드기 공급 영역을 보호하고 무료 감염,시스템,10,11,,12,13,,15에서보고된 바와 같이 분실, 손상 또는 진드기를 먹을 위험을 최소화합니다. 제안된 기술의 가장 큰 장점은 평평한 모양의 캡슐과 피부에 오래 지속되는 부착으로 필요한 경우 마우스로 쉽게 조작할 수 있다는 것입니다. 실험 동물에 대한 불편함을 줄이기 위해 탄성 및 비자극성 물질의 사용에 특별한 주의를 기울여 실험 후 마우스 숙주의의 완전한 회복을 가능하게한다(도 3D).
이 방법은 진드기 숙주 병원체 상호 작용, 숙주 면역 계통의 진드기 조작, 다른 진드기 제어 조치 또는 진드기 생물학을 평가할 때 다양한 실험에 사용될 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 알랭 버니어 프랑스 국립 농업 연구소 (INRAE) 및 오세안 르 비델 (ANSES)의 기술 지원을 인정합니다. 연구 결과는 DIM One 건강에 의해 지원되었습니다 - 레기온 일 드 프랑스 (프로젝트의 약어: NeuroPaTick). 마우스는 ANSES에 의해 구입하였다. 제프리 엘 블레어 박사는 원고의 이전 버전을 검토한 것으로 인정됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
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