Summary
Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo's.
Abstract
Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel en zijn verantwoordelijk voor de innervatie van de spierweefsels aanwezig in het oog. Dit ganglion wordt gevormd door een homogene populatie van ciliary en choroïdale neuronen die innervate gestreept en gladde spiervezels, respectievelijk. Elk van deze neuronale types regelen specifieke oogstructuren en -functies. In de loop der jaren, neuronale culturen van de chick ciliary ganglia bleken te zijn effectieve celmodellen in de studie van spier-zenuwstelsel interacties, die communiceren via cholinerge synapsen. Ciliary ganglion neuronen zijn, in zijn meerderheid, cholinerge. Dit celmodel is aangetoond dat nuttig is relatief voor eerder gebruikte heterogene celmodellen die verschillende neuronale types omvatten, naast cholinerge. Anatomisch, de ciliary ganglion is gelokaliseerd tussen de oogzenuw (ON) en de choroïde spleet (CF). Hier beschrijven we een gedetailleerde procedure voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van ciliary ganglia neuronen van kuikenembryo's. We bieden een stap-voor-stap protocol om zeer zuivere en stabiele cellulaire culturen van CG neuronen te verkrijgen, met de nadruk op de belangrijkste stappen van het proces. Deze culturen kunnen gedurende 15 dagen in vitro worden gehandhaafd en hierbij tonen we de normale ontwikkeling van CG-culturen. De resultaten tonen ook aan dat deze neuronen kunnen interageren met spiervezels door middel van neuro-gespierde cholinerge synapsen.
Introduction
Ciliary ganglion (CG) neuronen behoren tot het parasympathische zenuwstelsel. Deze neuronen zijn cholinerge, in staat om muscarinische of nicotinische synapsen vast te stellen1,,2,3. Anatomisch, de CG bevindt zich in het achterste deel van het oog tussen de oogzenuw (ON) en de choroïde spleet (CF) en bestaat uit ongeveer 6000 neuronen in de vroege embryonalestadia 1,4. Voor de eerste week in de cultuur, ciliary ganglion neuronen presenteren een multipolaire morfologie. Na een week, beginnen ze over te stappen naar een unipolaire staat, met een neuriet uit te breiden en de vorming van de axon5. Bovendien sterft ongeveer de helft van de CG-neuronen tussen de8e en 14e dag van de ontwikkeling van kuikenembryo's, door een geprogrammeerd proces van celdood.th Deze afname van het aantal neuronen resulteert in een totale populatie van het ciliary ganglion van ongeveer 3000 neuronen6,7,8. In vitro, er is geen vermindering van het aantal CG neuronen wanneer gegroeid met spiercellen9 en CG neuronen kunnen worden gekweekt voor enkele weken1,9.
De ciliary ganglion bestaat uit een homogene populatie van ciliary neuronen en choroïdale neuronen, elk die de helft van de neuronale bevolking in de CG, innervating de spier van het oog. Deze twee soorten neuronen zijn structureel, anatomisch en functioneel verschillend. Ciliary neuronen innervate de gestreepte spiervezels op de iris en lens, die verantwoordelijk zijn voor de leerling contractie. Choroidale neuronen innervate de gladde spier van de choroid1,,10,11,12.
Culturen van kip ciliary ganglion neuronen is aangetoond dat nuttige instrumenten voor de studie van neuromusculaire synapsen en synaps vorming1,5,9. Gezien het feit dat neuromusculaire synapsen cholinerge13zijn , met behulp van een neuronale populatie die cholinerge is – CG-neuronen – naar voren gekomen als een potentieel alternatief voor eerdere celmodellen14. Deze modellen bestonden uit een heterogene neuronale populatie, waarbij slechts een klein deel cholinerge is. Als alternatief ontwikkelen ciliary ganglion neuronen relatief snel in vitro, en vormen na ongeveer 15 uur al synapsen1. CG neuronen zijn gebruikt als een model systeem door de jaren heen voor verschillende onderzoeken, als gevolg van het relatief gemak van isolatie en manipulatie. Deze toepassingen omvatten optogenetische studies, synapsontwikkeling, apoptose en neuromusculaire interacties14,15.
We beschrijven een gedetailleerde procedure voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van ciliary ganglia neuronen van embryonale dag 7 (E7) kuikenembryo's. Wij bieden een stap-voor-stap protocol om zeer zuivere en stabiele cellulaire culturen van cholinerge neuronen te verkrijgen. We belichten ook de belangrijkste stappen van het protocol die speciale aandacht vereisen en die de kwaliteit van de neuronale culturen zullen verbeteren. Deze culturen kunnen ten minste 15 dagen in vitro worden gehandhaafd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze procedure zijn de volgende: tangen (nº 5 en nº 55), chirurgische pincet, dissectie Petri gerechten (zwarte bodem), 24-well platen, plastic Pasteur pipet, brandgepolijst glas Pasteur pipette, 10 mL spuit, 0,22 μm spuitfilter.
- Bereid en steriliseer al het materiaal dat nodig is voor het protocol, inclusief glazen coverslips, tangen (nº 5 en nº 55), chirurgische pincet, petrischaaltjes (zwarte bodem), gedestilleerde H2O, pipetten en materiaal voor chirurgie.
- Bereid 0,1 mg/mL Poly-D-Lysine (PDL) oplossing.
- Reconstitute PDL in 0,1 M borate buffer (pH 8.2) tot een concentratie van 1 mg/mL (10x oplossing).
- Verdun 1:10 in 166,6 mM boratebuffer (pH 8.2) om een uiteindelijke concentratie van 0,1 mg/mL te verkrijgen.
- Bereid 10 μg/mL laminin oplossing voor.
- Verdun 1 mg/mL laminine in gewoon neurobasaal medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL.
- Bereid Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) voor: 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4·2H2O, 5 mM glucose, 1 mM natrium pyruvaat, 10 mM HEPES buffer, 0,001% fenol rood. Pas de pH aan op 7,2.
- Bereid 0,1% trypsine oplossing.
- Los 5 mg trypsine 1:250 poeder op in 5 mL HBSS voor een uiteindelijke concentratie van 0,1%.
- Plaats in een rolmixer op 4 °C tot het volledig is opgelost.
- Filter met een spuit van 10 mL en een spuitfilter van 0,22 μm.
- Bereid ciliary ganglia onvolledig mediumvoor : neurobasaal medium zonder glutamine, 1X B27 (fotogevoelig), 10% warmte-geïnactiveerd paardenserum, 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 12,5 U/mL penicilline/streptomycine (0,25x) en 2 mM glutamine. Gebruik steriele reagentia en bereid het medium onder steriele omstandigheden.
- Bereid ciliary ganglia complete medium (aangevuld met groeifactoren): aan het onvolledige medium, voeg 5 ng /mL GDNF en 5 ng/mL CNTF.
2. Bereiding van glazen hesjes voor platen met 24 putten
- Plaats het gewenste aantal glazen coverslips in een zuurbestendige container en voeg 65% salpeterzuur toe totdat alle covers zijn ondergedompeld. Plaats de container in een orbitale shaker en incubbate 's nachts bij kamertemperatuur (RT) bij een snelheid van 1000 rpm.
- Breng het salpeterzuur de volgende dag voorzichtig over naar een klein reservoir en bewaar het voor verder gebruik. Salpeterzuur kan 2-3x hergebruikt worden.
- Voeg voorzichtig gedistilleerde H2O toe aan de covers om het resterende salpeterzuur te verwijderen. Plaats in agitatie gedurende 30 minuten, gooi de wasoplossing weg en herhaal deze 5x.
- Spoel de covers twee keer af met 75% ethanol.
- Zorgvuldig scheiden en plaats individuele coverslips in een metalen rek bedekt met aluminiumfolie en incubbateren op 50 ºC gedurende 10-15 minuten of tot volledig droog.
LET OP: Niet autoclave glazen coverslips als ze zullen vasthouden aan elkaar. - Steriliseer de coverslips onder UV-licht gedurende 10-15 minuten. Onderhouden coverslips steriel voor neuronale weefsel cultuur.
3. Coating van glazen coverslips voor platen met 24 putten
- Met behulp van een steriele pincet, plaats een coverslip in elke put van een 24-well plaat.
- Voeg 500 μL 0,1 mg/mL PDL toe en incubbate 's nachts bij 37 °C.
- Spoel de covers twee maal af met steriel gedestilleerde H2O. Voeg vervolgens 500 μL gedestilleerd water toe aan elke coverslip en laat gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
- Gooi het water weg en voeg 350 μL 10 μg/mL laminineoplossing toe in elke put.
- Plaats in een couveuse van 37 °C voor 2 uur.
- Voordat de cel beplating, verwijder de laminine oplossing en was twee keer met effen neurobasale medium.
LET OP: Het is belangrijk dat de coverslips op geen enkel moment drogen. - Voeg 300 μL volledig medium toe en laat in een couveuse bij 37 °C en 5% CO2 tot beplatingstijd. Voordat u cellen plating, verwijder dit medium.
4. Cultuur van ciliary ganglia uit kippenembryo (embryonale dag 7)
- Ontleding van ciliary ganglia (CG)
- Haal eieren uit de couveuse en besproei ze met 75% ethanol.
OPMERKING: Eieren worden opgeslagen bij ~16 °C voordat ze gedurende 7 dagen bij 37,7 °C worden geïncubeerd (of het gewenste embryonale stadium). Eieren die hier worden gebruikt zijn van Ross kippensoorten. - Snijd de bovenkant van het ei met een schaar en haal het embryo eruit met een lepel. Plaats het embryo in een petrischaaltje met ijskoude HBSS en scheid het hoofd van het lichaam door in het nekgebied te snijden.
OPMERKING: Zodra het embryo uit het ei wordt verwijderd, kan het proteasen produceren die verantwoordelijk zijn voor de celdood. Het is belangrijk om het hoofd snel van het lichaam te scheiden zodra het embryo buiten de schaal is om celdood te minimaliseren. - Houd het hoofd van het embryo in ijskoud HBSS.
- Houd het embryohoofd omhoog en repareer het in de snavel van het kuiken met nº 5 tangen. Dan met nº 55 tangen, beginnen met het verwijderen van de dunne laag van de huid rond het oog.
- Verwijder het oog voorzichtig en draai het om toegang te krijgen tot het achterste deel. Tijdens het scheiden van het oog van het hoofd van het kuiken, let op de oogzenuw wordt doorsneden. Dit zal helpen om de ciliary ganglion lokaliseren.
- Zodra het oog is gescheiden, houd het met de achterste kant omhoog en let op de ciliary ganglion grenzend aan de verdeelde oogzenuw en de choroïde spleet. De preganglionic zenuw zou nog aan ciliary ganglion kunnen worden vastgeheven, die zijn identificatie vergemakkelijkt.
- Ontleden de ciliary ganglion van elk oog en schoon zeer goed door het verwijderen van het overtollige weefsel rond elk ganglion.
OPMERKING: Om een opbrengst van ~ 1x106 cellen / mL hebben, ontleden ~ 70 CGs. Houd er rekening mee dat de verkregen celpopulatie ook niet-neuronale cellen bevat. Om het aantal niet-neuronale cellen te verminderen en bijgevolg de zuiverheid van de neuronale populatie te verhogen, is het erg belangrijk om de ciliary ganglia zoveel mogelijk schoon te maken, waarbij al het overtollige weefsel wordt verwijderd.
- Haal eieren uit de couveuse en besproei ze met 75% ethanol.
- Dissociatie en cultuur van ciliary ganglia
- Verzamel alle ciliary ganglia tot een 15 mL buis met behulp van een steriele plastic Pasteur pipet.
OPMERKING: Het is belangrijk om de Pasteur pipet vooraf nat te maken om de bevestiging van de ganglia aan de muur van de pipet te minimaliseren. - Centrifuge de ciliary ganglia gedurende 2 minuten op 200 x g.
- Verwijder voorzichtig al het HBSS-medium met een Pasteur-pipet en vervolgens een P1000-micropipet. Voeg 1 mL van 0,1% trypsineoplossing toe en broed gedurende 20 minuten bij 37 °C in een waterbad, zonder agitatie.
- Centrifuge gedurende 2 minuten op 200 x g.
- Verwijder onmiddellijk de trypsineoplossing en voeg 1 mL onvolledig mediumtoe.
OPMERKING: Onvolledig medium bevat serum dat onmiddellijk het effect van trypsine zal stoppen. - Centrifuge gedurende 2 minuten op 200 x g en verwijder alle medium.
- Voeg 350-500 μL compleet medium toe.
OPMERKING: Het benodigde volume om cellen te scheiden is afhankelijk van het aantal verkregen cilitaire ganglia en dus van de verkregen pelletgrootte. Voor ~70 CG wordt aanbevolen om 500 μL medium te gebruiken. - Dissociate CGs door pipetten op en neer 10-15x eerst met behulp van een P1000 gevolgd door 10-15x met behulp van een brandgepolijste glas Pasteur pipet. Vermijd luchtbelvorming om celverlies te minimaliseren.
LET OP: Houd de cellulaire suspensie op ijs tot beplating. - Bepaal de cellulaire dichtheid met behulp van een Trypan blauwe oplossing en een standaard Neubauer kamer.
- Plaat 1 x 104 cellen/mL in elke put van de 24-putplaat door het juiste volume celsuspensie te verdunnen in 500 μL van volledig medium (aangevuld met 10 μM 5'-FDU).
- Incubeercellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Verzamel alle ciliary ganglia tot een 15 mL buis met behulp van een steriele plastic Pasteur pipet.
5. Immunocytochemie en beeldanalyse van ciliary neuronen
- Voer de immunocytochemietest uit die in dit artikel wordt gepresenteerd zoals eerder beschreven16,17.
- Gebruik de volgende primaire antilichamen: muismonoklollen b-III tubulin (1:1000, T8578), kip monoklonale neurofilament M (1:1000, AB5735), muismonoklonal SV2 (1:1000, AB2315387).
- Als secundaire antilichamen, gebruik Alexa Fluor 568-geconjugeerd geit anti-muis antilichaam (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-gevoegde geit anti-kip antilichaam (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-geconjugated geit anti-muis antilichaam (1:1000, A21235).
- Mount coverslips met montagemedium met DAPI, voor nucleaire kleuring (P36935).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De geschatte duur van deze procedure hangt sterk af van de opbrengst die nodig is voor elk specifiek experiment en dus van het aantal ciliary ganglia dat moet worden geïsoleerd. Voor een geschatte opbrengst van 1 x 106 cellen/mL isoleert u ongeveer 70 ciliary ganglia (35 eieren). Voor dit aantal ganglia duurt het 2-3 uur voor de ontledingsprocedure en een totaal van 4-5 uur voor de totale procedure. Een stapsgewijze illustratie van het isolatieprotocol wordt weergegeven in figuur 1A. De identificatie van de ciliary ganglion kan moeilijk zijn, vooral bij het uitvoeren van dit protocol voor de eerste keer. De ciliary ganglion is gelokaliseerd in de buurt van de oogzenuw en de choroid spleet(Figuur 1B). De belangrijkste stappen van de ontledingsprocedure zijn opgenomen in figuur 2. Eerst wordt het embryo uit het ei verwijderd en in ijskoud HBSS geplaatst. Het hoofd is gescheiden van het lichaam en, nogmaals, geplaatst in ijskoude HBSS in een dissectie Petri schotel (Figuur 2A-2C). Vervolgens wordt het oog verwijderd van het hoofd van het kuiken en wordt het ciliary ganglion geïsoleerd(figuur 2D-2H).
De culturen verkregen met dit protocol zijn zeer zuiver. Echter, het schoonmaken van de ganglia en het verwijderen van het overtollige weefsel dicteert sterk het succes en de zuiverheid van de cultuur. De cellen ontwikkelen zich snel en kunnen reeds in de eerste dagen in cultuur worden gebruikt als het algemene experiment zo vereist. Toch kunnen de culturen 15 dagen of langer worden onderhouden. Als u de culturen langer dan 7-8 dagen gebruikt, zorg er dan voor dat u elke 2-3 dagen een derde van het kweekmedium vervangt door vers medium. Na 1 dag in vitro, CG neuronen tonen een multipolaire morfologie. Echter, neuriet extensie gebeurt snel, en een primaire neuronale netwerk is al vastgesteld na 24 uur. Na 8 dagen in vitro, neuronen al overgestapt naar een unipolaire toestand, waar een van de neurites zich uitstrekt en vormt de axon. Het neuronale netwerk is zeer dicht in dit stadium van ontwikkeling(figuur 3 en figuur 4).
Ciliary ganglion neuronen zijn cholinerge neuronen die behoren tot het parasympathische zenuwstelsel. In vivo zijn deze neuronen verantwoordelijk voor spierbinnenwending in het oog. Deze neuronale culturen zijn zeer geschikt voor de studie van neuromusculaire synapsen. Hiervoor kunnen CG-neuronen bovenop spiercellen worden verguld. De kuikenpitorale spier werd ontleed en toegestaan om te ontwikkelen en maturate in vitro tot DIV 4. CG neuronen werden vervolgens verguld op de top van de spierlaag en de co-cultuur toegestaan om te ontwikkelen voor 3 dagen. Op dit moment worden spiervezels gevormd en kunnen ze gemakkelijk worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van meerdere kernen (blauw). Synaptische vesicle glycoprotein 2A (SV2) immunostaining, een presynaptische marker toont de aanwezigheid van synapsen die zijn vastgesteld tussen de CG neuronen axonen en de spiervezels (Figuur 5).
Figuur 1: Regeling van het dissectieprotocol en het ciliary ganglion. aA) Diagram van het isolatie- en cultuurprotocol. (B) Regeling van de chick ciliary ganglion lokalisatie in het achterste deel van het oog. Oogzenuw, ciliary ganglion en choroïde spleet worden aangegeven door pijlen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Dissectie van E7 chick ciliary ganglion. (A) Snijd de bovenkant van het ei met een schaar. (B) Haal het embryo met een lepel uit het ei en leg het in een dissectie Petrischaaltje met ijskoud HBSS. (C) Scheid het hoofd van het lichaam door te snijden in het nekgebied. (D) Bevestig het hoofd van het embryo in de snavel en houd het met krachtp nº 5. (E) Verwijder het oog door zachte rotatie met behulp van forcep nº 55. (F) Achterste kijk op het oog. Pijlen geven de lokalisatie van de oogzenuw, choroïde spleet en ciliary ganglion. (G) Ontleden de ciliary ganglion. (H) Ontleed ciliary ganglion. Overtollig weefsel moet worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Ciliary ganglion neuronen ontwikkeling in vitro. Fasecontrastbeelden van CG-neuronen op DIV 1, 3, 8 en 15. Als CG neuronen zijn verguld, ze onmiddellijk initiëren neurite uitgroei. Bij DIV 15 is het axonale netwerk zeer dicht en in dit stadium worden neurites volledig onderscheiden in dendrieten en axoons. Fase contrast-beelden werden verworven met behulp van een confocale microscoop met een plan-Apochromat 20x ph2 doelstelling. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Immunocytochemie van CG-neuronen bij DIV 8. CG neuronen tonen een gevestigd neuronale netwerk na 8 dagen in vitro. Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw) en axonen waren bevlekt met b-III tubulin (rood). Fluorescentie imagens werden verworven met behulp van een confocale microscoop met een plan-Apochromat 20x doelstelling. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Gekweekte CG-neuronen vestigen synapsen met spiervezels. Immunocytochemie beelden van CG neuronen-borstspier co-culturen. Spiervezels geïdentificeerd door stippellijnen presenteren meerdere kernen, die werden gekleurd met DAPI (blauw). Axonen werden gelabeld tegen neurofilament (rood) en synaptische vikjes werden gelabeld tegen SV2 (cyaan). Beelden werden verworven met behulp van een confocale microscoop met een plan-Apochromat 63x olie doelstelling. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we laten zien hoe we CG-neuronen kunnen voorbereiden en cultuur. De identificatie en dissectie van de ciliary ganglion kan moeilijk zijn voor onervaren gebruikers. Daarom presenteren we een gedetailleerde en stapsgewijze procedure om E7 chick ciliary ganglia efficiënt te ontleden, het weefsel te scheiden en neuronale culturen voor te bereiden die ten minste 15 dagen kunnen worden onderhouden. De ciliary ganglion neuronen verkregen met dit protocol zijn ook geschikt voor co-cultuur met spiercellen.
Ciliary ganglia in verschillende ontwikkelingsstadia van kuiken embryonale ontwikkeling kan worden gebruikt als een cel model, afhankelijk van het doel van de studie. Voor culturen van CG-neuronen wordt echter gesuggereerd dat ze tussen embryonale dagen 7 en 818worden geïsoleerd uit kuikenembryo. In het embryonale stadium E8 hebben CG-neuronen nog geen neuronale doodsprocessen ondergaan en wordt het aantal niet-neuronale cellen relatief verminderd met neuronale cellen18. Dit, in combinatie met een rigoureuze dissectieprocedure en zeer goed gereinigde ganglia, zal bijdragen aan een zeer zuivere cultuur van ciliary ganglion neuronen, met weinig besmetting door niet-neuronale cellen, zoals fibroblasten of gliacellen.
Tijdens de isolatie van CG-neuronen is een van de kritieke punten de identificatie en reiniging van de CG. De dissectie van zo'n kleine structuur, zoals de ciliary ganglion, kan moeilijk zijn gezien de lokalisatie, de mogelijkheid om het ganglion te identificeren, evenals de grootte van het ganglion zelf. Het is normaal dat de ganglia zich tijdens de dissectie aan de tangen kan hechten. Hoge kwaliteit dissectie instrumenten zijn zeer belangrijk voor een succesvolle dissectie en zal het minimaliseren van de gehechtheid van de ganglia aan de tang. Het reinigen van de GC is belangrijk om besmetting met niet-neuronale cellen te voorkomen. Het is noodzakelijk om ongeveer 70 ganglia te isoleren om een cellulaire dichtheid van ~1x106 cellen/mL te verkrijgen, in tegenstelling tot andere neuronale weefsels van het perifere zenuwstelsel die een 5-15x groter aantal ganglia3hebben.
In de cultuur vermindert de toevoeging van 5'FDU aan het volledige medium de besmetting van de GC-cultuur met niet-neuronale cellen. 5'-FDU is een anti-mitotische verbinding die celproliferatie remt, namelijk de proliferatie van gliacellen en fibroblasten. De concentratie van 5'fdu toegevoegd aan het medium is voldoende om de celcyclus in de S-fase te stoppen, maar is niet schadelijk voor de normale ontwikkeling van CG-neuronen3,19,20. De behandeling met 5'fdu kan worden aangepast. Echter, aangezien CG neuronen een dicht axonaal netwerk in een korte tijd, 5'FDU moet worden toegevoegd aan de cultuur zo vroeg als de tijd van beplating.
Een van de belangrijkste beperkingen van dit model is dat het niet representatief is voor de normale ontwikkeling van CG-neuronen onder fysiologische omstandigheden. In ovo sterft ongeveer de helft van de CG-neuronen tussen de8e en 14e dag van de ontwikkeling van kuikenembryo's. In de cultuur is er geen afname van het aantal CG-neuronen wanneer het medium wordt aangevuld met neurotrofe factoren die het mogelijk maken om te overleven1,6,14.
De neuronale populatie verkregen uit de dissectie van het kuiken ciliary ganglion is een homogene populatie van cholinerge neuronen, die behoren tot het autonome zenuwstelsel. Opgemerkt moet worden dat de expressie van neurotransmitters in de choroidpopulatie van de CG doelgestuurd is, wat kan worden belemmerd afhankelijk van het type spier dat wordt gebruikt in de co-cultuur24. Als het doel van de studie is gerelateerd aan de genetische identiteit of sub-type van de motorneuron zelf, dan CG neuronen misschien niet de best geschikte neuronale model. Ook de specificiteit van motorische neuronen in de innervatie van spiervezels kan niet worden bereikt bij het gebruik van CG neuron co-culturen, omdat, in dit geval, de spiervezels kunnen worden vermenigvuldigen innervated25. Echter, deze neuronale cultuur heeft verschillende voordelen, het vereist alleen basisapparatuur te handhaven en uitbroeden van de eieren, het is een redelijk goedkope procedure en, nog belangrijker, biedt een uitstekend model voor de studie van neuromusculaire synapsen1, omdat CG neuronen transmissiemechanismen zijn zeer vergelijkbaar met die zich voordoen in spinale motorische neuronen. De celmodellen die voorheen voor dit soort studies werden gebruikt, waren sensorische neuronen uit het ruggenmerg12,21,22,23. Echter, deze co-culturen waren samengesteld uit een heterogene populatie van neuronen, niet alle cholinerge en dus slechts een klein deel van de neuronen waren in staat om functionele contacten met de spiercellen1vast te stellen . Naast de ontwikkelingsanalyse (immunocytochemie) die in dit werk wordt aangetoond, kunnen andere testen worden uitgevoerd in CG-culturen zoals elektrofysiologie en neuronale overleving.
Op basis van dit protocol kunnen aanvullende wetenschappelijke vragen worden aangepakt, bijvoorbeeld hoe subcellulaire lokalisatie van specifieke mRNAs en eiwitten synapsvorming en -functie reguleren. Bovendien kunnen zenuwspierco-culturen gemakkelijk worden vastgesteld en verder worden gebruikt om neuromusculaire ziekten te bestuderen wanneer de plaats van letsel de neuromusculaire kruising is. Neuromusculaire ziekten zijn heterogeen van aard in de zin dat de disfunctie kan worden geassocieerd met de spier zelf, de perifere zenuwen of de neuromusculaire knooppunten26. Zo zou het via deze coculturen mogelijk zijn om de neuromusculaire knooppuntveranderingen te bestuderen die uiteindelijk ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en progressie van neuromusculaire ziekten. Een andere interessante mogelijkheid zou zijn om dit protocol aan te passen aan de muis trigeminussysteem. Deze neuronen zijn gemakkelijk toegankelijk, en hun ontwikkelingspatroon is bekend27. Omdat muizen vatbaar zijn voor genetische manipulatie en het trigeminussysteem goed wordt gekarakteriseerd in termen van topografische kaartvorming ontstaan nieuwe mogelijkheden door gebruik te maken van een op trigemeen gebaseerd protocol om de neuronale ontwikkeling te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO), via het Regionaal Operationeel Programma Centro 2020 in het kader van projecten CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, en via de COMPETE 2020 - Operationeel programma voor concurrentievermogen en internationalisering en Portugese nationale fondsen via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., onder projecten UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, en de individuele subsidies SFRH/BD/141092/20082018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) en door Marie Curie Actions - IRG, 7e kaderprogramma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
