Summary
I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico. Le colture neuronali dei neuroni CG del pulcino hanno dimostrato di essere modelli cellulari efficaci nello studio delle interazioni nervose del nervo. Descriviamo un protocollo dettagliato per la dissezione, la dissociazione e la cultura in vitro dei neuroni CG da embrioni di pulcino.
Abstract
I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico e sono responsabili dell'innervazione dei tessuti muscolari presenti nell'occhio. Questo ganglio è costituito da una popolazione omogenea di neuroni ciliari e conoidi che innervare fibre muscolari striate e lisce, rispettivamente. Ognuno di questi tipi neuronali regolano specifiche strutture e funzioni oculari. Nel corso degli anni, le colture neuronali dei gangli ai pulcini hanno dimostrato di essere efficaci modelli cellulari nello studio delle interazioni muscolo-nervosa del sistema, che comunicano attraverso le sinapsi colinergiche. I neuroni gangliari ciliari sono, nella sua maggioranza, colinergici. Questo modello cellulare ha dimostrato di essere utile in modo comparativo a modelli cellulari eterogenei usati in precedenza che comprendono diversi tipi neuronali, oltre al colinergico. Anatomicamente, il ganglio ciliare è localizzato tra il nervo ottico (ON) e la fessura corale (CF). Qui, descriviamo una procedura dettagliata per la dissezione, la dissociazione e la coltura in vitro dei neuroni gangliari ciliari da embrioni di pulcino. Forniamo un protocollo passo-passo al fine di ottenere colture cellulari altamente pure e stabili di neuroni CG, evidenziando le fasi chiave del processo. Queste culture possono essere mantenute in vitro per 15 giorni e, con la presente, mostriamo il normale sviluppo delle culture CG. I risultati mostrano anche che questi neuroni possono interagire con le fibre muscolari attraverso sinapsi colinergiche neuro-muscolari.
Introduction
I neuroni gangliari cigliari (CG) appartengono al sistema nervoso parasimpatico. Questi neuroni sono colinergici, essendo in grado di stabilire sinapsi muscariche o nicotiniche1,2,3. Anatomicamente, il CG si trova nella parte posteriore dell'occhio tra il nervo ottico (ON) e la fessura contoide (CF) e consiste di circa 6000 neuroni nei primi stadi embrionali1,4. Per la prima settimana di cultura, i neuroni gangliari ciliari presentano una morfologia multipolare. Dopo una settimana, iniziano a passare a uno stato unipolare, con un neurite che estende e forma l'assone5. Inoltre, circa la metà dei neuroni CG muore tra l'8e il 14esimo giorno di sviluppo dell'embrione del pulcino, attraverso un processo programmato di morte cellulare. Questa diminuzione del numero di neuroni si traduce in una popolazione totale del ganglio ciliare di circa 3000 neuroni6,7,8. In vitro, non c'è nessuna riduzione del numero di neuroni CG quando coltivato con le cellule muscolari9 e neuroni CG possono essere coltivati per diverse settimane1,9.
Il ganglio ciliario è costituito da una popolazione omogenea di neuroni ciliari e neuroni conoidi, ognuno dei quali rappresenta la metà della popolazione neuronale nel CG, innervando il muscolo dell'occhio. Questi due tipi di neuroni sono strutturalmente, anatomicamente e funzionalmente distinti. I neuroni ciliari innervano le fibre muscolari striate sull'iride e sulla lente, essendo responsabili della contrazione della pupilla. I neuroni chioidali innervano il muscolo liscio della contoide1,10,11,12.
Le colture di neuroni gangliari ciliari di pollo hanno dimostrato di essere strumenti utili per lo studio delle sinapsi neuromuscolari e della formazione di sinapsi1,5,9. Considerando che le sinapsi neuromuscolari sono colinergiche13, utilizzando una popolazione neuronale che è colinergico – neuroni CG – emerso come una potenziale alternativa ai modelli cellulari precedenti14. Questi modelli consistevano in una popolazione neuronale eterogenea, in cui solo una piccola parte è colinergica. In alternativa, i neuroni gangliari ciliari si sviluppano relativamente veloce in vitro, e dopo circa 15 ore già formano sinapsi1. I neuroni CG sono stati utilizzati come sistema modello nel corso degli anni per studi di ricerca distinti, a causa della sua relativamente facilità di isolamento e manipolazione. Queste applicazioni includono studi optogenetici, sviluppo di sinapsi, apoptosi e interazioni neuromuscolari14,15.
Descriviamo una procedura dettagliata per la dissezione, la dissociazione e la coltura in vitro dei neuroni gangli ciliari provenienti dagli embrioni embrionali 7 (E7). Forniamo un protocollo passo-passo al fine di ottenere colture cellulari altamente pure e stabili di neuroni colinergici. Mettiamo inoltre in evidenza i passaggi chiave del protocollo che richiedono particolare attenzione e che miglioreranno la qualità delle colture neuronali. Queste culture possono essere mantenute in vitro per almeno 15 giorni.
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Protocol
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: I materiali necessari per questa procedura sono i seguenti: pinze (no 5 e no 55), pinzette chirurgiche, piatti Petri dissezione (fondo nero), piastrine di 24 pozzetti, pipetta pasteur in plastica, pasteur pipetta in vetro lucidato, siringa da 10 mL, filtro siringa 0,22 m.
- Preparare e sterilizzare tutto il materiale necessario per il protocollo, tra cui coperture in vetro, pinze (no 5 e no 55), pinzette chirurgiche, piatti Petri (fondo nero), distillati H2O, pipette e materiale per la chirurgia.
- Preparare la soluzione PDL (Poly-D-Lysine) da 0,1 mg/mL.
- Ricostituire PDL in buffer di ritassio da 0,1 M (pH 8,2) a una concentrazione di 1 mg/mL (soluzione 10x).
- Diluire 1:10 in 166,6 mM di tampone di ricambio (pH 8,2) per ottenere una concentrazione finale di 0,1 mg/mL.
- Preparare la soluzione lamin a 10 g/mL.
- Diluire 1 mg/mL di laminina in media neurobasale semplice per una concentrazione finale di 10 g/mL.
- Preparare Hank's Balanced Salt Solution (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO42H2O, 5 mM di glucosio, 1 mM di pireva di sodio, 10 mM di buffer HEPES, 0,01% di fenolo rosso. Regolare pH a 7.2.
- Preparare la soluzione trypsin dello 0,1%.
- Sciogliere 5 mg di trypsin 1:250 polvere in 5 mL di HBSS per una concentrazione finale di 0.1%.
- Mettere in un miscelatore a rulli a 4 gradi centigradi fino a completa dissoluzione.
- Filtrare utilizzando una siringa da 10 mL e un filtro di siringa da 0,22 m.
- Preparare gangli cilia incompleto medio: mezzo neurobasale senza glutammina, 1X B27 (foto-sensibile), 10% siero di cavallo inattivato dal calore, 2% di FBS inattivato dal calore, 12,5 U/mL penicillina/streptomicina (0,25x) e 2 mM di glutammina. Utilizzare reagenti sterili e preparare il mezzo in condizioni sterili.
- Preparare gangli a livello ciliario mezzo completo (integrato con fattori di crescita): al mezzo incompleto, aggiungere 5 ng/mL GDNF e 5 ng/mL CNTF.
2. Preparazione di vetro coprelips per piastre 24-bene
- Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro all'interno di un contenitore resistente all'acido e aggiungere 65% acido nitrico fino a quando tutti i copricopro sono sommersi. Mettere il contenitore in uno shaker orbitale e incubare durante la notte a temperatura ambiente (RT) ad una velocità di 1000 rpm.
- Il giorno successivo, trasferire attentamente l'acido nitrico in un piccolo serbatoio e conservare per un ulteriore uso. L'acido nitrico può essere riutilizzato 2-3x.
- Attentamente, aggiungere distillato H2O ai coperchii per rimuovere l'acido nitrico rimanente. Mettere in agitazione per 30 minuti, scartare la soluzione di lavaggio e ripetere questo 5x.
- Sciacquare i copriletti con il 75% di etanolo due volte.
- Separare con cura e posizionare i singoli copricopre in una cremagliera metallica ricoperta di lamina di alluminio e incubare a 50 oC per 10-15 minuti o fino a quando completamente asciutto.
NOTA: Non autoclave vetro coprelips come si attaccano l'uno all'altro. - Sterilizzare i copriletti sotto la luce UV per 10-15 minuti. Mantenere coverlips sterile per la coltura del tessuto neuronale.
3. Rivestimento di vetro coprelips per piastre 24-well
- Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare un coperchio in ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetti.
- Aggiungete 500 l di 0,1 mg/mL PDL e incubate peruna pernottamento a 37 gradi centigradi.
- Il giorno successivo, sciacquare le coverlips due volte con sterile distillato H2O. Quindi, aggiungere 500 l di acqua distillata ad ogni coverslip e lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare l'acqua e aggiungere 350 gradi di soluzione di laminina da 10 g/mL in ogni pozzo.
- Mettere in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 2 h.
- Prima della placcatura cellulare, rimuovere la soluzione di laminina e lavare due volte con un semplice mezzo neurobasale.
NOTA: È importante che i coperchi non si asciughino in qualsiasi momento. - Aggiungere 300 l di mezzo completo e lasciare in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 fino al tempo di placcatura. Prima di placcare le cellule, rimuovere questo mezzo.
4. Cultura di gangli ciliari da embrione di pollo (giorno embrionale 7)
- Dissezione degli gangli ciliari (CG)
- Togliere le uova dall'incubatrice e spruzzarle con il 75% di etanolo.
NOTA: Le uova vengono conservate a 16 gradi centigradi prima di essere incubate a 37,7 gradi centigradi per 7 giorni (o allo stadio embrionale desiderato). Le uova usate qui sono delle specie di pollo di Ross. - Tagliare la parte superiore dell'uovo con una forbice e togliere l'embrione con un cucchiaio. Mettere l'embrione in una tela Petri con HBSS ghiacciata e separare la testa dal corpo tagliando la regione del collo.
NOTA: Non appena l'embrione viene rimosso dall'uovo, può produrre proteasi responsabili della morte cellulare. È importante separare rapidamente la testa dal corpo una volta che l'embrione è al di fuori del guscio per ridurre al minimo la morte cellulare. - Tenere la testa dell'embrione nell'HBSS ghiacciato.
- Tenere la testa dell'embrione e fissarlo nel becchino del pulcino con no 5 pinze. Poi con no 55 pinze, iniziare a rimuovere il sottile strato di pelle intorno all'occhio.
- Rimuovere con attenzione l'occhio e ruotarlo per accedere alla parte posteriore. Mentre separa l'occhio dalla testa del pulcino, notare il nervo ottico sezionato. Questo aiuterà a localizzare il ganglio ciliare.
- Una volta che l'occhio è separato, tenerlo con il lato posteriore verso l'alto e notare il ganglio ciliare adiacente al nervo ottico sezionato e la fessura della contoide. Il nervo preganglionico potrebbe ancora essere attaccato al ganglio ciliario, che ne facilita l'identificazione.
- Dissezionare il ganglio ciliare da ogni occhio e pulire molto bene rimuovendo il tessuto in eccesso intorno a ogni ganglio.
NOTA: Per avere un rendimento di 1x106 celle / mL, dissezionare 70 CG. Si prega di notare che la popolazione cellulare ottenuta contiene cellule non neuronali pure. Per diminuire il numero di cellule non-neuronali e, di conseguenza, aumentare la purezza della popolazione neuronale, è molto importante pulire i gangli ai cilia il più possibile, rimuovendo tutto il tessuto in eccesso.
- Togliere le uova dall'incubatrice e spruzzarle con il 75% di etanolo.
- Dissociazione e cultura dei gangli ciliari
- Raccogli tutti gli gangli ciliari in un tubo da 15 mL usando una pipetta Pasteur in plastica sterile.
NOTA: È importante pre-bagnare la pipetta Pasteur per ridurre al minimo l'attaccamento dei gangli alla parete della pipetta. - Centrifugare gli gangli ciliari per 2 minuti a 200 x g.
- Rimuovere con attenzione tutto il mezzo HBSS utilizzando una pipetta Pasteur e poi una micropipetta P1000. Aggiungere 1 mL di 0,1% soluzione di prova e incubare per 20 minuti a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua, senza agitazione.
- Centrifuga per 2 minuti a 200 x g.
- Rimuovere immediatamente la soluzione trypsin e aggiungere 1 mL di mezzo incompleto.
NOTA: Il supporto incompleto contiene il siero che interromperà immediatamente l'effetto della trypsin. - Centrifuga per 2 minuti a 200 x g e rimuovere tutto il mezzo.
- Aggiungere 350-500 l di mezzo completo.
NOTA: Il volume necessario per dissociare le cellule dipende dal numero di gangli ciliari ottenuti e, quindi, dalla dimensione del pellet ottenuta. Per 70 CG si consiglia di utilizzare 500 . - Dissociare i CG pipettando su e giù 10-15volte utilizzando prima un P1000 seguito da 10-15x utilizzando una pasteurpipe in vetro lucidato al fuoco. Evitare la formazione di bolle d'aria per ridurre al minimo la perdita di cellule.
NOTA: Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino alla placcatura. - Determina la densità cellulare utilizzando una soluzione blu Trypan e una camera Neubauer standard.
- Piastra 1 x 104 celle/mL in ogni pozzo della piastra di 24 pozze di scalo diluindo il volume appropriato della sospensione cellulare in 500 - L di mezzo completo (completato con 10 M 5'-FDU).
- Incubare le cellule in un incubatore di CO2 a 37 gradi centigradi.
- Raccogli tutti gli gangli ciliari in un tubo da 15 mL usando una pipetta Pasteur in plastica sterile.
5. Immunocitochimica e analisi delle immagini dei neuroni ciliari
- Eseguire il saggio di immunocitochimica presentato in questo articolo come descritto in precedenza16,17.
- Utilizzare i seguenti anticorpi primari: tubulina b-III monoclonale del topo (1:1000, T8578), neurofilamento monoclonale di pollo M (1:1000, AB5735), topo monoclonale SV2 (1:1000, AB2315387).
- Come anticorpi secondari, utilizzare Alexa Fluor 568-coniugato capra anti-toro anticorpo (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-coniugato capra anti-pollo anticorpo (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-concatenato capra anti-tono anti-tono anti-tono anti-tono (1:10000, A2151).
- Montare i coprilabbra utilizzando un supporto di montaggio con DAPI, per la colorazione nucleare (P36935).
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Representative Results
La durata stimata di questa procedura dipende strettamente dalla resa necessaria per ogni esperimento specifico e, di conseguenza, dal numero di gangli ciliari che devono essere isolati. Per una resa stimata di 1 x 106 cellule/mL, isolare circa 70 gangli ciliari (35 uova). Per questo numero di gangli, ci vorranno 2-3 ore per la procedura di dissezione e un totale di 4-5 ore per la procedura totale. Un'illustrazione dettagliata del protocollo di isolamento è illustrata nella Figura 1A. L'identificazione del ganglio ciliario può essere difficile, soprattutto quando si esegue questo protocollo per la prima volta. Il ganglio ciliario è localizzato vicino al nervo ottico e alla fessura della choroide (Figura 1B). I passaggi chiave della procedura di dissezione sono illustrati nella Figura 2. In primo luogo, l'embrione viene rimosso dall'uovo e posto nell'HBSS ghiacciato. La testa è separata dal corpo e, ancora una volta, posta in HBSS ghiacciato in un piatto Petri dissezione (Figura 2A-2C). Quindi, l'occhio viene rimosso dalla testa del pulcino e il ganglio ciliario è isolato (Figura 2D-2H).
Le culture ottenute con questo protocollo sono molto pure. Tuttavia, la pulizia dei gangli e la rimozione del tessuto in eccesso dettano fortemente il successo e la purezza della cultura. Le cellule si sviluppano rapidamente e possono essere utilizzate già nei primi giorni in coltura se l'esperimento complessivo lo richiede. Tuttavia, le culture possono essere mantenute per 15 giorni, o più. Se si utilizzano le colture per più di 7-8 giorni, assicurarsi di sostituire un terzo del mezzo di coltura con un mezzo fresco ogni 2-3 giorni. Dopo 1 giorno in vitro, i neuroni CG mostrano una morfologia multipolare. Tuttavia, estensione neurite si verifica rapidamente, e una rete neuronale primaria è già stabilito dopo 24 ore. Dopo 8 giorni in vitro, i neuroni sono già passati a uno stato unipolare, dove uno dei neuriti si estende e forma l'assone. La rete neuronale è molto densa in questa fase di sviluppo (Figura 3 e Figura 4).
I neuroni gangliari ciliari sono neuroni colinergici che appartengono al sistema nervoso parasimpatico. In vivo, questi neuroni sono responsabili dell'innervazione muscolare nell'occhio. Queste colture neuronali sono molto adatte per lo studio delle sinapsi neuromuscolari. Per questo, neuroni CG possono essere placcati sulla parte superiore delle cellule muscolari. Il muscolo pettorale dei ceci è stato sezionato e ha permesso di svilupparsi e maturarsi in vitro fino al DIV 4. I neuroni CG sono stati poi placcati sopra lo strato muscolare e la co-cultura ha permesso di svilupparsi per altri 3 giorni. In questo momento, le fibre muscolari si formano e possono essere facilmente identificate dalla presenza di più nuclei (blu). L'immunostazione sinaptica vesicle glicle 2A (SV2), un marcatore presintica mostra la presenza di sinapsi che si stabiliscono tra gli assoni dei neuroni CG e le fibre muscolari (Figura 5).
Figura 1: Schema del protocollo di dissezione e del ganglio ciliario. (A) Diagramma del protocollo di isolamento e cultura. (B) Schema di localizzazione del ganglio ciliario del pulcino nella parte posteriore dell'occhio. Il nervo ottico, il ganglio ciliario e la fessura confondiera sono indicati da frecce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dissezione del ganglio ciliare del pulcino E7. (A) Tagliare la parte superiore dell'uovo con le forbici. (B) Togliere l'embrione dall'uovo con un cucchiaio e metterlo in una dissezione piatto Petri con HBSS ghiacciato. (C) Separare la testa dal corpo tagliando nella regione del collo. (D) Fissare la testa dell'embrione nel becco, tenendo con la forza n. 5. (E) Rimuovere l'occhio con una leggera rotazione utilizzando la forzata n. 55. (F) Vista posteriore dell'occhio. Le frecce indicano la localizzazione del nervo ottico, della fessura della cronologia e del ganglio ciliario. (G) Dissezionare il ganglio ciliario. (H)Ganglio ciliario disossato. Il tessuto in eccesso deve essere rimosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sviluppo in vitro dei neuroni gangliari ciliari. Immagini a contrasto di fase dei neuroni CG a DIV 1, 3, 8 e 15. Come neuroni CG sono placcati, immediatamente avviare escrescenza neurite. Al DIV 15, la rete assonale è molto densa e in questa fase i neuriti sono completamente differenziati in dendriti e assoni. Le immagini di contrasto di fase sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo plan-Apochromat 20x ph2. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immunocitochimica dei neuroni CG al DIV 8. I neuroni CG mostrano una rete neuronale ben consolidata dopo 8 giorni in vitro. I nuclei erano macchiati di DAPI (blu) e gli assoni erano macchiati di tubulina b-III (rosso). Le immagini fluorescenza sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo plan-Apochromat 20x. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I neuroni CG coltivati stabiliscono le sinapsi con fibre muscolari. Immagini immunocitochimiche delle coculture muscolari dei neuroni CG-petonuro. Le fibre muscolari identificate da linee tratteggiate presentano nuclei multipli, che sono stati macchiati con DAPI (blu). Gli assoni erano etichettati contro il neurofilamento (rosso) e le vesciche sinaptiche erano etichettate contro sV2 (ciano). Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di olio plan-Apochromat 63x. Barra della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo dimostrato come preparare e cultura neuroni CG. L'identificazione e la dissezione del ganglio ciliario può essere difficile per gli utenti inesperti. Pertanto, presentiamo una procedura dettagliata e graduale per sezionare in modo efficiente i gangli ciliari dei pulcini E7, dissociare il tessuto e preparare colture neuronali che possono essere mantenute per almeno 15 giorni. I neuroni gangliari ciliari ottenuti con questo protocollo sono adatti anche per la co-coltura con le cellule muscolari.
I gangli acilare in diverse fasi di sviluppo dello sviluppo embrionale del pulcino possono essere utilizzati come modello cellulare, a seconda dello scopo dello studio. Tuttavia, per le colture di neuroni CG si suggerisce che siano isolati dall'embrione del pulcino tra i giorni embrionali 7 e 818. Nello stadio embrionale E8, i neuroni CG non hanno ancora subito processi di morte neuronale e il numero di cellule non neuronali è ridotto relativamente con le cellule neuronali18. Questo, in combinazione con una rigorosa procedura di dissezione e gangli molto ben puliti, contribuirà ad una cultura altamente pura di neuroni gangliari ciliari, con poca contaminazione da cellule non neuronali, come fibroblasti o cellule gliali.
Durante l'isolamento dei neuroni CG, uno dei punti critici è l'identificazione e la pulizia del CG. La dissezione di una struttura così piccola, come il ganglio ciliare, può essere difficile considerando la localizzazione, la capacità di identificare il ganglio e le dimensioni del ganglio stesso. È normale che i gangli si attacchino alle pinze durante la dissezione. Gli strumenti di dissezione di alta qualità sono molto importanti per una dissezione di successo e ridurranno al minimo l'attaccamento dei gangli alle pinze. La pulizia della CG è importante per prevenire la contaminazione da cellule non neuronali. È necessario isolare circa 70 gangli per ottenere una densità cellulare di 1x106 cellule/mL, in contrasto con altri tessuti neuronali del sistema nervoso periferico che hanno un numero 5-15x maggiore di gangli3 .
In coltura, l'aggiunta di 5'-FDU al mezzo completo diminuisce la contaminazione della coltura GC con cellule non neuronali. 5'-FDU è un composto anti-mitotico che inibisce la proliferazione cellulare, vale a dire la proliferazione di cellule gliali e fibroblasti. La concentrazione di 5'-FDU aggiunto al mezzo è sufficiente per fermare il ciclo cellulare nella fase S, ma non è dannosa per il normale sviluppo dei neuroni CG3,19,20. Il tempo di trattamento con 5'-FDU può essere regolato. Tuttavia, poiché i neuroni CG stabiliscono una fitta rete assonale in breve tempo, 5'-FDU dovrebbe essere aggiunto alla coltura già nel momento della placcatura.
Uno dei principali limiti di questo modello è che non è rappresentativo del normale sviluppo dei neuroni CG in condizioni fisiologiche. In ovo, circa la metà dei neuroni CG muore tra l'8e il 14esimo giorno di sviluppo dell'embrione del pulcino. Nella cultura, non c'è diminuzione del numero di neuroni CG quando il mezzo è integrato con fattori neurotrofici che consentono la sua sopravvivenza1,6,14.
La popolazione neuronale ottenuta dalla dissezione del ganglio ciliario del pulcino è una popolazione omogenea di neuroni colinergici, appartenenti al sistema nervoso autonomo. Va notato che l'espressione di neurotrasmettitori nella popolazione di conoidi del CG è guidato dal bersaglio, che potrebbe essere ostacolato a seconda del tipo di muscolo utilizzato nella co-cultura24. Se lo scopo dello studio è legato all'identità genetica o al sottotipo del motoneurone stesso, i neuroni CG potrebbero non essere il miglior modello neuronale adatto. Inoltre, la specificità dei motoneuroni nell'innervazione delle fibre muscolari potrebbe non essere realizzata quando si utilizzano co-culture del neurone CG poiché, in questo caso, le fibre muscolari possono essere moltiplicate innervato25. Tuttavia, questa coltura neuronale ha diversi vantaggi, richiede solo attrezzature di base per mantenere e incubare le uova, è una procedura ragionevolmente poco costosa e, cosa più importante, fornisce un modello eccellente per lo studio delle sinapsi neuromuscolari1, dal momento che i meccanismi di neurotrasmissione dei neuroni CG sono molto simili a quelli che si verificano nei neuroni motori spinali. I modelli cellulari precedentemente utilizzati per questo tipo di studi erano neuroni sensoriali dal midollo spinale12,21,22,23. Tuttavia, queste co-culture erano composte da una popolazione eterogenea di neuroni, non tutti colinergici e, quindi, solo una piccola parte dei neuroni erano in grado di stabilire contatti funzionali con le cellule muscolari1. Oltre all'analisi dello sviluppo (immunocitochimica) dimostrata in questo lavoro altri saggi possono essere eseguiti in culture CG come l'elettrofisiologia e la sopravvivenza neuronale.
Sulla base di questo protocollo possono essere affrontate ulteriori questioni scientifiche, ad esempio come la localizzazione subcellulare di mRNA e proteine specifici regolano la formazione e la funzione delle sinapsi. Inoltre, le cocolture nervo-muscolari possono essere facilmente stabilite ed essere ulteriormente utilizzate per studiare le malattie neuromuscolari quando il sito di lesione è la giunzione neuromuscolare. Le malattie neuromuscolari sono eterogenee in natura nel senso che la disfunzione potrebbe essere associata al muscolo stesso, ai nervi periferici o alle giunzioni neuromuscolari26. Così, attraverso queste co-culture sarebbe possibile studiare le alterazioni della giunzione neuromuscolare che alla fine sono alla base dello sviluppo e della progressione delle malattie neuromuscolari. Un'altra interessante possibilità sarebbe quella di adattare questo protocollo al sistema trigeminale del topo. Questi neuroni sono facilmente accessibili, e il loro modello di sviluppo è ben noto27. Perché i topi sono suscettibili alla manipolazione genetica e il sistema trigemino è ben caratterizzato in termini di formazione di mappe topografiche nuove possibilità sorgono utilizzando un protocollo trigeminale per studiare lo sviluppo neuronale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (ERDF), attraverso il Programma Operativo Regionale Centro 2020 nell'ambito di progetti CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, e attraverso il COMPETE 2020 - Programma Operativo per la Competitività e l'Internazionalizzazione e i fondi nazionali portoghesi tramite FCT – Fundao para a Ciància e a a, Tecnologia, I.P., nell'ambito dei progetti UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008 e le singole sovvenzioni SFRH/BD/141092/201 8 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) e da Marie Curie Actions - IRG, 7o Programma Quadro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
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