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Neuroscience

अलगाव और चिक सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स की संस्कृति

Published: August 8, 2020 doi: 10.3791/61431
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,2
1Institute of Biomedicine, Department of Medical Sciences - iBiMED, University of Aveiro, 2CNC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra
* These authors contributed equally

Summary

चिक सिलियरी गैंगलिया (सीजी) पैरासिम्पेथेटिक नर्वस सिस्टम का हिस्सा हैं। लड़की सीजी न्यूरॉन्स की न्यूरोनल संस्कृतियों तंत्रिका मांसपेशी बातचीत के अध्ययन में प्रभावी सेल मॉडल होने के लिए दिखाया गया था। हम विच्छेदन, वियोजन और लड़की भ्रूण से सीजी न्यूरॉन्स की इन विट्रो संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

चिक सिलियरी गैंगलिया (सीजी) परायपैथिक तंत्रिका तंत्र का हिस्सा हैं और आंखों में मौजूद मांसपेशियों के ऊतकों के आंतरिककरण के लिए जिम्मेदार हैं। यह गैंगलियन सिलियरी और कोरॉयडल न्यूरॉन्स की एक समरूप आबादी द्वारा गठित किया जाता है जो क्रमशः आंतरिक और चिकनी मांसपेशी फाइबर होता है। इनमें से प्रत्येक न्यूरोनल प्रकार विशिष्ट नेत्र संरचनाओं और कार्यों को विनियमित करता है। इन वर्षों में, चिक सिलियरी गैंगलिया की न्यूरोनल संस्कृतियों को मांसपेशियों-तंत्रिका तंत्र बातचीत के अध्ययन में प्रभावी सेल मॉडल दिखाया गया था, जो कोलिनेर्गिक सिनेप्स के माध्यम से संवाद करते हैं। सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स, इसके बहुमत में, कोलिनेर्गिक हैं। इस सेल मॉडल को पहले इस्तेमाल किए गए विषम कोशिका मॉडल के लिए तुलनात्मक रूप से उपयोगी दिखाया गया है जिसमें कोलिनेर्गिक के अलावा कई न्यूरोनल प्रकार शामिल हैं। शारीरिक रूप से, सिलियरी गैंगलियन ऑप्टिक नर्व (ऑन) और कोरॉइड फिशर (सीएफ) के बीच स्थानीयकृत है। यहां, हम चिक भ्रूण से सिलियरी गैंगलिया न्यूरॉन्स के विच्छेदन, वियोजन और इन विट्रो संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम सीजी न्यूरॉन्स की अत्यधिक शुद्ध और स्थिर सेलुलर संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो प्रक्रिया के प्रमुख चरणों को रेखांकित करते हैं। इन संस्कृतियों को 15 दिनों तक विट्रो में बनाए रखा जा सकता है और इसके द्वारा हम सीजी संस्कृतियों के सामान्य विकास को दर्शाते हैं । परिणाम यह भी दर्शाते हैं कि ये न्यूरॉन्स न्यूरो-मस्कुलर कोलिनेर्जिक सिनेप्स के माध्यम से मांसपेशियों के तंतुओं के साथ बातचीत कर सकते हैं।

Introduction

सिलियरी गैंगलियन (सीजी) न्यूरॉन्स पैरासिम्पेथेटिक तंत्रिका तंत्र से संबंधित हैं। ये न्यूरॉन्स कोलिनेर्गिक होते हैं, जो मस्कैरिनिक या निकोटीनिक,सिनेप्स1,,2,3स्थापित करने में सक्षम होते हैं। शारीरिक रूप से, सीजी ऑप्टिक तंत्रिका (ओन) और कोरॉयड फिशर (सीएफ) के बीच आंख के पीछे के हिस्से में स्थित है और प्रारंभिक भ्रूण चरणों में लगभग 6000 न्यूरॉन्स होते हैं1,,4। संस्कृति में पहले सप्ताह के लिए, सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स एक बहुध्रुवीय आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं। एक सप्ताह के बाद, वे एक ध्रुवीय राज्य में संक्रमण शुरू करते हैं, जिसमें एक न्यूराइट विस्तार और अक्षत5का निर्माण होता है। इसके अलावा, सीजी न्यूरॉन्स के लगभग आधे लड़की भ्रूण विकास के8 वें और14 दिन के बीच मर जाते हैं, सेल मौत की एक प्रोग्राम प्रक्रिया के माध्यम से । न्यूरॉन्स की संख्या में इस कमी के परिणामस्वरूप लगभग 3000 न्यूरॉन्स6,7 , 8 की सिलियरी गैंगलियन की कुल,8आबादीहोती है । इन विट्रो में, मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ उगाए जाने पर सीजी न्यूरॉन्स की संख्या में कोई कमी नहीं है9 और सीजी न्यूरॉन्स को कई हफ्तों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है1,,9।

सिलियरी गैंगलियन में सिलियरी न्यूरॉन्स और कोरॉयड न्यूरॉन्स की एक सजातीय आबादी होती है, प्रत्येक सीजी में न्यूरोनल आबादी के आधे का प्रतिनिधित्व करती है, जो आंख की मांसपेशियों को आंतरिक करती है। इन दो प्रकार के न्यूरॉन्स संरचनात्मक, शारीरिक और कार्यात्मक रूप से अलग होते हैं। सिलियरी न्यूरॉन्स इनरवेट आईरिस और लेंस पर स्ट्राइडेड मांसपेशी फाइबर, छात्र संकुचन के लिए जिम्मेदार होने के नाते। कोरॉइडल न्यूरॉन्स कोरॉइड 1 ,10 , 11,,,12की चिकनी मांसपेशी को आंतरिक रूप से अपने रूप में करते हैं ।1012

चिकन सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स की संस्कृतियों को न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स और सिनैप्सगठन 1,5,9के अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण दिखाया गया है । यह देखते हुए कि न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स कोलिनेर्गिक13हैं , एक न्यूरोनल आबादी का उपयोग करके जो कोलिनेर्जिक - सीजी न्यूरॉन्स है - पिछले सेल मॉडल14के संभावित विकल्प के रूप में उभरा । इन मॉडलों में एक विषम न्यूरोनल आबादी शामिल थी, जिसमें केवल एक छोटा सा हिस्सा कोलिनेर्गिक है। वैकल्पिक रूप से, सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स विट्रो में अपेक्षाकृत तेजी से विकसित होतेहैं, और लगभग 15 घंटे के बाद पहले से ही सिनैप्स1बनाते हैं। सीजी न्यूरॉन्स अलग अनुसंधान अध्ययन के लिए साल भर में एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है, अलगाव और हेरफेर की अपेक्षाकृत आसानी के कारण । इन अनुप्रयोगों में ऑप्टोजेनेटिक अध्ययन, सिनेप्से विकास, एपोप्टोसिस और न्यूरोमस्कुलर इंटरैक्शन14,,15शामिल हैं।

हम भ्रूण दिवस 7 (E7) लड़की भ्रूण से सिलियरी गैंगलिया न्यूरॉन्स के विच्छेदन, वियोजन और इन विट्रो संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स की अत्यधिक शुद्ध और स्थिर सेलुलर संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों पर भी प्रकाश डालते हैं जिन पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है और इससे न्यूरोनल संस्कृतियों की गुणवत्ता में सुधार होगा। इन संस्कृतियों को कम से कम 15 दिनों तक विट्रो में बनाए रखा जा सकता है।

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Protocol

1. रिएजेंट्स की तैयारी

नोट: इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक सामग्री निम्नलिखित हैं: संदंश (nº 5 और nº 55), सर्जिकल चिमटी, विच्छेदन पेट्री व्यंजन (ब्लैक बॉटम), 24-अच्छी प्लेटें, प्लास्टिक पाश्चर पिपेट, आग पॉलिश ग्लास पाश्चुर पिपेट, 10 मिलीएल सिरिंज, 0.22 माइक्रोन फिल्टर सिरिंज।

  1. प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सभी सामग्री तैयार करें और स्टरलाइज करें जिसमें ग्लास कवरस्लिप, संदंश (एनओएच 5 और एनओटी 55), सर्जिकल चिमटी, पेट्री व्यंजन (ब्लैक बॉटम), आसुत एच2ओ, पिपेट और सर्जरी के लिए सामग्री शामिल हैं।
  2. 01 मिलीग्राम/एमएल पॉली-डी-डिसरीन (पीडीएल) समाधान तैयार करें।
    1. 1 मिलीग्राम/एमएल (10x समाधान) की एकाग्रता के लिए 0.1 एम बोरेट बफर (पीएच 8.2) में पीडीएल का पुनर्गठन करें।
    2. तनु 1:10 में 166.6 m m borate बफर (पीएच 8.2) 0.1 मिलीग्राम/
  3. 10 μg/mL laminin समाधान तैयार करें ।
    1. सादे न्यूरोबेसल माध्यम में 1 मिलीग्राम/एमएल लैमिनिन को 10 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  4. हांक का संतुलित नमक समाधान (एचबीबीएस): 5.36 mM KCl तैयार करें, 0.44 m KH2PO4,137 mM NaCl, 4.16 mM NaHCO3, 0.34 mM NaHCO3, 0.34 mMNa 2HPO4·2H 2O, 5 mM ग्लूकोज, 1 mM सोडियम पायरुवेट, 10 m M HEPEs बफर, 0.001% phen redol. पीएच को 7.2 पर समायोजित करें।
  5. 0.1% ट्राइप्सिन समाधान तैयार करें।
    1. 0.1% की अंतिम एकाग्रता के लिए एचबीएसएस के 5 एमएल में 5 मिलीग्राम ट्राइपसिन 1:250 पाउडर को भंग करें।
    2. पूरी तरह से भंग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर मिक्सर में रखें।
    3. 10 एमएल सिरिंज और 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
  6. सिलियरी गैंगलिया अपूर्ण माध्यमतैयार करें: ग्लूटामाइन के बिना न्यूरोबेसल माध्यम, 1X B27 (फोटो-संवेदनशील), 10% गर्मी-निष्क्रिय घोड़ा सीरम, 2% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, 12.5 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.25x) और 2 m ग्लूटामाइन। बाँझ अभिकर्णों का उपयोग करें और बाँझ परिस्थितियों में माध्यम तैयार करें।
  7. सिलियरी गैंगलिया पूर्ण माध्यम (विकास कारकों के साथ पूरक): अधूरे माध्यम में, 5 एनजी/एमएल जीडीएनएफ और 5 एनजी/एमएल सीएनटीएफ जोड़ें।

2. 24-अच्छी प्लेटों के लिए ग्लास कवरलिप की तैयारी

  1. एक एसिड प्रतिरोधी कंटेनर के अंदर ग्लास कवर्लिप्स की वांछित संख्या रखें और सभी कवरस्लिप जलमग्न होने तक 65% नाइट्रिक एसिड जोड़ें। कंटेनर को एक कक्षीय शेखर में रखें और 1000 आरपीएम की गति से कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन, सावधानी से नाइट्रिक एसिड को एक छोटे जलाशय में स्थानांतरित करें और आगे के उपयोग के लिए स्टोर करें। नाइट्रिक एसिड को 2-3x फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. ध्यान से, शेष नाइट्रिक एसिड को हटाने के लिए कवरस्लिप में आसुत एच2ओ जोड़ें। 30 मिनट के लिए आंदोलन में रखें, धोने के समाधान को त्यागें और इस 5x को दोहराएं।
  4. दो बार 75% इथेनॉल के साथ कवरस्लिप कुल्ला।
  5. ध्यान से अलग और एक धातु एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर रैक में व्यक्तिगत कवरस्लिप जगह है और 10-15 मिनट के लिए या पूरी तरह से सूखी जब तक ५० ºC पर इनक्यूबेट ।
    नोट: ग्लास कवरलिप को ऑटोक्लेव न करें क्योंकि वे एक दूसरे से चिपके रहेंगे।
  6. यूवी लाइट के नीचे कवरस्लिप को 10-15 मिनट के लिए स्टरलाइज करें। न्यूरोनल ऊतक संस्कृति के लिए कवर्लिप्स बाँझ बनाए रखें।

3. 24-अच्छी प्लेटों के लिए ग्लास कवरलिप की कोटिंग

  1. एक बाँझ चिमटी का उपयोग करना, एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में एक कवरस्लिप रखें ।
  2. 0.1 मिलीग्राम/एमएल पीडीएल के 500 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. अगले दिन, बाँझ आसुत एच2ओ के साथ दो बार कवरस्लिप कुल्ला। फिर, प्रत्येक कवरस्लिप में आसुत पानी के 500 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
  4. पानी को त्यागें और प्रत्येक कुएं में 10 माइक्रोन/एमएल लैमिनिन समाधान के 350 माइक्रोन जोड़ें।
  5. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  6. सेल प्लेटिंग से पहले लेमिनिन सॉल्यूशन निकालें और प्लेन न्यूरोबेसल मीडियम से दो बार धोएं।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कवर्लिप किसी भी समय सूख न जाएं।
  7. पूर्ण माध्यम के 300 माइक्रोल जोड़ें और चढ़ाना समय तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में छोड़ दें। चढ़ाना कोशिकाओं से पहले, इस माध्यम को हटा दें।

4. चिकन भ्रूण से सिलियरी गैंगलिया की संस्कृति (भ्रूण दिवस 7)

  1. सिलियरी गैंगलिया का विच्छेदन (सीजी)
    1. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें और उन्हें 75% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
      नोट: अंडे 7 दिनों (या वांछित भ्रूणीय चरण) के लिए 37.7 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड होने से पहले ~ 16 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं। यहां इस्तेमाल होने वाले अंडे रॉस चिकन प्रजाति के होते हैं।
    2. अंडे के ऊपर एक कैंची से काटें और एक चम्मच का उपयोग करके भ्रूण को बाहर निकालें। भ्रूण को बर्फ से ठंडे एचबीएसएस के साथ पेट्री डिश में रखें और गर्दन के क्षेत्र में काटकर सिर को शरीर से अलग करें।
      नोट: जैसे ही भ्रूण अंडे से हटा दिया जाता है, यह प्रोटीज का उत्पादन कर सकता है जो सेल मौत के लिए जिम्मेदार हैं। कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए भ्रूण खोल के बाहर होने के बाद सिर को शरीर से तेजी से अलग करना महत्वपूर्ण है।
    3. भ्रूण का सिर बर्फ से ठंडा एचबीएसएस में रखें।
    4. भ्रूण सिर को ऊपर रखें और इसे नैड 5 संदंश के साथ लड़की की चोंच में ठीक करें। फिर nº 55 संदंश के साथ, आंख के चारों ओर त्वचा की पतली परत को हटाने के लिए शुरू करते हैं।
    5. ध्यान से आंख निकालें और पीछे के हिस्से तक पहुंचने के लिए इसे घुमाएं। चिक के सिर से आंख को अलग करते समय, ऑप्टिक तंत्रिका को अनुभागित होने पर ध्यान दें। इससे सिलियरी गैंगलियन को लोकलाइज करने में मदद मिलेगी।
    6. एक बार जब आंख अलग हो जाती है, तो इसे पीछे की ओर रखें और खंडित ऑप्टिक तंत्रिका और कोरॉइड फिशर से सटे सिलियरी गैंगलियन को नोटिस करें। प्रीगेलियोनिक तंत्रिका अभी भी सिलियरी गैंगलियन से जुड़ी हो सकती है, जो इसकी पहचान की सुविधा प्रदान करती है।
    7. प्रत्येक आंख से सिलियरी गैंगलियन को विच्छेदन करें और प्रत्येक गैंगलियन के चारों ओर अतिरिक्त ऊतक को हटाकर बहुत अच्छी तरह से साफ करें।
      नोट: ~ 1x106 कोशिकाओं/एमएल की उपज के लिए, ~70 सीजीएस विच्छेदन। कृपया ध्यान दें कि प्राप्त सेल आबादी में गैर-न्यूरोनल कोशिकाएं भी शामिल हैं। गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए और, नतीजतन, न्यूरोनल आबादी की शुद्धता में वृद्धि करने के लिए, सभी अतिरिक्त ऊतकों को हटाते हुए, जितना संभव हो सके सिलियरी गैंगलिया को साफ करना बहुत महत्वपूर्ण है।
  2. सिलियरी गंगलिया का विघटन और संस्कृति
    1. एक बाँझ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक 15 एमएल ट्यूब के लिए सभी सिलियरी गैंगलिया ले लीजिए।
      नोट: पिपेट की दीवार पर गैंगलिया के लगाव को कम करने के लिए पाश्चर पिपेट को प्री-वेट करना महत्वपूर्ण है।
    2. 200 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए सिलियरी गैंगलिया को सेंट्रलाइज करें।
    3. ध्यान से, एक पाश्चर पिपेट और फिर एक P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सभी एचबीबीएस माध्यम को हटा दें। 0.1% ट्राइपसिन समाधान का 1 मिलीएल जोड़ें और बिना आंदोलन के पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 200 x gपर 2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    5. तुरंत ट्राइप्सिन समाधान निकालें और 1मिलील अधूरे माध्यम को जोड़ें ।
      नोट: अपूर्ण माध्यम में सीरम होता है जो तुरंत ट्राइप्सिन के प्रभाव को रोक देगा।
    6. 200 x g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और सभी माध्यमों को हटा दें।
    7. पूर्ण माध्यमके 350-500 माइक्रोन जोड़ें ।
      नोट: कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक मात्रा प्राप्त सिलियरी गैंगलिया की संख्या पर निर्भर करती है और इस प्रकार, प्राप्त गोली के आकार पर। ~ 70 सीजी के लिए मध्यम के 500 माइक्रोन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    8. एक P1000 का उपयोग करके पहले 10-15x तक 10-15x तक पाइपिंग करके सीजी को अलग करें और इसके बाद आग से पॉलिश किए गए ग्लास पेस्टर पिपेट का उपयोग करके 10-15x का उपयोग किया जाता है। सेल हानि को कम करने के लिए हवा बुलबुला गठन से बचें।
      नोट: चढ़ाना तक बर्फ पर सेलुलर निलंबन रखें ।
    9. एक ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन और एक मानक न्यूबॉयर चैंबर का उपयोग करके सेलुलर घनत्व निर्धारित करें।
    10. प्लेट 1 x 104 कोशिकाओं/एमएल 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूर्ण माध्यम के ५०० μL में सेल निलंबन की उचित मात्रा को कमजोर करके (10 μM 5'-FDU के साथ पूरक) ।
    11. 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट कोशिकाएं, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।

5. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और सिलियरी न्यूरॉन्स की छवि विश्लेषण

  1. इस पत्र में प्रस्तुत इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख करें जैसा कि पहले16,,17वर्णित है ।
  2. निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: माउस मोनोक्लोनल बी-III ट्यूबलिन (1:1000, T8578), चिकन मोनोक्लोनल न्यूरोफिलामेंट एम (1:1000, एबी5735), माउस मोनोक्लोनल एसवी 2 (1:1000, AB2315387)।
  3. माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में, एलेक्सा फ्लोर 568-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (1:1000, का उपयोग करें A11031), एलेक्सा फ्लोर 568-कंजूस बकरी विरोधी चिकन एंटीबॉडी (1:1000, A11041), एलेक्सा फ्लोर 647-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (1:1000, A21235)।
  4. परमाणु धुंधला (P36935) के लिए, DAPI के साथ बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट कवर्लिप्स।

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Representative Results

इस प्रक्रिया के लिए अनुमानित अवधि कसकर प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग के लिए आवश्यक उपज पर निर्भर करती है और इस प्रकार, सिलियरी गैंगलिया की संख्या पर जिसे अलग-थलग करने की आवश्यकता है। 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अनुमानित उपज के लिए, लगभग 70 सिलियरी गैंगलिया (35 अंडे) को अलग करें। गैंगलिया की इस संख्या के लिए विच्छेदन प्रक्रिया के लिए 2-3 घंटे और कुल प्रक्रिया के लिए कुल 4-5 घंटे लगेंगे। अलगाव प्रोटोकॉल का एक कदम-दर-कदम चित्रण चित्रा 1Aमें दिखाया गया है । सिलियरी गैंगलियन की पहचान मुश्किल हो सकती है, खासकर जब पहली बार इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है। सिलियरी गैंगलियन ऑप्टिक नर्व और कोरॉइड फिशर(चित्रा 1B)के पास स्थानीयकृत है। विच्छेदन प्रक्रिया के प्रमुख चरण चित्र 2में दिखाए गए हैं । सबसे पहले भ्रूण को अंडे से निकालकर बर्फ से ठंडे एचबीएसएस में रखा जाता है। सिर शरीर से अलग हो जाता है और एक बार फिर, एक विच्छेदन पेट्री डिश(चित्रा 2ए-2C)में बर्फ से ठंडे एचबीएसएस में रखा जाता है। फिर, चिक के सिर से आंख को हटा दिया जाता है और सिलियरी गैंगलियन को अलग किया जाता है(चित्रा 2डी-2एच)।

इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त संस्कृतियां अत्यधिक शुद्ध हैं। हालांकि, गैंगलिया की सफाई और अतिरिक्त ऊतक को हटाने से संस्कृति की सफलता और शुद्धता दृढ़ता से तय होती है। कोशिकाओं को तेजी से विकसित करने और संस्कृति में पहले दिनों में पहले से ही इस्तेमाल किया जा सकता है अगर समग्र प्रयोग ऐसा करने की आवश्यकता है । फिर भी, संस्कृतियों को 15 दिनों, या उससे अधिक के लिए बनाए रखा जा सकता है। यदि 7-8 दिनों से अधिक समय तक संस्कृतियों का उपयोग करना है, तो संस्कृति माध्यम के एक तिहाई को हर 2-3 दिनों में ताजा माध्यम से बदलना सुनिश्चित करें। 1 दिन के बाद विट्रो में, सीजी न्यूरॉन्स एक बहुध्रुवीय आकृति विज्ञान दिखाते हैं। हालांकि, न्यूराइट एक्सटेंशन तेजी से होता है, और 24 घंटे के बाद एक प्राथमिक न्यूरोनल नेटवर्क पहले से ही स्थापित होता है। विट्रो में 8 दिनों के बाद, न्यूरॉन्स पहले से ही एक ध्रुवीय राज्य में संक्रमण, जहां न्यूराइट्स में से एक फैली हुई है और अक्षतंख बनाता है । विकास के इस चरण में न्यूरोनल नेटवर्क बहुत घना है(चित्र 3 और चित्रा 4)।

सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स होते हैं जो पैरासिम्पेथेटिक तंत्रिका तंत्र से संबंधित होते हैं। वीवो में ये न्यूरॉन्स आंखों में मांसपेशियों के इनरवेशन के लिए जिम्मेदार होते हैं। ये न्यूरोनल संस्कृतियां न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स के अध्ययन के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल हैं। इसके लिए मांसपेशियों की कोशिकाओं के ऊपर सीजी न्यूरॉन्स चढ़ाया जा सकता है। लड़की छाती की मांसपेशी विच्छेदित किया गया था और 4 DIV तक विट्रो में विकसित करने और परिपक्व होने की अनुमति दी गई थी। सीजी न्यूरॉन्स तो मांसपेशियों की परत के शीर्ष पर चढ़ाया गया और सह संस्कृति 3 और दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दी । इस समय बिंदु पर, मांसपेशियों के तंतुओं का गठन किया जाता है और कई नाभिक (नीले) की उपस्थिति से आसानी से पहचाना जा सकता है। सिनैप्टिक वेसिकल ग्लाइकोप्रोटीन 2 ए (एसवी 2) इम्यूनोस्टेटिंग, एक प्रेसिनैप्टिक मार्कर सीजीएस न्यूरॉन्स एक्सॉन और मांसपेशियों के तंतुओं(चित्रा 5)के बीच स्थापित सिनेप्स की उपस्थिति दिखाता है।

Figure 1
चित्र 1: विच्छेदन प्रोटोकॉल और सिलियरी गैंगलियन की योजना। (A)अलगाव और संस्कृति प्रोटोकॉल का आरेख । (ख)आंख के पीछे के हिस्से में चिक सिलियरी गैंगलियन लोकलाइजेशन की योजना । ऑप्टिक नर्व, सिलियरी गैंगलियन और कोरॉयड फिशर तीर से संकेत दिए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: E7 लड़की सिलियरी गैंगलियन का विच्छेदन। (क)कैंची का उपयोग कर अंडे की चोटी काट लें। (ख)अंडे से भ्रूण को चम्मच से निकालकर आइस-कोल्ड एचबीएसएस के साथ विच्छेदन पेट्री डिश में रखें । (ग)गर्दन के क्षेत्र में काटकर सिर को शरीर से अलग करें। (घ)चोंच में भ्रूण के सिर को ठीक करें, जो कि 5 बल के साथ पकड़े। (ई)कोमल रोटेशन द्वारा आंख को हटा दें, जिसमें बल का उपयोग करके nº 55। (च)आंख के पीछे का दृश्य । तीर ऑप्टिक तंत्रिका, कोरॉयड विखंडन और सिलियरी गैंगलियन के स्थानीयकरण का संकेत देते हैं। (जी)सिलियरी गैंगलियन को विच्छेदन करें। (ज)विच्छेदित सिलियरी गैंगलियन । अतिरिक्त ऊतक को हटा दिया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स विट्रो में विकास। DIV 1, 3, 8 और 15 में सीजी न्यूरॉन्स के चरण विपरीत छवियां। जैसे ही सीजी न्यूरॉन्स चढ़ाया जाता है, वे तुरंत न्यूराइट आउटग्रोथ शुरू करते हैं। DIV 15 में, अक्षुण्ण नेटवर्क बहुत घना है और इस स्तर पर न्यूराइट्स पूरी तरह से dendrites और अक्षतंप में विभेदित कर रहे हैं । चरण कंट्रास्ट-छवियों को एक योजना-एपोक्रोमैट 20x पीएच 2 उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: DIV 8 में सीजी न्यूरॉन्स की इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। सीजी न्यूरॉन्स विट्रो में 8 दिनों के बाद एक अच्छी तरह से स्थापित न्यूरोनल नेटवर्क दिखाते हैं। नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे और अक्षतंप बी-III ट्यूबलिन (लाल) के साथ दाग थे । फ्लोरेसेंस इमेजन्स को प्लान-एपोक्रोमैट 20x उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सुसंस्कृत सीजी न्यूरॉन्स मांसपेशियों के तंतुओं के साथ सिनेप्स स्थापित करते हैं। सीजी न्यूरॉन्स-छाती मांसपेशी सह संस्कृतियों की इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री छवियां। धराशायी लाइनों द्वारा पहचाने गए मांसपेशी फाइबर कई नाभिक पेश करते हैं, जो DAPI (नीले) से सना हुआ था। एक्सॉन को न्यूरोफिलमेंट (लाल) के खिलाफ लेबल किया गया था और एसवी 2 (सियान) के खिलाफ सिनैप्टिक वेसिकल्स लेबल किए गए थे। छवियों को एक योजना-Apochromat 63x तेल उद्देश्य के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने सीजी न्यूरॉन्स को तैयार करने और संस्कृति का प्रदर्शन किया। सिलियरी गैंगलियन की पहचान और विच्छेदन अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए मुश्किल हो सकता है। इसलिए, हम E7 चिक सिलियरी गैंगलिया को कुशलतापूर्वक विच्छेदन करने, ऊतक को अलग करने और न्यूरोनल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए एक विस्तृत और कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं जिन्हें कम से कम 15 दिनों तक बनाए रखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के लिए भी उपयुक्त हैं।

अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर, चिक भ्रूणीय विकास के विभिन्न विकासात्मक चरणों में सिलियरी गैंगलिया का उपयोग सेल मॉडल के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, सीजी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों के लिए यह सुझाव दिया जाता है कि वे भ्रूण दिनों 7 और 818के बीच लड़की भ्रूण से अलग हो जाते हैं। भ्रूणीय चरण E8 में, सीजी न्यूरॉन्स अभी तक न्यूरोनल मृत्यु प्रक्रियाओं से नहीं गुजरा है और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं की संख्या तुलनात्मक रूप से न्यूरोनल कोशिकाओं18के साथ कम हो जाती है। यह, एक कठोर विच्छेदन प्रक्रिया और बहुत अच्छी तरह से साफ गैंगलिया के संयोजन में, फाइब्रोब्लास्ट या ग्लियल कोशिकाओं जैसे गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं द्वारा थोड़ा संदूषण के साथ सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स की अत्यधिक शुद्ध संस्कृति के लिए योगदान देगा।

सीजी न्यूरॉन्स के आइसोलेशन के दौरान एक क्रिटिकल पॉइंट्स की पहचान और सीजी की सफाई होती है । इस तरह के एक छोटे से ढांचे का विच्छेदन, सिलियरी गैंगलियन के रूप में, स्थानीयकरण, गैंगलियन की पहचान करने की क्षमता के साथ-साथ गैंगलियन के आकार को ध्यान में रखते हुए मुश्किल हो सकता है। यह सामान्य है कि गैंगलिया विच्छेदन के दौरान संदंश से जुड़ सकता है। एक सफल विच्छेदन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले विच्छेदन उपकरण बहुत महत्वपूर्ण हैं और संदंश के लिए गैंगलिया के लगाव को कम करेंगे। गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ प्रदूषण को रोकने के लिए जीसी की सफाई महत्वपूर्ण है। परिधीय तंत्रिका तंत्र के अन्य न्यूरोनल ऊतकों के विपरीत ~ 1x106 कोशिकाओं/एमएल का सेलुलर घनत्व प्राप्त करने के लिए लगभग 70 गैंगलिया को अलग करना आवश्यक है, जिसमें गैंगलिया3की 5-15x अधिक संख्या है।

संस्कृति में, पूर्ण माध्यम में 5'-एफडीयू के अलावा गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ जीसी संस्कृति के प्रदूषण को कम कर देता है। 5'-एफडीयू एक एंटी-माइटोटिक यौगिक है जो सेल प्रसार को रोकता है, अर्थात् ग्लियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट का प्रसार। माध्यम में जोड़े गए 5'-एफडीयू की एकाग्रता एस चरण में कोशिका चक्र को रोकने के लिए पर्याप्त है, लेकिन,सीजी न्यूरॉन्स3,19,20के सामान्य विकास के लिए हानिकारक नहीं है।, 5'-एफडीयू के साथ उपचार के समय को समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि सीजी न्यूरॉन्स कम समय में एक घने अक्षीय नेटवर्क स्थापित करते हैं, इसलिए चढ़ाना के समय के रूप में संस्कृति में 5'-एफडीयू जोड़ा जाना चाहिए।

इस मॉडल की मुख्य सीमाओं में से एक यह है कि यह शारीरिक परिस्थितियों में सीजी न्यूरॉन्स के सामान्य विकास का प्रतिनिधि नहीं है। ओवो में, सीजी न्यूरॉन्स के बारे में आधे लड़की भ्रूण विकास के8 और14 वें दिन के बीच मर जाते हैं । संस्कृति में, सीजी न्यूरॉन्स की संख्या में कोई कमी नहीं है जब माध्यम न्यूरोट्रोफिक कारकों के साथ पूरक होता है जो इसके अस्तित्व1,,6,,14की अनुमति देता है।

चिक सिलियरी गैंगलियन के विच्छेदन से प्राप्त न्यूरोनल आबादी स्वायत्त तंत्रिका तंत्र से संबंधित कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स की एक समरूप आबादी है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीजी की कोरॉइड आबादी में न्यूरोट्रांसमीटर की अभिव्यक्ति लक्ष्य-चालित है, जो सह-संस्कृति24में उपयोग की जाने वाली मांसपेशियों के प्रकार के आधार पर बाधित हो सकती है। यदि अध्ययन का उद्देश्य आनुवंशिक पहचान या मोटर न्यूरॉन के उप प्रकार से संबंधित है, तो सीजी न्यूरॉन्स सबसे अच्छा उपयुक्त न्यूरोनल मॉडल नहीं हो सकता है। इसके अलावा, मांसपेशियों के तंतुओं के इनरवेशन में मोटर न्यूरॉन्स की विशिष्टता सीजी न्यूरॉन सह-संस्कृतियों का उपयोग करते समय पूरी नहीं की जा सकती है क्योंकि, इस मामले में, मांसपेशियों के तंतुओं को25को गुणा किया जा सकता है। हालांकि, इस न्यूरोनल संस्कृति के कई फायदे हैं, अंडे को बनाए रखने और इनक्यूबेट करने के लिए केवल बुनियादी उपकरणों की आवश्यकता होती है, यह एक उचित सस्ती प्रक्रिया है और, अधिक महत्वपूर्ण बात, न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स1के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है, क्योंकि सीजी न्यूरॉन्स न्यूरोट्रांसमिशन तंत्र रीढ़ की हड्डी में होने वाले लोगों के समान हैं। इस प्रकार के अध्ययनों के लिए पहले उपयोग किए जाने वाले कोशिका मॉडल 12 ,21,22,,23,23रीढ़ की हड्डी से संवेदी न्यूरॉन्स थे । हालांकि, ये सह-संस्कृतियां न्यूरॉन्स की एक विषम आबादी से बनी थीं, सभी कोलिनेर्जिक नहीं और, इस प्रकार, न्यूरॉन्स का केवल एक छोटा सा हिस्सा मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक संपर्क स्थापित करने में सक्षम था1। इस कार्य में प्रदर्शित विकासात्मक विश्लेषण (इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री) के अलावा अन्य परखें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और न्यूरोनल सर्वाइवल जैसी सीजी संस्कृतियों में की जा सकती हैं।

इस प्रोटोकॉल के आधार पर अतिरिक्त वैज्ञानिक प्रश्नों को संबोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कैसे विशिष्ट mRNAs और प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण synapse गठन और कार्य को विनियमित करते हैं । इसके अलावा, तंत्रिका-मांसपेशी सह-संस्कृतियों को आसानी से स्थापित किया जा सकता है और आगे न्यूरोमस्कुलर रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जब चोट की साइट न्यूरोमस्कुलर जंक्शन है। न्यूरोमस्कुलर रोग इस अर्थ में प्रकृति में विषम होते हैं कि शिथिलता मांसपेशियों के साथ ही जुड़ी हो सकती है, परिधीय तंत्रिकाएं या न्यूरोमस्कुलर जंक्शन26। इस प्रकार, इन सह-संस्कृतियों के माध्यम से न्यूरोमस्कुलर जंक्शन परिवर्तनों का अध्ययन करना संभव होगा जो अंततः न्यूरोमस्कुलर रोगों के विकास और प्रगति को रेखांकित करते हैं। एक और दिलचस्प संभावना माउस ट्राइजेमिनल सिस्टम के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए किया जाएगा। ये न्यूरॉन्स आसानी से सुलभ हैं, और उनके विकास पैटर्न प्रसिद्ध27है। क्योंकि चूहों आनुवंशिक हेरफेर के लिए उत्तरदायी हैं और ट्राइजेमिनल प्रणाली अच्छी तरह से स्थलाकृतिक मानचित्र गठन के संदर्भ में विशेषता है न्यूरोनल विकास का अध्ययन करने के लिए ट्राइजेमिनल-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग करके नई संभावनाएं उत्पन्न होती हैं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम का वित्तपोषण यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) द्वारा परियोजनाओं के तहत सेंट्रो 2020 क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम के माध्यम से किया गया था- 01-0145-फेडरर-000008: ब्रेनहेल्थ 2020, सेंट्रो2020 सेंट्रो-01-0145-फेडर-00003:पीएज, सेंट्रो-01-0246-फेडरर-00018: मेडिसिस, और प्रतिस्पर्धा 2020 के माध्यम से - एफसीटी के माध्यम से प्रतिस्पर्धा और अंतर्राष्ट्रीयकरण और पुर्तगाली राष्ट्रीय निधियों के लिए परिचालन कार्यक्रम - Fundação पैरा एक Ciência e a Tecnologia, I.P., परियोजनाओं के तहत UIDB/04539/2020, यूआईडीबी/04501/2020, POCI-01-0145-FedER-022122: PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, और व्यक्तिगत अनुदान SFRH/BD/141092/2008 २०१८ (एमडी), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) और मैरी क्यूरी एक्शन द्वारा-IRG, 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 162 सेल कल्चर सिलियरी गैंगलियन चिक भ्रूण विच्छेदन पैरासिम्पेथेटिक न्यूरॉन्स न्यूरोमस्कुलर जंक्शन इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी
अलगाव और चिक सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स की संस्कृति
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Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. … More

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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