Summary
Chick ciliary ganglier (CG) är en del av det parasympatiska nervsystemet. Neuronala kulturer av chick CG nervceller visade sig vara effektiva cellmodeller i studien av nervmuskelinteraktioner. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för dissekering, dissociation och in vitro kultur CG nervceller från chick embryon.
Abstract
Chick ciliary ganglierna (CG) är en del av det parasympatiska nervsystemet och är ansvariga för innervation av muskelvävnader som finns i ögat. Denna ganglion består av en homogen population av ciliary och koroidala nervceller som innervate tvärstrimmiga och glatta muskelfibrer, respektive. Var och en av dessa neuronala typer reglerar specifika ögonstrukturer och funktioner. Under årens lopp, neuronala kulturer av chick ciliary ganglier visade sig vara effektiva cellmodeller i studien av muskel-nervsystemet interaktioner, som kommunicerar genom kolinerga synapser. Ciliary ganglion nervceller är, i sin majoritet, kolinerga. Denna cell modell har visat sig vara användbar jämförelsevis till tidigare använda heterogena cellmodeller som omfattar flera neuronala typer, förutom kolinerga. Anatomiskt är ciliary ganglion lokaliserad mellan synnerven (ON) och choroid spricka (CF). Här beskriver vi ett detaljerat förfarande för dissekering, dissociation och in vitro kultur ciliary ganglier nervceller från chick embryon. Vi erbjuder ett steg-för-steg-protokoll för att få mycket rena och stabila cellulära kulturer av CG nervceller, belysa viktiga steg i processen. Dessa kulturer kan upprätthållas in vitro i 15 dagar och härmed visar vi den normala utvecklingen av CG kulturer. Resultaten visar också att dessa nervceller kan interagera med muskelfibrer genom neuro-muskulös kolinerga synapser.
Introduction
Ciliary ganglion (CG) nervceller tillhör det parasympatiska nervsystemet. Dessa nervceller är kolinerga, att kunna etablera muscarinic eller nikotin synapser1,2,3. Anatomiskt är CG ligger i den bakre delen av ögat mellan synnerven (ON) och choroid spricka (CF) och består av cirka 6000 nervceller i tidiga embryonala stadier1,4. För den första veckan i kultur, ciliary ganglion nervceller presentera en multipolär morfologi. Efter en vecka börjar de övergå till ett unipolärt tillstånd, med en neurit som sträcker sig och bildar axon5. Dessutom dör ungefär hälften av CG nervceller mellan den8: e och 14:e dagen av chick embryo utveckling, genom en programmerad process av celldöd. Denna minskning av antalet nervceller resulterar i en total population av ciliary ganglion av cirka 3000 nervceller6,7,8. In vitro, Det finns ingen minskning av antalet CG nervceller när odlas med muskelceller9 och CG nervceller kan odlas i flera veckor1,9.
Ciliary ganglion består av en homogen population av ciliary nervceller och koroidala nervceller, var och en representerar hälften av neuronala befolkningen i CG, innervating muskeln i ögat. Dessa två typer av nervceller är strukturellt, anatomiskt och funktionellt distinkta. Ciliary nervceller innervate tvärstrimmiga muskelfibrer på iris och lins, är ansvarig för elevkontraktion. Choroidal nervceller innervate glatt muskulatur choroid1,10,,11,12.
Kulturer av kyckling ciliary ganglion nervceller har visat sig vara användbara verktyg för studier av neuromuskulära synapser och synaps bildning1,5,9. Med tanke på att neuromuskulära synapser är kolinerga13, med hjälp av en neuronal population som är kolinerga – CG nervceller – framstod som ett potentiellt alternativ till tidigare cellmodeller14. Dessa modeller bestod i en heterogen neuronal population, där endast en liten del är kolinerga. Alternativt, ciliary ganglion nervceller utveckla relativt snabb in vitro, och efter cirka 15 timmar redan bilda synapser1. CG nervceller har använts som ett modellsystem genom åren för olika forskningsstudier, på grund av dess relativt enkel isolering och manipulation. Dessa tillämpningar inkluderar optogenetiska studier, synapsutveckling, apoptos och neuromuskulära interaktioner14,15.
Vi beskriver ett detaljerat förfarande för dissekering, dissociation och in vitro kultur ciliary gangli nervceller från embryonala dag 7 (E7) chick embryon. Vi erbjuder ett steg-för-steg-protokoll för att få mycket rena och stabila cellulära kulturer av kolinerga nervceller. Vi lyfter också fram viktiga steg i protokollet som kräver särskild uppmärksamhet och som kommer att förbättra kvaliteten på neuronala kulturer. Dessa kulturer kan upprätthållas in vitro i minst 15 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser
OBS: De material som behövs för detta förfarande är följande: pincett (nº 5 och nº 55), kirurgisk pincett, dissektion Petrirätter (svart botten), 24-brunnsplattor, pastörpipeett av plast, eldpolerat glasPastörpipeett, 10 ml spruta, 0,22 μm sprutfilter.
- Förbered och sterilisera allt material som behövs för protokollet, inklusive glasskyddslappar, pincett (nº 5 och nº 55), kirurgisk pincett, petriskålar (svart botten), destillerat H2O, pipetter och material för kirurgi.
- Förbered 0,1 mg/ml Poly-D-Lysinlösning (PDL).
- Rekonstruera PDL i 0,1 M boratbuffert (pH 8.2) till en koncentration av 1 mg/ml (10x lösning).
- Späd 1:10 i 166,6 mM boratbuffert (pH 8.2) för att erhålla en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml.
- Förbered 10 μg/ml lamininlösning.
- Späd 1 mg/ml laminin i vanligt neurobasalmedium till en slutlig koncentration på 10 μg/ml.
- Förbered Hanks balanserade saltlösning (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mMM Na2HPO4·2H2O, 5 mM glukos, 1 mM natriumbåluvate, 10 mM HEPES buffert, 0,001% fenol röd. Justera pH-värdet till 7,2.
- Förbered 0,1% trypsin lösning.
- Lös 5 mg trypsin 1:250 pulver i 5 ml HBSS för en slutlig koncentration av 0,1%.
- Placera i en rullblandare vid 4 °C tills den är helt upplöst.
- Filtrera med en 10 ml spruta och ett 0,22 μm sprutfilter.
- Förbered ciliary ganglier ofullständigt medium:neurobasal medium utan glutamin, 1X B27 (foto-känslig), 10% värme-inaktiverad häst serum, 2% värme-inaktiverade FBS, 12,5 U/mL penicillin/streptomycin (0.25x) och 2 mM glutamin. Använd sterila reagenser och förbered mediet under sterila förhållanden.
- Förbered ciliary ganglier komplett medium (kompletterat med tillväxtfaktorer): till det ofullständiga mediet, tillsätt 5 ng/mL GDNF och 5 ng/mL CNTF.
2. Beredning av glasöverdrag för 24-brunnsplattor
- Placera önskat antal glasöverdrag inuti en syrabeständig behållare och tillsätt 65% salpetersyra tills alla täcken är nedsänkta. Placera behållaren i en omloppsbanor skakapparat och inkubera över natten vid rumstemperatur (RT) med en hastighet av 1000 rpm.
- Nästa dag, försiktigt överföra salpetersyra till en liten reservoar och lagra för vidare användning. Salpetersyra kan återanvändas 2-3x.
- Tillsätt försiktigt destillerad H2O i täcken för att avlägsna den återstående salpetersyran. Placera i agitation i 30 minuter, kassera tvättlösningen och upprepa detta 5x.
- Skölj täcken med 75% etanol två gånger.
- Separera försiktigt och placera enskilda täckslipar i ett metallställ täckt med aluminiumfolie och inkubera vid 50 ºC i 10-15 minuter eller tills den är helt torr.
OBS: Inte autoklav glas täcken eftersom de kommer att hålla sig till varandra. - Sterilisera täcken under UV-ljus i 10-15 minuter. Underhåll täcken sterila för neuronal vävnad kultur.
3. Beläggning av glasöverdrag för 24-brunnsplattor
- Med hjälp av en steril pincett, placera ett täckmedel i varje brunn av en 24-brunnsplatta.
- Tillsätt 500 μL 0,1 mg/ml PDL och inkubera över natten vid 37 °C.
- Nästa dag, skölj täcken två gånger med sterildestillerad H2O. Tillsätt sedan 500 μL destillerat vatten till varje täckslip och låt stå i 30 minuter i rumstemperatur.
- Kassera vattnet och tillsätt 350 μL 10 μg/ml lamininlösning i varje brunn.
- Placera i en 37 °C inkubator i 2 timmar.
- Före cellplätering, ta bort lamininlösningen och tvätta två gånger med vanligt neurofatmedium.
OBS: Det är viktigt att täcken inte torkar när som helst. - Tillsätt 300 μl komplett medium och låt stå i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2 tills pläteringstiden. Ta bort detta medium innan cellerna pläteringsceller.
4. Kultur av ciliary ganglier från kyckling embryo (embryonala dag 7)
- Dissekering av ciliära ganglier (CG)
- Ta bort ägg från inkubatorn och spraya dem med 75% etanol.
OBS: Ägg lagras vid ~16 °C innan de inkuberas vid 37,7 °C i 7 dagar (eller det önskade embryonala stadiet). Ägg som används här är från Ross kycklingarter. - Skär toppen av ägget med en sax och ta ut embryot med hjälp av en sked. Placera embryot i en petriskål med iskall HBSS och separera huvudet från kroppen genom att skära i nackregionen.
OBS: Så snart embryot avlägsnas från ägget kan det producera proteaser som är ansvariga för celldöd. Det är viktigt att snabbt separera huvudet från kroppen när embryot är utanför skalet för att minimera celldöd. - Håll embryots huvud i iskall HBSS.
- Håll upp embryohuvudet och fixera det i näbben på ungen med nº 5 pincett. Sedan med nº 55 pincett, börja ta bort det tunna lagret av huden runt ögat.
- Ta försiktigt bort ögat och rotera den för att komma åt den bakre delen. Medan separera ögat från huvudet på ungen, märker synnerven som delas upp. Detta kommer att bidra till att lokalisera ciliary ganglion.
- När ögat är separerat, hålla den med den bakre sidan upp och märker ciliary ganglion intill den uppdelade synnerven och choroid spricka. Den preganglionic nerven kan fortfarande fästas till ciliary ganglion, vilket underlättar dess identifiering.
- Dissekera ciliary ganglion från varje öga och rengör mycket väl genom att ta bort överflödig vävnad runt varje ganglion.
OBS: För att ha en avkastning på ~ 1x106 celler / ml, dissekera ~ 70 CGs. Observera att cellpopulationen som erhålls innehåller även icke-neuronala celler. För att minska antalet icke-neuronala celler och därmed öka renhet neuronala befolkningen, Det är mycket viktigt att rengöra ciliary ganglier så mycket som möjligt, ta bort alla överflödig vävnad.
- Ta bort ägg från inkubatorn och spraya dem med 75% etanol.
- Dissociation och kultur av ciliary ganglier
- Samla alla ciliary ganglier till en 15 ml rör med hjälp av en steril plast Pasteur pipett.
OBS: Det är viktigt att förvätna Pasteur pipetten för att minimera fästet av ganglierna på pipettens vägg. - Centrifugera ciliary ganglier i 2 minuter vid 200 x g.
- Ta försiktigt bort alla HBSS-medium med hjälp av en Pasteur pipett och sedan en P1000 micropipette. Tillsätt 1 ml 0,1 % trypsinlösning och inkubera i 20 minuter vid 37 °C i ett vattenbad, utan omrörning.
- Centrifug i 2 minuter vid 200 x g.
- Ta omedelbart bort trypsinlösningen och tillsätt 1 ml ofullständigt medium.
OBS: Ofullständigt medium innehåller serum som omedelbart stoppar effekten av trypsin. - Centrifugera i 2 minuter vid 200 x g och ta bort allt medium.
- Tillsätt 350-500 μL komplett medium.
OBS: Den volym som krävs för att separera celler beror på antalet ciliära ganglier som erhålls och därmed på den erhållna pelletstorleken. För ~70 CG rekommenderas att använda 500 μL medium. - Koppla bort CGs genom pipettering upp och ner 10-15x först med hjälp av en P1000 följt av 10-15x med hjälp av en brandpolerat glas Pasteur pipett. Undvik luftbubbla bildas för att minimera cellförlust.
OBS: Förvara cellfjädringen på is tills plätering. - Bestäm celltätheten med hjälp av en Trypan-blå lösning och en vanlig Neubauerkammare.
- Platta 1 x 104 celler/ml i varje brunn på 24-brunnsplattan genom att späda ut lämplig volym av cellfjädring i 500 μl komplett medium (kompletterat med 10 μM 5'-FDU).
- Inkubera celler i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Samla alla ciliary ganglier till en 15 ml rör med hjälp av en steril plast Pasteur pipett.
5. Immunocytokemi och bildanalys av ciliära nervceller
- Utför den immunocytokemiska analys som presenteras i detta dokument enligt tidigare beskrivna16,17.
- Använd följande primära antikroppar: mus monoklonal b-III tubulin (1:1000, T8578), monoklonal neurofilament M (1:1000, AB5735), mus monoklonala SV2 (1:1000, AB2315387).
- Som sekundära antikroppar, använd Alexa Fluor 568-konjugerad getantimusantikropp (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-konjugerad getanti-kycklingantikropp (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-konjugerad get anti-mus antikropp (1:1000, A21235).
- Montera täcken med monteringsmedium med DAPI, för kärnfärgning (P36935).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beräknade varaktigheten för detta förfarande beror noggrant på den avkastning som behövs för varje specifikt experiment och därmed på antalet ciliära ganglier som måste isoleras. För en uppskattad avkastning på 1 x 106 celler/ml, isolera cirka 70 ciliära ganglier (35 ägg). För detta antal ganglier kommer det att ta 2-3 timmar för dissekeringsförfarandet och totalt 4-5 timmar för det totala förfarandet. En steg-för-steg-illustration av isoleringsprotokollet visas i figur 1A. Identifieringen av ciliary ganglion kan vara svårt, särskilt när du utför detta protokoll för första gången. Den ciliary ganglion är lokaliserad nära synnerven och choroid spricka (Figur 1B). De viktigaste stegen i dissekeringsförfarandet visas i figur 2. Först avlägsnas embryot från ägget och placeras i iskall HBSS. Huvudet är separerat från kroppen och, återigen, placeras i iskall HBSS i en dissekering Petriskål (Figur 2A-2C). Därefter avlägsnas ögat från huvudet på ungen och den ciliary ganglion är isolerad (Figur 2D-2H).
De kulturer som erhålls med detta protokoll är högt rena. Men rengöring av ganglier och ta bort överflödig vävnad dikterar starkt framgång och renhet av kulturen. Cellerna utvecklas snabbt och kan användas redan under de första dagarna i kulturen om det övergripande experimentet kräver det. Ändå kan kulturerna underhållas i 15 dagar, eller mer. Om du använder kulturerna längre än 7-8 dagar, se till att ersätta en tredjedel av odlingsmediet med färskt medium var 2-3 dagar. Efter 1 dag in vitro, CG nervceller visar en multipolär morfologi. Emellertid, neurite förlängning sker snabbt, och en primär neuronal nätverk är redan etablerad efter 24 timmar. Efter 8 dagar in vitro, nervceller redan övergått till ett unipolärt tillstånd, där en av neuriterna sträcker sig och bildar axon. Neuronala nätverket är mycket tätt i detta utvecklingsstadium (figur 3 och figur 4).
Ciliary ganglion nervceller är kolinerga nervceller som tillhör det parasympatiska nervsystemet. In vivo, dessa nervceller är ansvariga för muskel innervation i ögat. Dessa neuronala kulturer är mycket väl lämpade för studier av neuromuskulära synapser. För detta, CG nervceller kan pläteras på toppen av muskelceller. Chick bröstmuskeln dissekerades och får utveckla och mogna in vitro tills DIV 4. CG nervceller var sedan pläterade ovanpå muskelskiktet och co-kultur får utvecklas i 3 dagar. Vid denna tidpunkt bildas muskelfibrer och kan lätt identifieras genom närvaron av flera kärnor (blå). Synaptisk vesikel glykoprotein 2A (SV2) immunfärgning, en presynaptisk markör visar förekomsten av synapser som är etablerade mellan CG nervceller axoner och muskelfibrer (Figur 5).
Figur 1: Systemet för dissekeringsprotokollet och den ciliära ganglionen. AADiagram över isolerings- och kulturprotokollet. (B)Schema för chick ciliary ganglion lokalisering i den bakre delen av ögat. Synnerven, ciliary ganglion och choroid spricka indikeras av pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dissekering av E7 chick ciliary ganglion. (A)Skär toppen av ägget med sax. (B)Ta bort embryot från ägget med en sked och placera det i en dissekering Petriskål med iskall HBSS. (C)Separera huvudet från kroppen genom att skära i nackområdet. (D)Fäst embryots huvud i näbben och håll fast med kraft º 5. (E) Ta bort ögat genom skonsam rotation med hjälp av forcep nº 55. (F)Bakre syn på ögat. Pilar indikerar lokalisering av synnerven, choroid spricka och ciliary ganglion. GG) Dissekera den ciliära ganglion. (H) Dissekeras ciliary ganglion. Överflödig vävnad bör avlägsnas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ciliary ganglion nervceller utveckling in vitro. Fas kontrast bilder av CG nervceller vid DIV 1, 3, 8 och 15. Som CG nervceller är pläterade, de omedelbart inleda neurite utväxt. Vid DIV 15 är axonalnätverket mycket tätt och i detta skede är neurites helt differentierade till dendriter och axoner. Fas kontrast-bilder förvärvades med hjälp av en confocal mikroskop med en plan-Apochromat 20x ph2 mål. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunocytokemi av CG nervceller vid DIV 8. CG nervceller visar en väletablerad neuronala nätverk efter 8 dagar in vitro. Kärnor var färgas med DAPI (blå) och axons var färgade med b-III tubulin (röd). Fluorescensbilder förvärvades med hjälp av ett konfokalt mikroskop med ett plan-Apochromat 20x-mål. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Odlade CG nervceller upprätta synapser med muskelfibrer. Immunocytochemistry bilder av CG nervceller-bröstmuskelkokulturer. Muskel fibrer identifieras av streckade linjer nuvarande flera kärnor, som var färgade med DAPI (blå). Axons var märkta mot neurofilament (röd) och synaptiska blåsor var märkta mot SV2 (cyan). Bilder förvärvades med hjälp av ett konfokalt mikroskop med en plan-Apochromat 63x olja mål. Skala bar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll visade vi hur man förbereder och kultur CG nervceller. Identifiering och dissekering av ciliary ganglion kan vara svårt för oerfarna användare. Därför presenterar vi en detaljerad och steg-för-steg förfarande för att effektivt dissekera E7 chick ciliary ganglier, separera vävnaden och förbereda neuronala kulturer som kan upprätthållas i minst 15 dagar. Ciliary ganglion nervceller som erhållits med detta protokoll är också lämpliga för samkultur med muskelceller.
Ciliary ganglierna i olika utvecklingsstadier av chick embryonala utveckling kan användas som en cell modell, beroende på syftet med studien. Men för kulturer av CG nervceller föreslås det att de isoleras från chick embryo mellan embryonala dagar 7 och 818. I det embryonala stadiet E8, CG nervceller har ännu inte genomgått neuronala dödsprocesser och antalet icke-neuronala celler minskas jämförelsevis med neuronala celler18. Detta, i kombination med en rigorös dissekering förfarande och mycket väl rengjorda ganglier, kommer att bidra till en mycket ren kultur av ciliary ganglion nervceller, med liten kontaminering av icke-neuronala celler, såsom fibroblaster eller gliaceller.
Under isoleringen av CG nervceller, en av de kritiska punkterna är identifiering och rengöring av CG. Dissekering av en så liten struktur, som ciliary ganglion, kan vara svårt med tanke på lokaliseringen, förmågan att identifiera ganglion samt storleken på ganglion själv. Det är normalt att ganglierna kan fästa vid pincetten under dissekering. Högkvalitativa dissekeringsinstrument är mycket viktiga för en lyckad dissekering och kommer att minimera fästet av ganglierna till pincetten. Rengöring av GC är viktigt att förhindra kontaminering med icke-neuronala celler. Det är nödvändigt att isolera cirka 70 ganglier för att få en cellulär densitet på ~ 1x106 celler/ml, i motsats till andra neuronala vävnader i det perifera nervsystemet som har en 5-15x större antal ganglier3.
I kultur minskar tillägget av 5'-FDU till det kompletta mediet föroreningen av GC-kulturen med icke-neuronala celler. 5'-FDU är en anti-mitotisk förening som hämmar cellproliferation, nämligen spridningen av gliaceller och fibroblaster. Koncentrationen av 5'-FDU tillsätts till mediet är tillräckligt för att stoppa cellcykeln i S-fasen men är inte skadligt för den normala utvecklingen av CG nervceller3,,19,20. Behandlingstiden med 5'-FDU kan justeras. Men eftersom CG nervceller upprätta en tät axonal nätverk på kort tid, 5'-FDU bör läggas till kulturen så tidigt som tidpunkten för plätering.
En av de viktigaste begränsningarna i denna modell är att det inte är representativt för den normala utvecklingen av CG nervceller under fysiologiska förhållanden. I ovo dör ungefär hälften av CG-nervceller mellan den8:e och 14:e dagen av embryoutvecklingen av kycklingar. I kultur, Det finns ingen minskning av antalet CG nervceller när mediet kompletteras med neurotrofa faktorer som tillåter dess överlevnad1,6,14.
Neuronal befolkningen som erhållits från dissekering av chick ciliary ganglion är en homogen population av kolinerga nervceller, som tillhör det autonoma nervsystemet. Det bör noteras att uttrycket av signalsubstanser i koroid befolkningen i CG är mål-driven, som kan hämmas beroende på vilken typ av muskler som används i samkultur24. Om syftet med studien är relaterat till den genetiska identiteten eller subtyp av motor neuron själv, då CG nervceller kanske inte är den bästa lämpliga neuronal modell. Också, specificiteten av motoriska nervceller i innervation av muskelfibrer kan inte åstadkommas när du använder CG neuron co-kulturer eftersom, i detta fall, muskelfibrerna kan multiplicera innerverad25. Emellertid, denna neuronal kultur har flera fördelar, det kräver bara grundläggande utrustning för att underhålla och inkubera äggen, det är ett någorlunda billigt förfarande och, ännu viktigare, ger en utmärkt modell för studier av neuromuskulära synapser1, eftersom CG nervceller neurotransmission mekanismer är mycket lika de som förekommer i spinal motor nervceller. Cellmodellerna som tidigare användes för denna typ av studier var sensoriska nervceller från ryggmärgen12,21,22,23. Emellertid, dessa co-kulturer bestod av en heterogen population av nervceller, inte alla kolinerga och därmed endast en liten del av nervceller kunde etablera funktionella kontakter med muskelcellerna1. Förutom utvecklingsanalys (immunocytokemi) som visats i detta arbete kan andra analyser utföras i CG-kulturer som elektrofysiologi och neuronal överlevnad.
Baserat på detta protokoll kan ytterligare vetenskapliga frågor tas upp, till exempel hur subcellulär lokalisering av specifika mRNAs och proteiner reglerar synapsbildning och funktion. Dessutom kan nerv-muskel co-kulturer lätt fastställas och användas ytterligare för att studera neuromuskulära sjukdomar när platsen för skada är den neuromuskulära korsningen. Neuromuskulära sjukdomar är heterogena i naturen i den meningen att dysfunktion kan associeras med muskeln själv, de perifera nerver eller neuromuskulära korsningar26. Således, genom dessa samkulturer skulle det vara möjligt att studera neuromuskulära korsning förändringar som i slutändan ligger till grund för utveckling och progression av neuromuskulära sjukdomar. En annan intressant möjlighet skulle vara att anpassa detta protokoll till musen trigeminal system. Dessa nervceller är lättillgängliga, och deras utvecklingsmönster är välkänd27. Eftersom möss är mottagliga för genetisk manipulation och trigeminalsystemet är väl karakteriserat i termer av topografisk karta bildning nya möjligheter uppstår genom att använda en trigeminal-baserade protokoll för att studera neuronal utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), genom det regionala operativa programmet Centro 2020 inom projekten CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, och genom COMPETE 2020 - Operativt program för konkurrenskraft och internationalisering och portugisiska nationella medel via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projekt UIDB/04539/2020. UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008 och de enskilda bidragen SFRH/BD/141092/2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) och marie curie-åtgärder - IRG, sjunde ramprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
