Summary
I denne studien ble et fôringssystem for nymphal og larval stadier av hardt kryss utviklet ved hjelp av en kapsel festet til laboratoriemus. Fôringskapselen er laget av fleksible materialer og forblir godt festet til musen i minst en uke og gir komfortabel overvåking av flåttfôring.
Abstract
Ticks er obligatoriske blodfôring parasitter i alle stadier av utvikling (unntatt egg) og er anerkjent som vektorer av ulike patogener. Bruken av musemodeller i tick forskning er avgjørende for å forstå deres biologi og tick-host-patogen interaksjoner. Her demonstrerer vi en ikke-arbeidskrevende teknikk for fôring av umodne stadier av harde flått på laboratoriemus. Fordelen med metoden er dens enkelhet, korte varighet og evnen til å overvåke eller samle flått på forskjellige tidspunkter i et eksperiment. I tillegg tillater teknikken vedlegg av to individuelle kapsler på samme mus, noe som er gunstig for en rekke eksperimenter der to forskjellige grupper av flått er nødvendig for å mate på samme dyr. Den ikke-irriterende og fleksible kapselen er laget av lett tilgjengelige materialer og minimerer ubehaget til de eksperimentelle dyrene. Videre er eutanasi ikke nødvendig, mus gjenoppretter helt etter eksperimentet og er tilgjengelige for gjenbruk.
Introduction
Ticks er viktige vektorer av flere patogener og representerer en alvorlig risiko for dyr og menneskers helse1. Å sette opp et effektivt fôringssystem er avgjørende når de studerer biologi, kryssvert-patogeninteraksjoner eller etablerer effektive kontrolltiltak. For tiden er flere kunstige fôringssystemer, som unngår bruk av levende dyr tilgjengelig forflått 2,3,4 ogdisse bør benyttes når eksperimentelle forhold tillater det. Men i ulike eksperimentelle innstillinger disse systemene ikke klarer å etterligne de spesifikke fysiologiske funksjonene, og bruk av levende dyr er nødvendig for å oppnå relevante resultater.
Laboratoriemus brukes ofte til studiet av mange biologiske systemer og brukes rutinemessig som verter for fôringflått 5,,6,,7,,8,,9. De to vanligste metodene for å mate umodne flått på mus inkluderer gratis angrep og bruk av innesperringskamre festet til musen. Gratis angrep brukes primært til larvalstadier og engorged flått kan falle til et område hvor de kan gjenopprettes. Confinement kamre består vanligvis av akryl eller polypropylen caps som er limt til musens rygg. Den første teknikken er et effektivt naturlig system for flåttfôring, men tillater ikke nøye overvåking under forsøket fordi de enkelte flåttene er spredt i forskjellige deler av vertskroppen. I tillegg kan engorged flått som faller til et gjenopprettingsområde bli forurenset med avføring og urin10,11,12,13,14 som kan alvorlig påvirke tick fitness eller de kan bli skadet eller spist av musen hvis det ikke er separasjon mellom dyret og gjenopprettingsområdet15. Kammerbaserte systemer tillater innesperring av flått til et definert område, men limingsprosessen er arbeidskrevende og caps er ofte svakt tilhenger av limet og dermed løsner de ofte under eksperimentet16,17,18,19. Hettene er også stive, ubehagelige og fører til hudreaksjoner, noe som forhindrer gjenbruk av musene og nødvendiggjør deres eutanasi etter forsøket.
I vår forrige studie utviklet vi et effektivt system ved hjelp av kamre laget av etylen-vinylacetat (EVA) skum for fôring flått på laboratoriekaniner20. Her tilpasset vi dette systemet til en musemodell og foreslår en enkel og ren metode for å mate umodne harde kryssstadier i lukkede kapsler laget av EVA-skum. Spesielt bruker systemet vårt elastiske EVA-skumkapsler limt til de barberte musene tilbake med rask tørking (3 min), ikke-irriterende latekslim. Denne teknikken tillater fast og langvarig vedlegg av kapsler til den eksperimentelle musen, samt effektiv kryssangrep / samling i hele løpet av eksperimentet. Den flate kapselen er laget av fleksible materialer og innebærer ikke manipulering av musen for blodinnsamling eller andre formål. Systemet er hovedsakelig egnet for nymphal tick stadier, men med liten modifikasjon kan det brukes til fôring larver også. Metoden kan fullføres av en enkelt erfaren person og omfattende opplæring er ikke nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vær oppmerksom på at denne protokollen bare kan brukes når alle velferds- og sikkerhetstiltak er oppfylt i laboratoriet. Denne protokollen fikk tillatelse til å bruke mus til flåttfôring av etikkkomiteen for dyreforsøkComEth Anses/ENVA/UPEC, tillatelsesnummer E 94 046 08. For endepunktet ble dyrene utsatt for CO2 i 9 min i to faser på 4 og 5 min hver.
1. Tilberedning av kapselen
- Stick 2 mm tykk EVA-skum og limet dobbel klebrig skum sammen (Figur 1A).
- Bruk en 20 mm diameter lær hull punch, kutt en sirkel fra de stikker skum stykker. Deretter, ved hjelp av en 12 mm diameter hull punch, kutte interiøret for å lage dobbel skum sirkel (Figur 1B).
MERK: Rammetykkelsen på kapselen skal være større enn 3 mm for å garantere tilstrekkelig overflate for limingsprosessen til vertshuden (se nedenfor). - Skrell den beskyttende papirlisten fra det selvklebende dobbelte klebrig skum (figur 1C) og fest en gjennomsiktig sirkulær plast med 20 mm diameter (figur 1D).
MERK: Hvis du mater larver, må du ikke fjerne den beskyttende papirstripen fra klebeskummet og gå direkte til trinn 2 i protokollen. Lim den doble skumringen, inkludert beskyttende papirstripe til musen. - Lag en ~ 1 cm spalte i gjennomsiktig plast (figur 1E).
- Lag minst 10 små hull med en entomologisk pinne (figur 1F) for å tillate overdreven fuktighetsfordampning under forsøket.
MERK: Kapselen (figur 1G) har en total høyde på 4 mm (2 mm EVA-skum sammen med 2 mm klebende skum) og kan brukes til å mate nymfer og larver av alle de harde kryssartene. Kapselstørrelsen (figur 1H) på 20 mm ytre diameter er egnet for de fleste musestammer, men kan endres om nødvendig.
2. Fremstilling av musene før kryssangrep
MERK: I denne studien ble 10 - 12 uker gamle kvinnelige eksperimentelle mus (stamme C57BL/6 og BALB/cByJ) opprettholdt i standard bur med mat og vann som tilbys ad libitum (Grønn linje ventilerte stativer på -20 Pa) ved det franske byrået for mat, miljø og yrkeshelse og sikkerhet (ANSES) akkrediterte dyrefasiliteter i Maisons-Alfort, Frankrike. Dyr ble overvåket to ganger daglig av erfarne teknikere for unormale hudreaksjoner, helseproblemer eller komplikasjoner.
- Bedøve musen med isofluran i induksjonskammeret. Når den er bedøvet, plasser musen til manipulasjonsputen og fest den til en nesekjegle for kontinuerlig isofluranforsyning (figur 2A). Overvåk pustehastigheten og reduser isoflurannivået for å sikre at den er mindre enn 80 åndedrag per minutt.
MERK: Før manipuleringen må du merke den enkelte musen ved å tatovert eller radiofrekvensidentifikasjonsbrikke om nødvendig. Det anbefales å holde de enkelte musene i separate bur for å unngå kapselskade ved å bite. - Barber den fremre delen av musen bak skulderbladene opp til området like bak ørene (figur 2A).
MERK: Det barberte området skal være større enn kapseloverflaten. - Påfør ikke-irriterende latekslim på hele EVA-skumstedet til den tilberedte kapselen og vent i 1 min (figur 2B).
- Lim kapselen til musen tilbake med litt 3 min konstant trykk med fingeren(e) (figur 2C), spesielt på venstre og høyre side av kapselen. Løft kapselen litt for å visuelt kontrollere vedlegget til huden. Hvis ikke-tilknyttede områder blir funnet, bruk mer lim ved hjelp av en slikkepott og trykk i ytterligere 3 minutter.
3. Kryssangrep
- For nymfeangrep, introdusere de enkelte nymfene i kapselen via kuttet gjort i trinn 1.4 (Figur 2D).
MERK: For Ixodes kryssarter anbefales maksimalt 20 nymfer per en kapsel. - Klem kapselen litt fra to sider slik at den gjennomsiktige plasten bøyer seg for enklere innføring av individuelle nymfer ved hjelp av fine disseksjonstuks (figur 2D). Skyv de enkelte nymfene via snittet inne i kapselen. Når du er inne, snu tangen i 90° og trekk ut tangen for å sette flått inne i kapselen.
- For larver angrep fjerne papirslip fra den vedlagte kapselen (Figur 2E). Plasser sprøyten, som inneholder larver (figur 2F), rett inne i kapselen og avleiringsflått ved å skyve sprøytestempelet. Vri forsiktig stempelet mot huden for å fjerne de gjenværende larver festet.
MERK: Legg larver i en 1 ml sprøyte med kuttet ende plugget av stykke bomull før eksperimentet. - Når larvene er avsatt på huden, lukk kapselen ved å feste gjennomsiktig plast (figur 2G).
- Påfør det beskyttende plastbåndet rundt kapselen (figur 2H).
MERK: Det beskyttende plastbåndet forbedret kapselens holdbarhet i hele hele forsøket (figur 2I,J). Det er mulig å feste to kapsler til en enkelt mus (figur 2K). I dette tilfellet er det nødvendig med minst 3 mm mellomrom mellom kapslene, og det barberte området bør økes på riktig måte. - Returner musene til buret.
4. Samling av flått
- Bedøve musen som i trinn 2.1 ovenfor.
- Lag et kryssformet kutt (figur 3A) til plasten med en skalpell.
MERK: Dette kryssformede snittet muliggjør enkel innsamling av engorged flått eller løsrivelse av fôringsflåttene om nødvendig. - Om nødvendig må kapselen trekkes tilbake ved å stikke et klebende plastlapp til den gjennomsiktige plasten (20 mm diameter, figur 3B).
MERK: Hvis det er ønskelig å samling av flått på flere tidspunkter, kan det samme klebrig plastplastplastplast brukes. Hvis protokollen krever det, kan man også euthanize musen, fjerne kapselen, og samle / løsne flåttene (Figur 3C).
5. Gjenoppretting av musene
- Hold musene i buret i en ekstra uke.
- La kapselen løsne naturlig.
MERK: I dette tilfellet tar det ca. 8-9 dager før kapslene faller av. Når kapselen er fjernet, er det viktig å se etter unormale reaksjoner på musenes hud. Ved irritasjon påfør en mykgjørende lotion, men normalt er det ikke nødvendig med behandling. Hvis den etiske protokollen tillater det, kan de gjenopprettede musene (figur 3D) brukes om igjen for et annet kryssangrep eller forskjellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi foreslår den detaljerte trinnvise metoden for fôring av umodne harde kryssstadier i EVA-skumkapsler som brukes på musens rygg (figur 2). Denne ikke-arbeidskrevende protokollen er egnet for ulike typer eksperimenter når nøyaktig kryssovervåking og innsamling er nødvendig. De viktigste fordelene med denne metoden er dens enkelhet, lett tilgjengelige kostnadseffektive materialer og kort varighet. I tillegg lyktes vi i å feste to kapsler til en mus individuell (Figur 2K) slik at for oss å mate to forskjellige grupper av flått på samme dyr. Bruken av det svært effektive, hurtigtørkende og ikke-irriterende latekslimet sikrer at kapselen er godt festet innen 3 min. Kapselen forble også festet i minst en uke (figur 2J) som var nok tid til engorgement av de fleste umodne hard tick arter21,22,23,24. På grunn av kapselelastisiteten var ytterligere manipulering av musen for blodinnsamling eller andre formål veldig praktisk. Denne prosedyren tillater også fullstendig gjenoppretting av musene etter forsøkene (Figur 3D) som gir mulighet til å gjenbruke dyrene og unngå eutanasi. Vårt system har blitt brukt til å mate Ixodes ricinus nymfer (Figur 4). En moderat til høy engorgement suksessrate ble oppnådd i henholdsvis C57BL/6 og BALB/cByJ-musestammer. I begge tilfeller fullførte alle nymfer fôringen innen 4 – 5 dager, mens flertallet (~75%) falt av på den fjerde dagen.
Figur 1: EVA-skum kapsel forberedelse. (A) Feste av EVA-skum (svart) og lim dobbel klebrig skum (hvit). (B) Kutting 20 mm diameter ytre og 12 mm indre sirkel ved hjelp av skinn hull slag. (C) Fjerning av papirbeskyttelsestapen fra det doble klebrige skummet. (D) Feste av gjennomsiktig plast til kapselen. (E) Kutting av spalten i gjennomsiktig plast med en skalpell. (F)Opprettelse av hull ved hjelp av en entomologisk pin i plasten. -Det er ikke noe å gjøremed det. Skjematisk tegning av de ulike delene av kapselen og dimensjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Liming kapselen til musene og kryssangrep. (A) Barber musens bakre del. (B) Påføring av latekslimet på EVA-skumsiden av kapselen. (C) Feste av kapsel til musen. (D)Plassere nymfen i kapselen via snittet i gjennomsiktig plast. (E) Peeling papirbeskyttelsestapen fra limet dobbelt klebrig skum før larver angrep. (F)Injeksjoner av larver inne i kapselen ved hjelp av en kuttet sprøyte. (G) Lukke kapselen med gjennomsiktig plast. (H)Plassere et beskyttende plastbånd rundt kapselen. (I) Mus med den vedlagte kapselen - 1st dag. MusJmed den vedlagte kapselen -7. Musmedto kapsler festet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Krysssamling og musegjenoppretting. (A)Kutte kryssformet åpning for tick samling. (B)Sett kapselen på igjen med klebende plastlapp. (C) Kapsel fjerning fra en euthanized mus. Piler viser de vedlagte flåttene. (D) Gjenvunnet mus etter falt av kapselen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Engorgement suksess og fôring varighet av Ixodes ricinus nymfer fôring på mus. (A)Total prosentandel av engorged nymfer i C57BL/6 og BALB/cByJ mus. (B) Varighet av nymfegorgement i C57BL/6 og BALB/cByJ mus. (n) tallene for infiserte nymfer er henholdsvis 130 og 25 for 15 individuelle C57BL/6- og 5 individuelle BALB/cByJ-mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trinnet i protokollen er fast liming av kapselen til musehuden. Derfor bør latekslimet påføres homogent på hele EVA-skumoverflaten av kapselen, og konstant trykk i 3 minutter bør påføres, spesielt på venstre og høyre side av kapselen. Vi anbefaler også plassering av kapselen så langt frem på baksiden som mulig for å unngå fjerning av musen ved hjelp av sine bakre poter. I våre eksperimenter har bare vedheftet av EVA-skum- og latekslimet til musehuden blitt validert, og vi kan ikke garantere oppnåelse av samme resultater ved hjelp av forskjellige materialer.
Under våre eksperimenter ble det ikke observert løsrivelse av kapselen fra huden innen de første syv dagene. Vi anbefaler på det sterkeste å beskytte kapselens ytre overflate ved hjelp av plastbåndet (figur 2H). Hvis beskyttelsesbåndet er skadet i løpet av kryssfôring, kan det erstattes med en ny. Diameteren på kapselen kan endres for forskjellige musebelastningsstørrelser. Vi foreslår å overvåke fôringflåttene minst to ganger daglig og å samle inn engorged flått umiddelbart etter løsrivelse for å unngå utvasking.
Antall infiserte flått er begrenset av kapseldiameteren, samt vertsstørrelsen. I våre eksperimenter brukte vi maksimalt 20 nymfer eller 100 larver av I. ricinus for en mus. For større størrelse flått slik Amblyomma eller Hyalomma sp., etc antall infiserte flått bør reduseres for å unngå skade på verten fra blodtap19,26,27. Derfor er denne teknikken ikke egnet for vedlikehold av kryssoppdragende kolonier, hvor et stort antall flått er nødvendig for å mate. For dette formålet anbefales større verter som kaniner eller sauer20,27 for å redusere det totale dyrets krav.
Vår teknikk er egnet for ulike typer eksperimenter der en musemodell er nødvendig, og det er nødvendig å holde flått i lukket område for enkel innsamling og / eller overvåking av deres biologiske parametere. Sammenlignet med andreteknikker 10,11,12,13,14,15,16,17,18, reduserer denne enkle protokollen i stor grad den generelle anestesitiden (ca. 5 minutter) per mus og rask tørking, ikke-irriterende latexlim forårsaker ikke skade på dyret. Den svært klebende EVA-skumkapselen beskytter flåttfôringsområdet og minimerer risikoen for tapt, skadet eller spist flått som rapportert i gratis angrepssystemer10,,11,,12,,13,,15. Den store fordelen med den foreslåtte teknikken er den flatformede kapselen og dens faste langvarige vedlegg til huden, slik at det enkelt kan manipulering med musen om nødvendig. Spesiell oppmerksomhet har blitt betalt på bruk av elastiske og ikke-irriterende materialer for å redusere ubehaget for de eksperimentelle dyrene slik at fullstendig gjenoppretting av museverten etter eksperiment (figur 3D).
Metoden forventes å bli brukt til en rekke eksperimenter når du studerer kryssvert-patogeninteraksjoner, kryssmanipulering av verts immunsystem, evaluering av forskjellige krysskontrolltiltak eller kryssbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner teknisk assistanse fra Alain Bernier French National Institute of Agricultural Research (INRAE), og Océane Le Bidel (ANSES). Studien ble støttet av DIM One Health - Région Île-de-France (Akronym of the project: NeuroPaTick). Musene ble kjøpt av ANSES. Dr. Jeffrey L. Blair er anerkjent for å ha gjennomgått den tidligere versjonen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
- Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
- Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
- Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26 (2012).
- Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286 (2017).
- Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
- Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
- Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47 (2009).
- Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39 (2013).
- Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
- Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
- Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
- Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
- Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
- Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
- Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311 (2020).
