Summary
En este estudio, se desarrolló un sistema de alimentación para las etapas ninfa y larval de la garrapata dura utilizando una cápsula unida al ratón de laboratorio. La cápsula de alimentación está hecha de materiales flexibles y permanece firmemente unida al ratón durante al menos una semana y permite un monitoreo cómodo de la alimentación de las garrapatas.
Abstract
Las garrapatas son parásitos obligatorios de alimentación sanguínea en todas las etapas del desarrollo (excepto los huevos) y se reconocen como vectores de diversos patógenos. El uso de modelos de ratón en la investigación de garrapatas es fundamental para comprender su biología y las interacciones tick-host-patógeno. Aquí demostramos una técnica no laboriosa para la alimentación de etapas inmaduras de garrapatas duras en ratones de laboratorio. El beneficio del método es su simplicidad, corta duración y la capacidad de monitorear o recoger ticks en diferentes puntos de tiempo de un experimento. Además, la técnica permite la fijación de dos cápsulas individuales en el mismo ratón, lo que es beneficioso para una variedad de experimentos donde se requieren dos grupos diferentes de garrapatas para alimentarse del mismo animal. La cápsula no irritante y flexible está hecha de materiales de fácil acceso y minimiza las molestias de los animales experimentales. Además, la eutanasia no es necesaria, los ratones se recuperan completamente después del experimento y están disponibles para su reutilización.
Introduction
Las garrapatas son vectores importantes de varios patógenos y representan un grave riesgo para la salud animal y humana1. La creación de un sistema de alimentación eficaz es crucial al estudiar su biología, interacciones garrapata-huésped-patógeno, o el establecimiento de medidas de control eficaces. Actualmente, varios sistemas de alimentación artificial, que evitan el uso de animales vivos están disponibles para las garrapatas2,3,4 y estos deben ser utilizados siempre que las condiciones experimentales lo permitan. Sin embargo, en diversos entornos experimentales estos sistemas no imitan adecuadamente las características fisiológicas específicas y el uso de animales vivos es necesario para lograr resultados relevantes.
Los ratones de laboratorio se utilizan comúnmente para el estudio de muchos sistemas biológicos y se utilizan rutinariamente como huéspedes para la alimentación de garrapatas5,6,7,8,9. Los dos métodos más comunes de alimentación de garrapatas inmaduras en ratones incluyen infestaciones libres y el uso de cámaras de confinamiento unidas al ratón. Las infestaciones libres se utilizan principalmente para las etapas larvales y las garrapatas engordadas pueden caer a un área donde se pueden recuperar. Las cámaras de confinamiento generalmente se componen de tapas de acrílico o polipropileno que se pegan a la espalda del ratón. La primera técnica es un sistema natural eficaz para la alimentación de garrapatas, pero no permite un seguimiento estrecho durante el experimento porque las garrapatas individuales se dispersan en diferentes partes del cuerpo huésped. Además, las garrapatas engordadas que caen a un área de recuperación pueden contaminarse con heces y orina10,11,12,13,14 que pueden afectar gravemente a la aptitud de la garrapata o pueden ser dañadas o consumidas por el ratón si no hay separación entre el animal y la zona de recuperación15. Los sistemas basados en la cámara permiten el confinamiento de garrapatas a un área definida, sin embargo, el proceso de encolado es laborioso y las tapas son a menudo débilmente adherentes al pegamento y por lo tanto a menudo se separan durante el experimento16,17,18,19. Las tapas también son rígidas, incómodas y conducen a reacciones cutáneas, que impiden la reutilización de los ratones y requieren su eutanasia después del experimento.
En nuestro estudio anterior, desarrollamos con éxito un sistema eficaz utilizando cámaras hechas de espuma de acetato de etileno-vinilo (EVA) para alimentar garrapatas en conejos de laboratorio20. Aquí, adaptamos este sistema a un modelo de ratón y proponemos un método simple y limpio para alimentar etapas inmaduras de garrapata dura en cápsulas cerradas hechas de espuma de EVA. Específicamente, nuestro sistema utiliza cápsulas elásticas de espuma eva pegadas a los ratones afeitados con secado rápido (3 min), pegamento de látex no irritante. Esta técnica permite la fijación firme y duradera de cápsulas al ratón experimental, así como la infestación/colección efectiva de garrapatas durante todo el curso del experimento. La cápsula plana está hecha de materiales flexibles y no impide la manipulación del ratón para la recolección de sangre u otros fines. El sistema es adecuado principalmente para las etapas de la garrapata ninfa, pero con una ligera modificación se puede utilizar para alimentar larvas también. El método puede ser completado por una sola persona experimentada y no se requiere una amplia formación.
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Protocol
Tenga en cuenta que este protocolo solo se puede aplicar cuando se cumplen todas las medidas de bienestar y seguridad en el laboratorio. Este protocolo recibió permiso para utilizar ratones para la alimentación de garrapatas por el Comité de ética para experimentos animalesComEth Anses/ENVA/UPEC, Números de permiso E 94 046 08. Para el punto final, los animales fueron expuestos aCO2 durante 9 min en dos fases de 4 y 5 min cada una.
1. Preparación de la cápsula
- Pegue espuma de EVA de 2 mm de espesor y la espuma adhesiva doble pegajosa juntas(Figura 1A).
- Usando un punzón de cuero de 20 mm de diámetro, corte un círculo de las piezas de espuma pegadas. A continuación, utilizando un punzón de agujero de 12 mm de diámetro, corte el interior para crear el círculo de espuma doble (Figura 1B).
NOTA: El espesor del bastidor de la cápsula debe ser superior a 3 mm de tamaño para garantizar una superficie suficiente para el proceso de encolado a la piel del huésped (ver más abajo). - Pelar la tira protectora de papel de la espuma adhesiva doble pegajosa (Figura 1C) y fijar un plástico circular transparente de 20 mm de diámetro (Figura 1D).
NOTA: Si alimenta larvas, no retire la tira protectora de papel de la espuma adhesiva y pase directamente al paso 2 del protocolo. Pegue el anillo de espuma doble, incluida la tira protectora de papel al ratón. - Haga una ranura de 1 cm en el plástico transparente(Figura 1E).
- Cree al menos 10 agujeros pequeños con un pasador entomológico (Figura 1F) para permitir la evaporación excesiva de la humedad durante el experimento.
NOTA: La cápsula (Figura 1G) tiene una altura total de 4 mm (2 mm de espuma EVA junto con espuma adhesiva de 2 mm) y se puede utilizar para alimentar ninfas y larvas de todas las especies de garrapatas duras. El tamaño de la cápsula (Figura 1H) de 20 mm de diámetro exterior es adecuado para la mayoría de las tensiones del ratón, pero se puede modificar si es necesario.
2. Preparación de los ratones antes de la infestación por garrapatas
NOTA: En este estudio, se mantuvieron ratones experimentales hembra de 10 a 12 semanas de edad (strain C57BL/6 y BALB/cByJ) en jaulas estándar con alimentos y agua ofrecidos ad libitum (racks ventilados de línea verde a -20 Pa) en la Agencia Francesa de Alimentación, Salud y Seguridad Ambiental y Ocupacional (ANSES) acreditadas para animales en Maisons-Alfort, Francia. Los animales fueron monitoreados dos veces al día por técnicos experimentados para detectar cualquier reacción cutánea anormal, problemas de salud o complicaciones.
- Anesthetizar el ratón con isoflurano en la cámara de inducción. Una vez anestesiado, coloque el ratón en la almohadilla de manipulación y adjúntelo a un cono nasal para el suministro continuo de isoflurano (Figura 2A). Controle la frecuencia respiratoria y reduzca el nivel de isoflurano para asegurarse de que sea inferior a 80 respiraciones por minuto.
NOTA: Antes de la manipulación, etiquete el ratón individual tatuando o identificando radiofrecuencia si es necesario. Se recomienda mantener los ratones individuales en jaulas separadas para evitar daños en la cápsula por morder. - Afeitar la parte anterior del ratón desde detrás de los omóplatos hasta el área justo detrás de las orejas (Figura 2A).
NOTA: El área afeitada debe ser mayor que la superficie de la cápsula. - Aplicar pegamento de látex no irritante a todo el sitio de espuma de EVA de la cápsula preparada y esperar 1 min(Figura 2B).
- Pegue la cápsula al ratón hacia atrás por una ligera presión constante de 3 minutos con los dedos (Figura 2C), especialmente en el lado izquierdo y derecho de la cápsula. Levante ligeramente la cápsula para comprobar visualmente su fijación a la piel. Si se encuentran regiones no unidas, aplique más pegamento con una espátula y presione otros 3 minutos.
3. Infestación de garrapatas
- Para la infestación de ninfas, introduzca las ninfas individuales en la cápsula a través del corte realizado en el paso 1.4 (Figura 2D).
NOTA: Para las especies de garrapatas Ixodes se recomienda un máximo de 20 ninfas por una cápsula. - Apriete ligeramente la cápsula de dos lados para permitir que el plástico transparente se doble para facilitar la introducción de ninfas individuales utilizando fórceps de disección fina(Figura 2D). Empuje las ninfas individuales a través del corte dentro de la cápsula. Una vez dentro, gire los fórceps en 90o y tire de los fórceps para depositar las garrapatas dentro de la cápsula.
- Para la infestación por larvas, retire el trozo de papel de la cápsula adjunta(Figura 2E). Coloque la jeringa, que contiene larvas (Figura 2F), directamente dentro de la cápsula y deposite las garrapatas empujando el émbolo de la jeringa. Gire suavemente el émbolo hacia la piel para eliminar las larvas restantes unidas.
NOTA: Coloque las larvas en una jeringa de 1 ml con extremo cortado enchufado por trozo de algodón antes del experimento. - Una vez depositadas las larvas sobre la piel, cierre la cápsula fijando el plástico transparente(Figura 2G).
- Aplique la banda protectora de plástico alrededor de la cápsula(Figura 2H).
NOTA: La banda protectora de plástico mejoró en gran medida la durabilidad de la cápsula durante toda la duración del experimento (Figura 2I,J). Es posible conectar dos cápsulas a un ratón individual(Figura 2K). En este caso, se requiere un mínimo de 3 mm de espacio entre las cápsulas y la zona de afeitado debe aumentarse adecuadamente. - Devuelva a los ratones a la jaula.
4. Colección de garrapatas
- Anesthetice el ratón como en el paso 2.1 anterior.
- Haga un corte en forma de cruz (Figura 3A) al plástico con un bisturí.
NOTA: Este corte en forma de cruz permite una fácil recolección de garrapatas engordadas o desprendimiento de las garrapatas de alimentación si es necesario. - Si es necesario, vuelva a cerrar la cápsula pegando un parche de plástico adhesivo al plástico transparente (20 mm de diámetro, Figura 3B).
NOTA: Si se desea la recogida de ticks en varios puntos de tiempo, se puede utilizar el mismo parche de plástico pegajoso. Si el protocolo lo requiere, también se puede eutanasiar el ratón, quitar la cápsula y recoger/separar los ticks (Figura 3C).
5. Recuperación de los ratones
- Mantenga a los ratones en jaula durante una semana más.
- Deje que la cápsula se desprenda naturalmente.
NOTA: En este caso, las cápsulas tardan unos 8-9 días en caerse. Cuando se retira la cápsula, es importante comprobar si hay reacciones anormales en la piel de los ratones. En caso de irritación aplicar una loción emoliente, aunque normalmente no se requiere tratamiento. Si el protocolo ético lo permite, los ratones recuperados (Figura 3D) se pueden reutilizar para otra infestación de garrapatas o experimentos diferentes.
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Representative Results
Proponemos el método detallado paso a paso para alimentar etapas inmaduras de garrapata dura en cápsulas de espuma de EVA aplicadas a la espalda de un ratón (Figura 2). Este protocolo no laborioso es adecuado para varios tipos de experimentos cuando se requiere una supervisión y recolección precisa de garrapatas. Las principales ventajas de este método son su simplicidad, materiales rentables de fácil acceso y corta duración. Además, logramos conectar dos cápsulas a un individuo de ratón (Figura 2K) lo que nos permite alimentar dos grupos diferentes de garrapatas en el mismo animal. El uso del pegamento de látex altamente eficaz, de secado rápido y no irritante asegura que la cápsula esté firmemente unida dentro de 3 min. Además, la cápsula permaneció unida durante al menos una semana(Figura 2J)que fue tiempo suficiente para el engorgement de la mayoría de las especies inmaduras de garrapatasduras 21,22,23,24. Debido a la elasticidad de la cápsula, la manipulación adicional del ratón para la recolección de sangre u otros propósitos era muy conveniente. Este procedimiento también permite la recuperación completa de los ratones después de los experimentos (Figura 3D) dando la oportunidad de reutilizar los animales y evitar la eutanasia. Nuestro sistema se ha utilizado con éxito para alimentar ninfas de ricinus Ixodes (Figura 4). Se logró una tasa de éxito de engorgement moderada a alta en las cepas de ratón C57BL/6 y BALB/cByJ, respectivamente. En ambos casos, todas las ninfas terminaron la alimentación en un plazo de 4 a 5 días, mientras que la mayoría (75%) dejó en el cuarto día.
Figura 1: Preparación de cápsulas de espuma EVA. (A) Adjunto de espuma de EVA (negro) y espuma adhesiva doble pegajosa adhesiva (blanco). (B) Corte exterior de 20 mm de diámetro y círculo interior de 12 mm mediante perforaciones de cuero. (C) Extracción de la cinta de protección del papel de la espuma adhesiva doble pegajosa. (D) Fijación del plástico transparente a la cápsula. (E) Cortar la hendidura en el plástico transparente con un bisturí. (F) Creación de agujeros utilizando un pasador entomológico en el plástico. (G-H) Dibujo esquemático de las diferentes partes de la cápsula y dimensiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pegar la cápsula a los ratones y la infestación por garrapatas. (A) Parte anterior posterior del ratón de afeitar. (B) Aplicación del pegamento de látex en el lado de espuma de EVA de la cápsula. (C) Adjunto de la cápsula al ratón. (D) Colocar la ninfa en la cápsula a través del corte en el plástico transparente. (E) Pelar la cinta de protección del papel de la espuma adhesiva doble pegajosa antes de la infestación por larvas. (F) Inyecciones de larvas dentro de la cápsula utilizando una jeringa cortada. (G) Cierre de la cápsula con el plástico transparente. (H) Colocación de una banda de plástico protectora alrededor de la cápsula. (I) Ratón con la cápsula adjunta -1o día. (J) Ratón con la cápsula adjunta -7o día. (K) Ratón con dos cápsulas unidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recopilación de ticks y recuperación del mouse. (A) Corte de la abertura en forma cruzada para la colección de ticks. (B) Volver a sellar la cápsula con parche de plástico adhesivo. (C) Eliminación de cápsulas de un ratón eutanizado. Las flechas muestran los ticks adjuntos. (D) Ratón recuperado después de dejar la cápsula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El éxito del engorgement y la duración de alimentación de las ninfas Ixodes ricinus alimentándose de ratones. (A) Porcentaje total de ninfas engordadas en ratones C57BL/6 y BALB/cByJ. (B) Duración del engorgement de ninfa en ratones C57BL/6 y BALB/cByJ. Los números (n) para las ninfas infestadas son 130 y 25 para 15 ratones individuales C57BL/6 y 5 ratones BALB/cByJ individuales, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más crítico en el protocolo es el encolado firme de la cápsula a la piel del ratón. Por lo tanto, el pegamento de látex debe aplicarse homogéneamente a toda la superficie de espuma de EVA de la cápsula y se debe aplicar presión constante durante 3 minutos, especialmente en el lado izquierdo y derecho de la cápsula. También recomendamos la colocación de la cápsula tan lejos hacia adelante en la parte posterior como sea posible para evitar su eliminación por el ratón utilizando sus patas traseras. En nuestros experimentos, sólo se ha validado la adhesión de la espuma de EVA y pegamento de látex a la piel del ratón y no podemos garantizar la consecución de los mismos resultados utilizando diferentes materiales.
Durante nuestros experimentos, no se observó desprendimiento de la cápsula de la piel en los primeros siete días. Recomendamos encarecidamente proteger la superficie exterior de la cápsula utilizando la banda de plástico (Figura 2H). Si la banda protectora está dañada en el transcurso de la alimentación de las garrapatas, se puede reemplazar por una nueva. El diámetro de la cápsula se puede modificar para diferentes tamaños de deformación unitaria del ratón. Sugerimos monitorear las garrapatas de alimentación al menos dos veces al día y recoger las garrapatas engordadas inmediatamente después del desprendimiento para evitar su desicación.
El número de garrapatas infestadas está limitado por el diámetro de la cápsula, así como el tamaño del huésped. En nuestros experimentos usamos un máximo de 20 ninfas o 100 larvas de I. ricinus para un ratón. Para las garrapatas de mayor tamaño tales Amblyomma o Hyalomma sp., etc, el número de garrapatas infestadas debe reducirse para evitar daños al huésped por pérdida de sangre19,26,27. Por lo tanto, esta técnica no es adecuada para el mantenimiento de colonias de cría de garrapatas, donde se requiere un gran número de garrapatas para alimentarse. Para ello, se recomiendan huéspedes más grandes como conejos u ovejas20,,27 para reducir el requisito animal general.
Nuestra técnica es adecuada para varios tipos de experimentos en los que se requiere un modelo de ratón, y es necesario mantener las garrapatas en un área cerrada para facilitar la recolección y/o el seguimiento de sus parámetros biológicos. En comparación con otras técnicas10,11,12,13,14,15,16,17,18, este protocolo simple reduce en gran medida el tiempo de anestesia general (aproximadamente 5 minutos) por ratón y el secado rápido, pegamento de látex no irritante no causa daño al animal. La cápsula de espuma EVA altamente adhesiva protege el área de alimentación de la garrapata y minimiza el riesgo de pérdida, daño o alimentación de garrapatas como se indica en los sistemas de infestación libre10,11,12,13,15. La gran ventaja de la técnica propuesta es la cápsula de forma plana y su firme fijación de larga duración a la piel permitiendo una fácil manipulación con el ratón si es necesario. Se ha prestado especial atención al uso de materiales elásticos y no irritantes para reducir las molestias a los animales experimentales permitiendo la recuperación completa del huésped del ratón después del experimento (Figura 3D).
Se espera que el método se utilice para una variedad de experimentos al estudiar las interacciones tick-host-patógeno, la manipulación de garrapatas del sistema inmunitario del huésped, la evaluación de diferentes medidas de control de garrapatas o la biología de garrapatas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos la asistencia técnica de Alain Bernier Instituto Nacional francés de Investigación Agrícola (INRAE), y Océane Le Bidel (ANSES). El estudio fue apoyado por el DIM One Health - Région éle-de-France (Acrónimo del proyecto: NeuroPaTick). Los ratones fueron comprados por ANSES. El Dr. Jeffrey L. Blair es reconocido por revisar la versión anterior del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
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