Summary
I denna studie utvecklades ett utfodringssystem för nymphal- och larvstadium av hård fästing med hjälp av en kapsel fäst vid laboratoriemus. Matningskapseln är tillverkad av flexibla material och förblir fastsatt på musen i minst en vecka och möjliggör bekväm övervakning av fästingmatning.
Abstract
Fästingar är obligatoriska blod utfodring parasiter i alla utvecklingsstadier (utom ägg) och erkänns som vektorer av olika patogener. Användningen av musmodeller i fästingforskning är avgörande för att förstå deras biologi och tick-host-patogeninteraktioner. Här visar vi en icke-mödosam teknik för utfodring av omogna stadier av hårda fästingar på laboratoriemöss. Fördelen med metoden är dess enkelhet, kort varaktighet, och möjligheten att övervaka eller samla fästingar vid olika tidpunkter för ett experiment. Dessutom tillåter tekniken fastsättning av två enskilda kapslar på samma mus, vilket är fördelaktigt för en mängd olika experiment där två olika grupper av fästingar krävs för att livnära sig på samma djur. Den icke-irriterande och flexibla kapseln är tillverkad av lättillgängliga material och minimerar besväret hos försöksdjuren. Dessutom är dödshjälp inte nödvändigt, möss återhämta sig helt efter experimentet och är tillgängliga för återanvändning.
Introduction
Fästingar är viktiga vektorer av flera patogener och utgör en allvarlig risk för djurs och människors hälsa1. Att inrätta ett effektivt utfodringssystem är avgörande när man studerar deras biologi, tick-host-pathogen interaktioner, eller upprätta effektiva kontrollåtgärder. För närvarande, flera artificiella utfodringssystem, som undviker användning av levande djur finns förfästingar 2,3,4 och dessa bör utnyttjas när experimentella förhållanden tillåter. Men i olika experimentella inställningar dessa system misslyckas med att på lämpligt sätt efterlikna de specifika fysiologiska funktioner och användning av levande djur är nödvändigt att uppnå relevanta resultat.
Laboratoriemöss används vanligen för studier av många biologiska system och utnyttjas rutinmässigt som värdar för utfodring fästingar5,6,7,8,9. De två vanligaste metoderna för utfodring av omogna fästingar på möss inkluderar fria angrepp och användning av instängdhetskammare som är fästa vid musen. Fria angrepp används främst för larvstadierna och engorged fästingar kan sjunka till ett område där de kan återvinnas. Inneslutningskammare är vanligtvis sammansatta av akryl eller polypropylen mössor som är limmade på musens rygg. Den första tekniken är ett effektivt naturligt system för tickmatning men tillåter inte noggrann övervakning under experimentet eftersom de enskilda fästingarna sprids i olika delar av värdkroppen. Dessutom kan engorged fästingar som sjunker till ett återhämtningsområde bli förorenade med avföring och urin10,11,12,13,14 som kan allvarligt påverka fästingen kondition eller de kan skadas eller ätas av musen om det inte finns någon separation mellan djuret och återhämtningsområdet15. Kammare-baserade system tillåter inspärrning av fästingar till ett definierat område, dock limningsprocessen är mödosam och mössorna är ofta svagt vidhäftande till limmet och därmed de ofta lossnar underexperimentet 16,17,18,19. Locken är också stela, obekväma och leder till hudreaktioner, vilket förhindrar återanvändning av mössen och kräver deras dödshjälp efter experimentet.
I vår tidigare studie utvecklade vi framgångsrikt ett effektivt system med hjälp av kammare gjorda av eten-vinylacetat (EVA) skum för utfodring fästingar på laboratoriekaniner20. Häri, Vi anpassade detta system till en mus modell och föreslå en enkel och ren metod för att mata omogna hårda fästingsteg i slutna kapslar gjorda av EVA-skum. Specifikt använder vårt system elastiska EVA-skumkapslar limmade till de rakade mössen tillbaka med snabb torkning (3 min), icke-irriterande latexlim. Denna teknik möjliggör fast och långvarig fastsättning av kapslar till den experimentella musen, samt effektiv fästingangrepp / samling under hela experimentets gång. Den platta kapseln är tillverkad av flexibla material och hindrar inte manipulation av musen för blodinsamling eller andra ändamål. Systemet är lämpligt främst för nymphal fästingen stadier, men med liten modifiering kan det användas för utfodring av larver också. Metoden kan fyllas i av en enda erfaren person och omfattande utbildning krävs inte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Observera att detta protokoll endast kan tillämpas när alla välfärds- och säkerhetsåtgärder uppfylls i laboratoriet. Detta protokoll fick tillstånd att använda möss för fästingmatning av etikkommittén för djurexperimentComEth Anses/ENVA/UPEC, Tillståndsnummer E 94 046 08. För effektmåttet exponerades djuren för CO2 i 9 min i två faser av 4 och 5 min vardera.
1. Beredning av kapseln
- Stick 2 mm tjockt EVA-skum och det självhäftande dubbla klibbiga skummet tillsammans (Bild 1A).
- Med hjälp av en 20 mm diameter läder hålslag, skär en cirkel från den stickade skum bitar. Sedan, med hjälp av en hålslagning med diametern 12 mm, skär du inredningen för att skapa dubbelskumcirkeln( Bild 1B).
OBS: Kapselns ramtjocklek bör vara större än 3 mm i storlek för att garantera tillräcklig yta för limningsprocessen till värdhuden (se nedan). - Skala skyddspappersremsan från det självhäftande dubbla klibbiga skummet (Figur 1C) och fäst en genomskinlig cirkulär plast med 20 mm diameter (Figur 1D).
OBS: Om matning av larver, ta inte bort skyddspappersremsan från det självhäftande skummet och flytta direkt till steg 2 i protokollet. Limma dubbelskumringen, inklusive skyddande pappersremsa mot musen. - Gör en ~ 1 cm slits i den genomskinliga plasten (Bild 1E).
- Skapa minst 10 små hål med en entomologisk stift (Bild 1F) för att tillåta överdriven fuktindunstning under experimentet.
OBS: Kapseln (Figur 1G) har en total höjd på 4 mm (2 mm EVA-foam tillsammans med 2 mm självhäftande skum) och kan användas för att mata nymfer och larver av alla de hårda fästingarterna. Kapselstorleken (Bild 1H) på 20 mm ytterdiameter är lämplig för de flesta av musstammarna men kan vid behov modifieras.
2. Beredning av mössen före fästingangrepp
OBS: I denna studie, 10 - 12 veckor gamla kvinnliga experimentella möss (stam C57BL/ 6 och BALB / cByJ) bibehölls i standard burar med mat och vatten erbjuds ad libitum (Green line ventilerade rack på -20 Pa) vid den franska byrån för livsmedel, miljö och arbetsmiljö (ANSES) ackrediterade djur anläggningar i Maisons-Alfort, Frankrike. Djur övervakades två gånger dagligen av erfarna tekniker för onormala hudreaktioner, hälsoproblem eller komplikationer.
- Söva mus med isofluran i induktionskammaren. När sövd, placera mus till manipulation pad och fäst på en näsa kon för den kontinuerliga isofluran tillförseln (Figur 2A). Övervaka andningshastigheten och minska isoflurannivån för att säkerställa att den är mindre än 80 andetag per minut.
OBS: Före manipuleringen, märk den enskilda musen genom tatuering eller radiofrekvensidentifieringschip om det behövs. Det rekommenderas att hålla de enskilda mössen i separata burar för att undvika kapselskador genom att bita. - Raka musens främre del från bakom skulderbladen upp till området precis bakom öronen (Bild 2A).
OBS: Det rakade området ska vara större än kapselytan. - Applicera icke-irriterande latexlim på hela EVA-skumstället för den förberedda kapseln och vänta på 1 min (Figur 2B).
- Limma kapseln mot musen bakåt med lätt 3 min konstant tryck med fingret/arna (Bild 2C), särskilt på vänster och höger sida av kapseln. Lyft lätt kapseln för att visuellt kontrollera dess fästning på huden. Om grupplösa regioner hittas, applicera mer lim med hjälp av en spatel och tryck i ytterligare 3 minuter.
3. Fästingangrepp
- För nymfangrepp, införa de enskilda nymferna i kapseln via snittet som gjorts i steg 1.4 (Figur 2D).
OBS: För Ixodes fästarter rekommenderas maximalt 20 nymfer per en kapsel. - Krama lätt kapseln från två sidor för att låta den genomskinliga plasten böjas för enklare införande av enskilda nymfer med hjälp av fin dissektions-forceps (Figur 2D). Tryck de enskilda nymferna via snittet inuti kapseln. Väl inne, vrid tentorna i 90° och dra ut tycerna för att sätta in fästingar inuti kapseln.
- För larver angrepp ta bort pappersslien från den bifogade kapseln (Bild 2E). Placera sprutan, innehållande larver (Figur 2F), direkt inuti kapseln och insättningsfästingar genom att trycka på sprutkolven. Vrid försiktigt kolven mot huden för att ta bort de återstående larverna som sitter fast.
OBS: Placera larver i en 1 mL spruta med kapad ände inkopplad av bomullsbit före experimentet. - När larverna väl har satts in på huden stänger du kapseln genom att fästa den genomskinliga plasten (Figur 2G).
- Lägg på det skyddande plastbandet runt kapseln (Bild 2H).
OBS: Det skyddande plastbandet förbättrade kraftigt kapselns hållbarhet under hela försökets varaktighet (Figur 2I,J). Det är möjligt att fästa två kapslar på en enskild mus (Figur 2K). I detta fall krävs minst 3 mm utrymme mellan kapslarna och det rakade området ska ökas på lämpligt sätt. - Lämna tillbaka mössen till buren.
4. Insamling av fästingar
- söva musen som i steg 2.1 ovan.
- Gör en korsformad skärning (Bild 3A) till plasten med en skalpell.
OBS: Detta korsformade snitt möjliggör enkel insamling av skonade fästingar eller lossnar matarfästingarna om det behövs. - Om det behövs, omsluta kapseln genom att sticka fast ett självhäftande plastlapp på den genomskinliga plasten (20 mm diameter, figur 3B).
OBS: Om insamling av fästingar vid flera tidpunkter önskas kan samma klibbiga plastlapp användas. Om protokollet kräver kan man också avliva musen, ta bort kapseln och samla in/lösgöra fästingarna (figur 3C).
5. Återvinning av mössen
- Håll mössen i bur i ytterligare en vecka.
- Låt kapseln lossna naturligt.
OBS: I detta fall tar det ca 8-9 dagar innan kapslar ramlar av. När kapseln tas bort är det viktigt att kontrollera om det finns onormala reaktioner på mössens hud. Vid irritation applicera en uppmjukande lotion, även om normalt ingen behandling krävs. Om det etiska protokollet tillåter det kan de återvunna mössen (Figur 3D) återanvändas för ett annat fästingangrepp eller olika experiment(ar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi föreslår den detaljerade steg-för-steg-metoden för utfodring omogna hårda fästingsteg i EVA-skum kapslar tillämpas på en mus rygg (Figur 2). Detta icke-arbetsliga protokoll är lämplig för olika typer av experiment när exakt tick övervakning och insamling krävs. De främsta fördelarna med denna metod är dess enkelhet, lättillgängliga kostnadseffektiva material, och kort varaktighet. Dessutom lyckades vi fästa två kapslar till en mus individ (Figur 2K) tillåter oss att mata två olika grupper av fästingar på samma djur. Användningen av den mycket effektiva, snabbtorkande, och icke-irriterande latexlim säkerställer att kapseln är ordentligt fastsatt inom 3 min. Även kapseln förblev fäst i minst en vecka (Figur 2J) som var tillräckligt med tid för engorgement av de flesta av de omogna hårda fästart21,22,23,24. På grund av kapselens elasticitet var ytterligare manipulering av musen för blodinsamling eller andra ändamål mycket bekvämt. Detta förfarande möjliggör också fullständig återhämtning av mössen efter experimenten (Figur 3D) som ger möjlighet att återanvända djuren och undvika dödshjälp. Vårt system har framgångsrikt använts för att mata Ixodes ricinus nymfer (Figur 4). En måttlig till hög engorgement framgång uppnåddes i C57BL/6 och BALB/cByJ mus stammar, respektive. I båda fallen alla nymfer avslutade utfodringen inom 4 – 5 dagar, medan majoriteten (~75%) sjönk av den fjärde dagen.
Bild 1: EVA-skumkapselpreparat. (A) Fastsättning av EVA-skum (svart) och självhäftande dubbel klibbigt skum (vitt). (B) Kapning av 20 mm diameter yttre och 12 mm innercirkel med hjälp av hålstansar i läder. (C) Borttagning av pappersskyddstejpen från det vidhäftande dubbla klibbiga skummet. (D) Fastsättning av den genomskinliga plasten på kapseln. (E) Kapning av slitsen i den genomskinliga plasten med en skalpell. (F) Skapande av hål med hjälp av en entomologisk stift i plasten. (G-H) Schematisk ritning av de olika delarna av kapseln och måtten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Limning av kapseln på mössen och fästingangrepp. (A) Rakning musens rygg främre delen. (B) Applicering av latex lim på EVA-skum sidan av kapseln. (C) Fastsättning av kapsel på musen. (D) Placera nymfen i kapseln via snittet i den genomskinliga plasten. (E) Peeling av pappersskyddstejpen från det självhäftande dubbla klibbiga skummet före larver angrepp. (F) Injektioner av larver inuti kapseln med hjälp av en skuren spruta. (G) Stänga kapseln med den genomskinliga plasten. (H) Placera ett skyddande plastband runt kapseln. (I) Mus med den bifogade kapseln - 1st dag. (J) Mus med den bifogade kapseln - 7th dag. (K) Mus med två bifogade kapslar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Fästingsamling och musåterställning. (A) Skärning av korsformsöppning för fästingsamling. (B) Återförsluta kapseln med självhäftande plastplåster. (C) Kapselborttagning från en dödshjälpsmus. Pilar visar de bifogade fästingarna. (D) Återvunnen mus efter tappade av kapsel. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Engorgement framgång och utfodring varaktighet av Ixodes ricinus nymfer som livnär sig på möss. (A) Total procentuell andel av engorged nymfer i C57BL/6 och BALB/cByJ möss. (B) Varaktighet av nymfengorgement i C57BL/6 och BALB/cByJ möss. De (n) nummer för angripna nymfer är 130 och 25 för 15 enskilda C57BL /6 och 5 enskilda BALB / cByJ möss, respektive. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiska steget i protokollet är fast limning av kapseln till mushuden. Därför bör latexlimmet homogent appliceras på hela EVA-skumytan på kapseln och konstant tryck i 3 minuter bör appliceras, särskilt på vänster och höger sida av kapseln. Vi rekommenderar också placering av kapseln så långt framåt på baksidan som möjligt för att undvika att den avlägsnas av musen med hjälp av dess bakre tassar. I våra experiment har endast vidhäftningen av EVA-skum och latexlim till mushuden validerats och vi kan inte garantera att samma resultat uppnås med hjälp av olika material.
Under våra experiment observerades inte lossnar av kapseln från huden inom de första sju dagarna. Vi rekommenderar starkt att skydda kapselns yttre yta med hjälp av plastbandet (Bild 2H). Om skyddsbandet skadas under loppet av fästingmatning kan det ersättas med ett nytt. Diametern på kapseln kan modifieras för olika musstamstorlekar. Vi föreslår att övervaka utfodring fästingar minst två gånger dagligen och att samla in engorged fästingar omedelbart efter lossnar för att undvika deras uttorkning.
Antalet angripna fästingar begränsas av kapseldiametern, liksom värdstorleken. I våra experiment använde vi högst 20 nymfer eller 100 larver av I. ricinus för en mus. För den större storleken fästingar sådana Amblyomma eller Hyalomma sp., etc antalet angripna fästingar bör minskas för att undvika skada på värden från blodförlust19,26,27. Därför är denna teknik inte lämplig för underhåll av tick uppfödning kolonier, där stora antal fästingar krävs för att mata. För detta ändamål, större värdar som kaniner eller får rekommenderas20,27 för att minska den totala djurbehov.
Vår teknik är lämplig för olika typer av experiment där en musmodell krävs, och det är nödvändigt att hålla fästingar i slutet område för enkel insamling och / eller övervakning av deras biologiska parametrar. Jämfört med andra tekniker10,11,12,13,14,15,16,17,18, detta enkla protokoll minskar kraftigt den totala anestesi tid (cirka 5 minuter) per mus och den snabbtorkande, icke-irriterande latexlim inte orsakar skada på djuret. Den mycket självhäftande EVA-skumkapseln skyddar fästingmatningsområdet och minimerar risken för förlorade, skadade eller uppätna fästingar som rapporterats i friaangreppssystem 10,11,12,13,15. Den stora fördelen med den föreslagna tekniken är den platta formen kapseln och dess fasta långvariga fastsättning till huden möjliggör enkel manipulation med musen om det behövs. Särskild uppmärksamhet har ägnats åt användning av elastiska och icke-irriterande material för att minska obehaget för försöksdjuren som möjliggör fullständig återhämtning av musvärden efter experimentet (Figur 3D).
Metoden förväntas användas för en mängd olika experiment när man studerar tick-host-patogen interaktioner, tick manipulation av värd immunsystem, utvärdera olika fästing kontrollåtgärder eller kryssa biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner det tekniska biståndet från Alain Bernier Franska nationella institutet för jordbruksforskning (INRAE), och Océane Le Bidel (ANSES). Studien stöddes av DIM One Health - Région Île-de-France (Akronym för projektet: NeuroPaTick). Mössen köptes av ANSES. Dr Jeffrey L. Blair är erkänd för att ha granskat den tidigare versionen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
- Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
- Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
- Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26 (2012).
- Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286 (2017).
- Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
- Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
- Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47 (2009).
- Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39 (2013).
- Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
- Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
- Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
- Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
- Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
- Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
- Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311 (2020).
