Summary
الـ(غانغليا) الفرخ (CG) هي جزء من الجهاز العصبي اللالامبالي. وقد تبين الثقافات العصبية من الخلايا العصبية CG فرخ لتكون نماذج الخلايا الفعالة في دراسة التفاعلات العضلية العصبية. نحن نصف بروتوكول مفصل لتشريح, تفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية CG من الأجنة فرخ.
Abstract
الرموش ganglia (CG) هي جزء من الجهاز العصبي الملامي وهي مسؤولة عن ازمن الأنسجة العضلية الموجودة في العين. وينتَكَّس هذا العقدة من قِبل سكان متجانسين من الخلايا العصبية الهدّانية والتُمرية التي تُعمّق ألياف العضلات الملساء والملسِمة، على التوالي. كل من هذه الأنواع العصبية تنظيم هياكل العين المحددة والوظائف. على مر السنين، أظهرت الثقافات العصبية من ganglia ciliary الفرخ لتكون نماذج الخلايا الفعالة في دراسة التفاعلات العضلات العصبية، والتي التواصل من خلال نقاط الاشتباك العصبي cholinergic. الخلايا العصبية العقدية الإستيلية هي, في غالبيتها, cholinergic. وقد تبين أن هذا النموذج الخلية تكون مفيدة نسبيا لنماذج الخلايا غير المتجانسة المستخدمة سابقا التي تضم عدة أنواع الخلايا العصبية, إلى جانب cholinergic. تشريحيا، يتم ترجمة العقدة الهديلي بين العصب البصري (ON) والصدع المشيمية (CF). هنا، ونحن وصف إجراء مفصل لتشريح، والتفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية ganglia cillia ciliary من الأجنة الفرخ. نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من أجل الحصول على ثقافات خلوية نقية ومستقرة للغاية من الخلايا العصبية CG ، مع تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية للعملية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات في المختبر لمدة 15 يوما، و، هنا، ونحن نظهر التطور الطبيعي لثقافات CG. وتظهر النتائج أيضا أن هذه الخلايا العصبية يمكن أن تتفاعل مع ألياف العضلات من خلال العصبية العضلية cholinergic نقاط الاشتباك العصبي.
Introduction
تنتمي الخلايا العصبية العقدية الإستيلية (CG) إلى الجهاز العصبي اللالاماثي. هذه الخلايا العصبية هي cholinergic, أن تكون قادرة على إنشاء مسكارينية أو نيكوتينية المشبك1,,2,,3. تشريحيا, وتقع في CG الجزء الخلفي من العين بين العصب البصري (ON) والصدع المشيمية (CF) ويتكون من حوالي 6000 الخلايا العصبية في المراحل الجنينية المبكرة1,4. للأسبوع الأول في الثقافة، الخلايا العصبية العقدية cillion تقديم مورفولوجيا متعددة الأقطاب. بعد أسبوع واحد، فإنها تبدأ في الانتقال إلى دولة أحادية القطب، مع نيوريت واحد تمديد وتشكيل محور عصبي5. بالإضافة إلى ذلك، يموت ما يقرب من نصف الخلايا العصبية CG بيناليوم الثامنو 14 من نمو الجنين الفرخ، من خلال عملية مبرمجة لوفيات الخلايا. هذا الانخفاض في عدد الخلايا العصبية يؤدي إلى مجموع السكان من العقدة الهدبي من حوالي 3000 الخلايا العصبية6,7,8. في المختبر, لا يوجد انخفاض في عدد الخلايا العصبية CG عندما نمت مع خلايا العضلات9 وCG الخلايا العصبية يمكن أن تكون مثقف لعدة أسابيع1,9.
ganglion ciliary يتكون من سكان متجانس من الخلايا العصبية ciliary والخلايا العصبية المشيمية, كل تمثل نصف السكان العصبية في CG, اغراء عضلة العين. هذان النوعان من الخلايا العصبية هي هيكليا, تشريحيا ووظيفيا متميزة. الخلايا العصبية الإستيالية تُؤزّر ألياف العضلات المُقَرَّبة على القزحية والعدسة، وهي مسؤولة عن انكماش التلاميذ. الخلايا العصبية المشيمية إينرفاتي العضلات الملساء من المشيمية1,10,11,12.
وقد ثبت ثقافات الخلايا العصبية العقدية الدجاج ciliary لتكون أدوات مفيدة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي العصبية العضلية وتشكيل المشبك1,5,9. بالنظر إلى أن العصبية العصبية العضلية هي cholinergic13, باستخدام السكان العصبية التي هي cholinergic – الخلايا العصبية CG – ظهرت كبديل محتمل لنماذج الخلايا السابقة14. هذه النماذج تتكون في السكان العصبية heterogenous, التي جزء صغير فقط هو cholinergic. بدلا من ذلك، الخلايا العصبية العقدية cillion تطوير سريع نسبيا في المختبر، وبعد ما يقرب من 15 ساعة تشكل بالفعل نقاط الاشتباك العصبي1. وقد استخدمت الخلايا العصبية CG كنظام نموذجي على مر السنين لدراسات بحثية متميزة، نظرا لسهولة نسبيا من العزلة والتلاعب. وتشمل هذه التطبيقات الدراسات optogenetic, تطور المشبك, المبرمج والتفاعلات العصبية العضلية14,15.
نحن وصف إجراء مفصل لتشريح, تفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية ganglia cillia cil cil cil مع الجنينية يوم 7 (E7) أجنة الفرخ. نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من أجل الحصول على الثقافات الخلوية نقية ومستقرة للغاية من الخلايا العصبية الكولينية. ونحن أيضا تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية للبروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا، وسوف تحسن نوعية الثقافات العصبية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات في المختبر لمدة 15 يوما على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- إعداد الكواشف
ملاحظة: المواد اللازمة لهذا الإجراء هي التالية: ملقط (nº 5 و Nº 55)، ملاقط جراحية، وأطباق بتري تشريح (القاع الأسود)، 24-2000 لوحات، ماصة باستور البلاستيكية، الماصات الزجاج المصقول النار، 10 مل حقنة، 0.22 μm مرشح حقنة.
- إعداد وتعقيم جميع المواد اللازمة للبروتوكول بما في ذلك أغطية الزجاج، ملقط (nº 5 و Nº 55)، ملاقط جراحية، أطباق بيتري (القاع الأسود)، المقطر H2O، الماصات والمواد اللازمة لعملية جراحية.
- تحضير 0.1 ملغ/مل بولي-D-ليسين (PDL) حل.
- إعادة تكوين PDL في 0.1 M بورات العازلة (درجة حُرَس 8.2) إلى تركيز 1 ملغم /مليلتر (10x محلول).
- تخفيف 1:10 في 166.6 mM بورات العازلة (درجة حُر 8.2) للحصول على تركيز نهائي من 0.1 ملغ / مل.
- تحضير 10 ميكروغرام / مل حل لامينين.
- تخفيف 1 ملغ / مل لامين في وسط عصبي عادي إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- تحضير هانك متوازنة الملح الحل (HBSS): 5.36 م م ك. 0.44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl , 4.16 mM NaHCO3 , 0.34 mM Na2HPO4·2H2O , 5 mM الجلوكوز , 1 mmodium pyruvate , 10 mM HEPES buffer , 0.001٪ فينول أحمر. ضبط درجة اله إلى 7.2.
- إعداد 0.1% محلول التربسين.
- تذوب 5 ملغ من التربسين 1:250 مسحوق في 5 مل من HBSS لتركيز النهائي من 0.1٪
- وضع في خلاط الأسطوانة في 4 درجة مئوية حتى حل تماما.
- مرشح باستخدام حقنة 10 مل ومرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- إعداد ciliary ganglia المتوسطة غير مكتملة: متوسطة عصبية بدون الجلوتامين، 1X B27 (الصورة الحساسة)، 10٪ تنشيط الحرارة مصل الخيل، 2٪ تنشيط الحرارة FBS، 12.5 U/mL البنسلين / الستربتوميسين (0.25x) و 2 mM الجلوتامين. استخدام الكواشف العقيمة وإعداد المتوسطة في ظل ظروف معقمة.
- إعداد ciliary ganglia المتوسطة كاملة (تستكمل مع عوامل النمو): إلى المتوسطة غير مكتملة، إضافة 5 ng/mL GDNF و 5 ng/mL CNTF.
2. إعداد أغطية الزجاج للوحات 24-جيدا
- ضع العدد المطلوب من الأغطية الزجاجية داخل حاوية مقاومة للأحماض وأضف 65٪ من حمض النيتريك حتى يتم غمر جميع الأغطية. ضع الحاوية في شاكر مداري واحتضانها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) بسرعة 1000 دورة في الدقيقة.
- في اليوم التالي، نقل بعناية حمض النيتريك إلى خزان صغير وتخزينها لمزيد من الاستخدام. حمض النيتريك يمكن إعادة استخدامها 2-3x.
- بعناية، إضافة المقطر H2O إلى الأغطية لإزالة حمض النيتريك المتبقية. وضع في التحريض لمدة 30 دقيقة، والتخلص من محلول الغسيل وتكرار هذا 5x.
- شطف الأغطية مع 75٪ الإيثانول مرتين.
- فصل بعناية ووضع الأغطية الفردية في رف معدني مغطاة رقائق الألومنيوم واحتضان في 50 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة أو حتى يجف تماما.
ملاحظة: لا الأوتوكلاف الزجاج يغطي كما أنها سوف التمسك بعضها البعض. - تعقيم الأغطية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10-15 دقيقة. الحفاظ على الأغطية العقيمة لثقافة الأنسجة العصبية.
3. طلاء الزجاج يغطي لوحات ل 24-جيدا
- باستخدام ملاقط معقمة، ضع غطاء واحد في كل بئر من لوحة 24-well.
- إضافة 500 μL من 0.1 ملغم / مل PDL واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، شطف الأغطية مرتين مع المقطر العقيم H2O. ثم، إضافة 500 μL من الماء المقطر إلى كل غطاء ويترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من الماء وأضف 350 ميكرولتر من محلول لامينيين 10 ميكروغرام/مل في كل بئر.
- مكان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- قبل طلاء الخلايا، قم بإزالة محلول اللامينيين واغسل مرتين بوسيلة عصبية بسيطة.
ملاحظة: من المهم أن لا تجف الأغطية في أي وقت. - إضافة 300 ميكرولتر من المتوسط الكامل وترك في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى وقت الطلاء. قبل طلاء الخلايا، قم بإزالة هذه الوسيطة.
4. ثقافة ganglia ciliary من جنين الدجاج (يوم الجنين 7)
- تشريح العقدة الهدّية (CG)
- إزالة البيض من حاضنة ورش لهم مع 75٪ الإيثانول.
ملاحظة: يتم تخزين البيض في ~ 16 درجة مئوية قبل أن تحضن في 37.7 درجة مئوية لمدة 7 أيام (أو المرحلة الجنينية المطلوبة). البيض المستخدم هنا هو من أنواع الدجاج روس. - قطع الجزء العلوي من البويضة مع مقص واخراج الجنين باستخدام ملعقة. ضع الجنين في طبق بيتري مع HBSS الباردة الجليدية وفصل الرأس عن الجسم عن طريق قطع في منطقة الرقبة.
ملاحظة: بمجرد إزالة الجنين من البويضة، يمكن أن تنتج البروتياز المسؤولة عن موت الخلايا. من المهم فصل الرأس بسرعة عن الجسم عندما يكون الجنين خارج القشرة لتقليل موت الخلايا. - إبقاء رأس الجنين في الجليد البارد HBSS.
- أمسكي رأس الجنين وأصلحه في منقار الفرخ مع nº 5 ملقط. ثم مع nº 55 ملقط، تبدأ لإزالة طبقة رقيقة من الجلد حول العين.
- إزالة بعناية العين وتدويره للوصول إلى الجزء الخلفي. في حين فصل العين عن رأس الفرخ، لاحظ أن العصب البصري يجري تقسيمها. وهذا سيساعد على توطين العقدة الهدجي.
- مرة واحدة يتم فصل العين، يبقيه مع الجانب الخلفي حتى ولاحظ العقدة ciliary المجاورة للعصب البصري مقطعة والصدع choroid. قد لا يزال العصب قبل الغلياني ملتصقاً بالعصاب الهدبي، مما يسهل التعرف عليه.
- تشريح العقدة ciliary من كل عين ونظيفة بشكل جيد جدا عن طريق إزالة الأنسجة الزائدة حول كل ganglion.
ملاحظة: أن يكون لها عائد من ~ 1x106 الخلايا / مل، تشريح ~ 70 CGs. يرجى ملاحظة أن عدد الخلايا التي تم الحصول عليها يحتوي على خلايا غير الخلايا العصبية كذلك. لتقليل عدد الخلايا غير العصبية ، وبالتالي ، زيادة نقاء السكان العصبيين ، من المهم جدًا تنظيف العقدة الهجبي قدر الإمكان ، وإزالة جميع الأنسجة الزائدة.
- إزالة البيض من حاضنة ورش لهم مع 75٪ الإيثانول.
- انفصام وثقافة من ciliary ganglia
- جمع جميع ganglia ciliary إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصات البلاستيك معقمة باستور.
ملاحظة: من المهم أن تكون ما قبل الرطب ماصة باستور لتقليل تعلق من ganglia إلى جدار من ماصة. - الطرد المركزي ganglia ciliary لمدة 2 دقيقة في 200 × ز.
- بعناية، إزالة جميع توسط HBSS باستخدام ماصة باستور ثم ميكروبيبيت P1000. إضافة 1 مل من 0.1٪ محلول التربسين واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في حمام مائي، دون التحريض.
- جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 200 x غم.
- إزالة على الفور حل التربسين وإضافة 1 مل من المتوسطة غير مكتملة.
ملاحظة: يحتوي الوسيط غير الكامل على المصل الذي سيوقف فوراً تأثير التربسين. - جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة في 200 × ز وإزالة جميع المتوسطة.
- إضافة 350-500 μL من المتوسط الكامل.
ملاحظة: يعتمد الحجم الضروري لتفكك الخلايا على عدد العقدة الهدجية التي تم الحصول عليها، وبالتالي، على حجم بيليه الذي تم الحصول عليه. ل ~70 CG فمن المستحسن استخدام 500 ميكرولتر من المتوسط. - فصل CGs عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10-15x الأولى باستخدام P1000 تليها 10-15x باستخدام ماصة الزجاج المصقول النار. تجنب تشكيل فقاعة الهواء لتقليل فقدان الخلايا.
ملاحظة: احتفظ بالتعليق الخلوي على الجليد حتى الطلاء. - تحديد الكثافة الخلوية باستخدام حل Trypan الأزرق وغرفة Neubauer القياسية.
- لوحة 1 × 104 خلايا / مل في كل بئر من لوحة 24-جيدا عن طريق تخفيف حجم مناسب من تعليق الخلية في 500 ميكرولتر من المتوسط الكامل (مع استكمال 10 μM 5'FDU).
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
- جمع جميع ganglia ciliary إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصات البلاستيك معقمة باستور.
5. الكيمياء المناعية وتحليل الصور من الخلايا العصبية ciliary
- إجراء فحص مناعي للكيمياء الواردة في هذه الورقة كما سبق وصفها16,17.
- استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس أحادية النسيلة b-III tubulin (1:1000، T8578)، الدجاج أحادي النسيلة العصبية M (1:1000، AB5735)، الماوس أحادي النسيل SV2 (1:1000، AB2315387).
- كأضاد ثانوية، استخدم أجسام الماعز المضادة للماوس المضادة للماعز 568 مترافق (1:1000، A11031)، Alexa Fluor 568-الاقتران المضاد للدجاج (1:1000، A11041)، أليكسا فلور 647 مترافق مع الأجسام المضادة للماوس (1:1000، A21235).
- جبل يغطي الأغطية باستخدام متوسطة التركيب مع DAPI، للتلوين النووي (P36935).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المدة المقدرة لهذا الإجراء يعتمد بإحكام على العائد اللازم لكل تجربة محددة، وبالتالي، على عدد من ganglia ciliary التي تحتاج إلى عزل. لغلة يقدر 1 × 106 خلايا / مل، عزل حوالي 70 ganglia ciliary (35 بيضة). لهذا العدد من العقدية، وسوف يستغرق 2-3 ساعات لإجراء تشريح وما مجموعه 4-5 ساعات لإجراء مجموع. يتم عرض توضيح خطوة بخطوة لبروتوكول العزل في الشكل 1A. قد يكون تحديد العقدة الهدبي صعباً، خاصة عند تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى. يتم ترجمة العقدة الهليلية بالقرب من العصب البصري والصدع المشيمي(الشكل 1B). الخطوات الرئيسية لإجراء التشريح مبينة في الشكل 2. أولاً، تتم إزالة الجنين من البويضة ووضعه في HBSS بارد. يتم فصل الرأس من الجسم، ومرة أخرى، وضعت في الجليد البارد HBSS في طبق بيتري تشريح (الشكل 2A-2C). ثم تتم إزالة العين من رأس الفرخ ويتم عزل العقدة الهدجي(الشكل 2D-2H).
الثقافات التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول هي نقية للغاية. ومع ذلك، تنظيف ganglia وإزالة الأنسجة الزائدة يملي بقوة نجاح ونقاء الثقافة. يطوّر الخلايا سريعا ويستطيع كنت سابقا استعملت في الأيام أولى في ثقافة إن ال شاملة تجربة يتطلّب هكذا. ومع ذلك، يمكن الحفاظ على الثقافات لمدة 15 يوما، أو أكثر. إذا كان استخدام الثقافات لفترة أطول من 7-8 أيام، تأكد من استبدال ثلث الوسط الثقافي بوسط جديد كل 2-3 أيام. بعد يوم واحد في المختبر، تظهر الخلايا العصبية CG مورفولوجيا متعددة الأقطاب. ومع ذلك، يحدث تمديد نيوريت بسرعة، وأنشئت بالفعل شبكة الخلايا العصبية الأولية بعد 24 ساعة. بعد 8 أيام في المختبر، انتقلت الخلايا العصبية بالفعل إلى دولة أحادية القطب، حيث واحدة من neurites يمتد ويشكل محور عصبي. شبكة الخلايا العصبية كثيفة جدا في هذه المرحلة من التنمية(الشكل 3 والشكل 4).
الخلايا العصبية العقدية الإستيلية هي الخلايا العصبية الكولينية التي تنتمي إلى الجهاز العصبي اللالاماثي. في الجسم الحي، وهذه الخلايا العصبية هي المسؤولة عن اقناع العضلات في العين. هذه الثقافات العصبية هي مناسبة جدا لدراسة نقاط الاشتباك العصبي العضلي. لهذا, يمكن مطلي الخلايا العصبية CG على رأس خلايا العضلات. تم تشريح العضلات الصدرية الفرخ وسمح لتطوير maturate في المختبر حتى DIV 4. ثم مطلي الخلايا العصبية CG على رأس طبقة العضلات والثقافة المشتركة سمح لتطوير لمدة 3 أيام أخرى. في هذه المرحلة الزمنية ، تتشكل ألياف العضلات ويمكن التعرف عليها بسهولة من خلال وجود نوات متعددة (زرقاء). متشابك vesicle glycoprotein 2A (SV2) المناعة, علامة presynaptic يظهر وجود نقاط الاشتباك العصبي التي تنشأ بين محاور عصبية CG والألياف العضلية (الشكل 5).
الشكل 1: مخطط بروتوكول التشريح والعصابة الهدّانية. (أ) مخطط بروتوكول العزلة و الثقافة. (ب) مخطط تعريب الهجل العقدي في الجزء الخلفي من العين. يشار إلى العصب البصري والعشنجة الهليلية والشقوق المشيمية من السهام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح من E7 فرخ cillion. (أ) قطع الجزء العلوي من البيضة باستخدام مقص. (ب) إزالة الجنين من البويضة مع ملعقة ووضعها في طبق بتري تشريح مع HBSS الجليد الباردة. (ج) فصل الرأس عن الجسم عن طريق قطع في منطقة الرقبة. (D) إصلاح رأس الجنين في منقار، عقد مع قوة nº 5. (E) إزالة العين عن طريق تناوب لطيف باستخدام قوة nº 55. (F) الرؤية الخلفية للعين. تشير الأسهم إلى توطين العصب البصري والشقوق المشيمية والعندلي. (ز) تشريح العقدة ciliary. (H) تشريح العقدة ciliary. وينبغي إزالة الأنسجة الزائدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تطوير الخلايا العصبية العقدية الإستيلية في المختبر. صور النقيض من المرحلة من الخلايا العصبية CG في DIV 1, 3, 8 و 15. كما مطلية الخلايا العصبية CG، فإنها تبدأ على الفور نوريتج. في DIV 15 ، شبكة محور عصبي كثيفة جدا ، وفي هذه المرحلة يتم تمييزها تماما في نيوريتات dendrites و المحاور. تم الحصول على صور الطور التباين باستخدام مجهر confocal مع خطة-Apochromat 20x ph2 الهدف. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكيمياء المناعية للخلايا العصبية CG في DIV 8. تظهر الخلايا العصبية CG شبكة الخلايا العصبية راسخة بعد 8 أيام في المختبر. كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق) وكانت مُلَخّطات ملونة بـ b-III tubulin (أحمر). تم الحصول على صور الفلوريسنس باستخدام مجهر مشترك مع هدف خطة Apochromat 20x. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الخلايا العصبية CG المستزرعة إنشاء نقاط الاشتباك العصبي مع ألياف العضلات. صور الكيمياء المناعية من الخلايا العصبية CG-الصدرية العضلات الثقافات المشتركة. ألياف العضلات التي حددتها خطوط متقطعة تقدم نوات متعددة، والتي كانت ملطخة DAPI (الأزرق). تم تصنيف axons ضد الليفية العصبية (الحمراء) والهيكلات متشابك وصفت ضد SV2 (سماوي). تم الحصول على الصور باستخدام المجهر confocal مع خطة Apochromat 63x هدف النفط. شريط مقياس: 20 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، أظهرنا كيفية إعداد الخلايا العصبية CG وثقافتها. يمكن أن يكون تحديد وتشريح العقدة الهدجية صعبًا على المستخدمين غير المُجَرَّبين. لذلك، نقدم إجراء مفصل وخطوة بخطوة لتشريح بكفاءة cillia الفرخ E7، وفك الأنسجة وإعداد الثقافات العصبية التي يمكن الحفاظ عليها لمدة 15 يوما على الأقل. الخلايا العصبية العقدية ciliary التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول هي أيضا مناسبة للثقافة المشتركة مع خلايا العضلات.
يمكن استخدام العقدة الإستولية في المراحل التنموية المختلفة من التطور الجنيني الفرخ كنموذج خلية ، اعتمادًا على الغرض من الدراسة. ومع ذلك، لثقافات الخلايا العصبية CG يقترح أن تكون معزولة من الجنين فرخ بين أيام الجنين 7 و 818. في المرحلة الجنينية E8, الخلايا العصبية CG لم تخضع بعد عمليات الموت العصبي ويتم تخفيض عدد الخلايا غير العصبية نسبيا مع الخلايا العصبية18. هذا، في تركيبة مع إجراء تشريح صارمة و ganglia تنظيفها بشكل جيد جدا، وسوف تسهم لثقافة نقية للغاية من الخلايا العصبية العقدية ciliary، مع القليل من التلوث من قبل الخلايا غير العصبية، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا الدبقية.
أثناء عزل الخلايا العصبية CG، واحدة من النقاط الحرجة هو تحديد وتنظيف CG. تشريح مثل هذا الهيكل الصغير، مثل العقدة ciliary، يمكن أن يكون من الصعب النظر في التعريب، والقدرة على تحديد العقدة، فضلا عن حجم العقدة نفسها. من الطبيعي أن العقدية قد نعلق على ملقط أثناء تشريح. أدوات تشريح عالية الجودة مهمة جداً لتشريح ناجحة وسوف تقلل من ارتباط ganglia إلى ملقط. تنظيف GC مهم لمنع التلوث بالخلايا غير العصبية. فمن الضروري لعزل ما يقرب من 70 ganglia للحصول على كثافة الخلوية من ~ 1x106 الخلايا / مل، على النقيض من الأنسجة العصبية الأخرى من الجهاز العصبي المحيطي التي لديها عدد أكبر 5-15x من ganglia3.
في الثقافة، إضافة 5'FDU إلى المتوسط الكامل يقلل من تلوث الثقافة GC مع الخلايا غير العصبية. 5'-FDU هو مركب مضاد للميتوتيك يمنع انتشار الخلايا، وهي انتشار الخلايا الدبقية والليفية. تركيز 5'-FDU إضافة إلى المتوسطة كافية لوقف دورة الخلية في مرحلة S ولكن لا يضر التطور الطبيعي للخلايا العصبية CG3,19,20. يمكن تعديل وقت العلاج مع 5'-FDU. ومع ذلك، منذ الخلايا العصبية CG إنشاء شبكة مكثفة محور عصبي في وقت قصير، 5'-FDU ينبغي أن تضاف إلى الثقافة في وقت مبكر من وقت الطلاء.
واحدة من القيود الرئيسية لهذا النموذج هو أنه لا يمثل التطور الطبيعي للخلايا العصبية CG في ظل الظروف الفسيولوجية. في أوفو، يموت حوالي نصف الخلايا العصبية CG بيناليوم الثامنو 14 من تطور الجنين الفرخ. في الثقافة، لا يوجد انخفاض في عدد الخلايا العصبية CG عندما يتم استكمال المتوسطة مع العوامل العصبية التي تسمحببقائها 1,6,14.
السكان العصبية التي تم الحصول عليها من تشريح العقدة الفرخ هو سكان متجانس من الخلايا العصبية cholinergic, تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإرادي. تجدر الإشارة إلى أن التعبير عن الناقلات العصبية في السكان choroid من CG هو الهدف يحركها, والتي قد تكون عائقا اعتمادا على نوع من العضلات المستخدمة في ثقافة المشتركة24. إذا كان الهدف من الدراسة يرتبط بالهوية الوراثية أو النوع الفرعي للخلايا العصبية الحركية نفسها ، فقد لا تكون الخلايا العصبية CG أفضل نموذج عصبي مناسب. أيضا، خصوصية الخلايا العصبية الحركية في عنبر من ألياف العضلات قد لا تتحقق عند استخدام CG العصبية المشتركة الثقافات منذ, في هذه الحالة, يمكن أن تتضاعف ألياف العضلات25. ومع ذلك، هذه الثقافة العصبية له العديد من المزايا، فإنه يتطلب فقط المعدات الأساسية للحفاظ على واحتضان البيض، وهو إجراء غير مكلفة إلى حد معقول، والأهم من ذلك، يوفر نموذجا ممتازا لدراسة العصبية العضلية نقاط الاشتباك العصبي1، منذ الخلايا العصبية CG آليات العصبية هي مشابهة جدا لتلك التي تحدث في الخلايا العصبية الحركية الشوكية. وكانت نماذج الخلايا المستخدمة سابقا لهذا النوع من الدراسات الخلايا العصبية الحسية من الحبل الشوكي12,21,22,23. ومع ذلك، كانت هذه الثقافات المشتركة تتألف من مجموعة غير متجانسة من الخلايا العصبية، وليس كل الكولليني، وبالتالي، كان جزء صغير فقط من الخلايا العصبية قادرة على إقامة اتصالات وظيفية مع خلايا العضلات1. إلى جانب التحليل التنموي (الكيمياء المناعية) أظهرت في هذا العمل يمكن إجراء فحوصات أخرى في الثقافات CG مثل الفيزيولوجيا الكهربائية والبقاء على قيد الحياة العصبية.
ويمكن، استناداً إلى هذا البروتوكول، معالجة المسائل العلمية الإضافية، على سبيل المثال، كيف أن التعريب دون الخلوي للـ mRNAs محددة والبروتينات ينظم تكوين المشبك الوظيفي. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة الثقافات المشتركة العضلات العصبية التي أنشئت واستخدامها كذلك لدراسة الأمراض العصبية العضلية عندما يكون موقع الإصابة هو تقاطع العصبية العضلية. الأمراض العصبية العضلية غير متجانسة في الطبيعة بمعنى أن الخلل الوظيفي قد يكون مرتبطا مع العضلات نفسها، والأعصاب الطرفية أو تقاطعات العصبية العضلية26. وهكذا، من خلال هذه الثقافات المشتركة سيكون من الممكن دراسة التعديلات العصبية العضلية التي تكمن في نهاية المطاف في تطور وتطور الأمراض العصبية العضلية. وهناك احتمال آخر للاهتمام هو تكييف هذا البروتوكول لنظام ثلاثي الماوس. هذه الخلايا العصبية يمكن الوصول إليها بسهولة، ونمط نموها هو معروف27. لأن الفئران قابلة للتلاعب الجيني ويتميز نظام ثلاثي التوائم بشكل جيد من حيث تشكيل خريطة الطبوغرافية تنشأ إمكانيات جديدة باستخدام بروتوكول ثلاثي التوائم لدراسة التنمية العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (ERDF) ، من خلال برنامج التشغيل الإقليمي Centro 2020 في إطار مشاريع CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-00003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS، ومن خلال مسابقة المنافسة 2020 - البرنامج التشغيلي للقدرة التنافسية والتدويل والصناديق الوطنية البرتغالية عبر FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., بموجب مشاريع UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020، POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI، PTDC/SAU-NEU/104100/2008، والمنح الفردية SFRH/BD/141092 /2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) ومن قبل ماري كوري الإجراءات - IRG, 7 برنامج إطار العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
