Summary
小鸡丝神经通（CG）是寄生虫神经系统的一部分。在神经肌肉相互作用研究中，小鸡CG神经元的神经元培养被证明是有效的细胞模型。我们描述了从小鸡胚胎中解剖、分离和体外培养的详细方案。
Abstract
小鸡丝骨神经合体（CG）是寄生虫神经系统的一部分，负责眼睛中肌肉组织的内膜。这种结节是由一个同质的胆小和胆状神经元组成的，分别内维条纹和平滑的肌肉纤维。这些神经元类型都调节特定的眼部结构和功能。多年来，在肌肉-神经系统相互作用研究中，小鸡胆碱神经的神经元培养被证明是有效的细胞模型，通过胆碱性突触进行交流。胆结神经元，在其大多数，胆碱性。与以前使用的异质细胞模型相比，这种细胞模型已被证明是有用的，这些异构细胞模型包括多种神经元类型，除了胆碱。解剖学上，胆碱结节在视神经（ON）和胆状肌瘤（CF）之间局部。在这里，我们描述了从小鸡胚胎中解剖、分离和体外培养的一个详细程序。我们提供一个分步协议，以获得CG神经元高度纯净稳定的细胞培养，突出过程的关键步骤。这些文化可以在体外保持15天，在此，我们显示了CG文化的正常发展。研究结果还表明，这些神经元可以通过神经肌肉胆碱性突触与肌肉纤维相互作用。
Introduction
Ciliary结节（CG）神经元属于寄生神经系统。这些神经元是胆碱，能够建立肌肉或烟酸突触1，2，3。,31,从解剖学上讲，CG位于视神经（ON）和胆虫肌瘤（CF）之间的眼后部，由大约6000个处于早期胚胎阶段1、4,的神经元组成。在培养的第一周，硅突神经元呈现多极形态。一周后，他们开始过渡到单极状态，一个神经石延伸并形成轴孔5。此外，大约一半的CG神经元死亡之间的8天至14日小鸡胚胎发育，通过细胞死亡的编程过程。神经元数量的减少导致大约3000个神经元6，7，86,的西里结子的总种群。在体外，当生长与肌肉细胞9和CG神经元可以培养几个星期1，9时，CG神经元的数量没有减少。
胆结由同性细胞神经元和胆状神经元的均匀种群组成，每个细胞群代表CG中神经元群的一半，内维眼睛的肌肉。这两种类型的神经元在结构上、解剖学和功能上是截然不同的。虹膜和透镜上的心肌神经元内侧，负责瞳孔收缩。胆道神经元内侧,增强胆道1、10、11、121,10,11的平滑肌。
鸡骨结神经元的培养已被证明是研究神经肌肉突触和突触形成1，5，95的有用工具。1考虑到神经肌肉突触是胆碱13，使用神经群是胆碱性-CG神经元-出现作为一个潜在的替代以前的细胞模型14。这些模型包括异源神经元群体，其中只有一小部分是胆碱性。或者，在体外发育得相对较快，大约15小时后已经形成突触1。CG神经元多年来一直被用作模型系统，用于不同的研究，因为它相对容易分离和操作。这些应用包括光遗传学研究，突触发育，凋亡和神经肌肉相互作用14，15。14,
我们描述了从胚胎第7天（E7）小鸡胚胎中解剖、分离和体外培养的一个详细程序。我们提供一个分步协议，以获得高度纯净和稳定的细胞培养的胆碱神经元。我们还强调了需要特别注意并改善神经元培养质量的协议的关键步骤。这些培养物可以在体外保持至少15天。
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Protocol
1. 试剂制备
注：本程序所需的材料如下：钳子（第5和no 55）、手术钳、解剖培养皿（黑底）、24孔板、塑料巴斯德移液器、火抛光玻璃巴斯德移液器、10 mL注射器、0.22μm注射器过滤器。
- 准备和消毒协议所需的所有材料，包括玻璃盖玻片、钳子（第5和no 55）、手术钳子、培养皿（黑底）、蒸馏H2O、移液器和手术材料。
- 准备 0.1 毫克/mL 聚-D-Lysine （PDL） 溶液。
- 在0.1 M玻酸缓冲液（pH 8.2）中重组PDL，浓度为1mg/mL（10x溶液）。
- 在 166.6 mM 玻利气液缓冲液 （pH 8.2） 中稀释 1：10，以获得 0.1 mg/mL 的最终浓度。
- 准备 10 μg/mL 层压素溶液。
- 在普通神经基础介质中稀释1mg/mL层宁，最终浓度为10μg/mL。
- 准备汉克的平衡盐溶液 （HBS）： 5.36 mM KCl， 0.44 mM KH2PO4， 137 mM NaCl， 4.16 mM NaHCO3， 0.34 mM Na2HPO4+2H2O， 5 mM 葡萄糖， 1 mM 丙酮酸钠， 10 mM HEPES 缓冲液， 0.001% 苯酚红色.将 pH 调整到 7.2。
- 准备 0.1% 的 trypsin 溶液。
- 在5 mL的HPSS中溶解5毫克的尝试蛋白1：250粉末，最终浓度为0.1%。
- 在4°C下放入滚筒搅拌机中，直到完全溶解。
- 使用 10 mL 注射器和 0.22 μm 注射器过滤器进行过滤器。
- 准备丝室神经节不完全介质：无谷氨酰胺的神经基础介质，1X B27（光敏），10%热灭活马血清，2%热灭活FBS，12.5 U/mL青霉素/链霉素（0.25x）和2mM谷氨酰胺。使用无菌试剂，并在无菌条件下准备培养介质。
- 准备硅刚体完整介质（辅以生长因子）：在不完全介质上，加入5纳克/mL GDNF和5纳克/mL CNTF。
2. 为24孔板准备玻璃盖玻片
- 将所需数量的玻璃盖玻片放在耐酸容器内，并加入 65% 的硝酸，直到所有盖玻片被淹没。将容器放在轨道摇床中，在室温 （RT） 下以 1000 rpm 的速度孵育过夜。
- 第二天，小心地将硝酸转移到一个小储液罐中，并储存进一步使用。硝酸可再使用2-3倍。
- 小心地将蒸馏的 H2O 添加到盖玻片中，以去除剩余的硝酸。搅拌 30 分钟，丢弃洗涤溶液，重复此 5 倍。
- 用 75% 乙醇冲洗盖玻片两次。
- 小心地分离并放置单个盖玻片，将铝箔覆盖在金属机架中，并在 50 oC 下孵育 10-15 分钟，或直到完全干燥。
注：请勿将玻璃盖玻片进行遮挡，因为它们会相互粘附。 - 在紫外线下消毒盖玻片 10-15 分钟。保持盖玻片无菌的神经元组织培养。
3. 24 孔板的玻璃盖玻片涂层
- 使用无菌钳子，在 24 井板的每个井中放置一个盖玻片。
- 加入500μL 0.1毫克/mL PDL，在37°C下孵育过夜。
- 第二天，用无菌蒸馏H2 O冲洗盖玻片两次。然后，将500μL的蒸馏水加入每个盖玻片，并在室温下离开30分钟。
- 弃水，在每个井中加入350μL的10μg/mL层压素溶液。
- 放在37°C培养箱中2小时。
- 在细胞电镀之前，取出层压素溶液，用普通神经基础介质洗涤两次。
注：盖玻片必须不干燥。 - 加入300μL的完整介质，在37°C和5%CO2的培养箱中离开，直到电2镀时间。在电镀电池之前，请取出此介质。
4. 鸡胚胚的丝骨节生文化 （胚胎第7天）
- 硅刚体解剖 （CG）
- 从孵化器中取出鸡蛋，用75%乙醇喷洒。
注：鸡蛋储存在+16°C，然后以37.7°C孵育7天（或所需的胚胎期）。这里使用的鸡蛋来自罗斯鸡种。 - 用剪刀切掉鸡蛋的顶部，用勺子取出胚胎。将胚胎放在带冰冷HSS的培养皿中，通过颈部区域切割将头部与身体分离。
注：一旦胚胎从卵子中去除，它就可以产生导致细胞死亡的蛋白酶。一旦胚胎在壳体外，迅速将头部与身体分离，以尽量减少细胞死亡，这一点很重要。 - 将胚胎的头部放在冰冷的 HBSS 中。
- 举起胚胎头，用5个钳子把它固定在小鸡的嘴上。然后用55个钳子，开始去除眼睛周围的薄层皮肤。
- 小心地取出眼睛并旋转眼睛以进入后部。分离眼睛和小鸡头部时，注意视神经被分部。这将有助于本地化的 cilis 结节。
- 一旦眼睛被分离，保持它与后侧向上，并注意到与分割的视神经和胆状肌裂变相邻的胆结。前结神经可能仍然附着在丝雀结节上，这有利于识别。
- 从每只眼睛中解剖结节，通过去除每个结节周围的多余的组织来清洁得很好。
注：要具有±1x106个细胞/mL的产率，解剖±70 CGs。请注意，获得的细胞组也含有非神经元细胞。为了减少非神经元细胞的数量，从而增加神经元群的纯度，尽可能清洁丝骨神经，去除所有多余的组织是非常重要的。
- 从孵化器中取出鸡蛋，用75%乙醇喷洒。
- 硅联的分离与文化
- 使用无菌塑料巴斯德移液器将所有硅刚杆收集到 15 mL 管中。
注：必须预先湿润巴斯德移液器，以尽量减少将小松附到移液器壁上。 - 在200 x g下离心2分钟。
- 小心地，使用巴氏移液器和 P1000 微移液器拆下所有 HBSS 介质。加入1 mL的0.1%的三辛酸盐溶液，在37°C的水浴中孵育20分钟，无搅拌。
- 在200 x g下离心2分钟。
- 立即删除 trypsin 溶液，并添加 1 mL 的不完整介质。
注：不完全的介质含有血清，这将立即停止尝试蛋白的效果。 - 在 200 x g 下离心 2分钟，并取出所有介质。
- 加入350-500μL的完整介质。
注：分离细胞所需的体积取决于获得的硅细胞数量，因此取决于获得的颗粒大小。对于 ±70 CG，建议使用 500 μL 的介质。 - 首先使用 P1000 将上下移液 10-15 倍，然后使用火抛光玻璃巴斯德移液器 10-15 倍，分离 10-15 倍。避免形成气泡，以尽量减少细胞损失。
注：将细胞悬浮液放在冰上直到电镀。 - 使用 Trypan 蓝色溶液和标准 Neubauer 腔室确定细胞密度。
- 板 1 x 104细胞/mL 在 24 井板的每个井中，通过稀释适当体积的细胞悬浮液在 500 μL 的完整介质（辅以 10 μM 5'-FDU）。
- 在37°C中孵育细胞，5%CO2培养箱。
- 使用无菌塑料巴斯德移液器将所有硅刚杆收集到 15 mL 管中。
5. 细胞细胞化学及细胞神经元图像分析
- 执行本文中介绍的免疫细胞化学测定，如前面描述的16、17。16,
- 使用以下原抗体：小鼠单克隆b-III 块蛋白 （1：1000， T8578），鸡单克隆神经丝 M （1：1000， AB5735），小鼠单克隆 SV2 （1：1000， AB2315387）。
- 作为二级抗体， 使用亚历克萨氟568结合山羊抗小鼠抗体（1：1000，A11031），亚历克萨氟568结合山羊抗鸡抗体（1：1000，A11041），亚历克萨氟647-结合山羊抗小鼠抗体（1：1000，A21235）。
- 使用带 DAPI 的安装介质安装盖玻片，用于核染色 （P36935）。
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Representative Results
此过程的估计持续时间紧要取决于每个特定实验所需的产量，因此取决于需要分离的硅合体数量。对于估计产量为1 x 106细胞/mL，分离约70个硅节（35个鸡蛋）。对于这一数量的刚体，解剖过程需要2-3小时，整个手术总共需要4-5个小时。图 1A 显示了隔离协议的分步图示。识别硅丝结节可能很困难，尤其是在首次执行此协议时。胆结在视神经和胆状肌裂附近的局部（图1B）。解剖过程的关键步骤如图2所示。首先，胚胎从卵子中取出，放在冰冷的HSS中。头部与身体分离，并再次被放置在冰冷的HSSS中解剖培养皿（图2A-2C）。然后，眼睛从小鸡的头部被移除，与小鸡结节分离（图2D-2H）。
通过该协议获得的区域性非常纯净。然而，清洁结干和去除多余的组织强烈地决定了培养的成功和纯度。细胞发育迅速，如果整个实验需要的话，可以在培养的第一天使用。然而，文化可以保持15天，或更多。如果使用培养物超过 7-8 天，请确保每 2-3 天用新鲜培养物替换三分之一的培养媒介。体外1天后，CG神经元表现出多极形态。然而，神经素延长发生迅速，并在24小时后已经建立了一个初级神经元网络。体外8天后，神经元已经过渡到单极状态，其中一个中性体延伸并形成轴突。神经元网络在这个发展阶段非常密集（图3和图4）。
胆结神经元是属于寄生虫神经系统的胆碱性神经元。在体内，这些神经元负责眼睛的肌肉内侧。这些神经元培养非常适用于神经肌肉突触的研究。为此，CG神经元可以镀在肌肉细胞的顶部。小鸡胸肌被解剖，并允许在体外发育和成熟，直到DIV 4。然后，CG神经元被镀在肌肉层的顶部，共同培养允许再发展3天。此时点，肌肉纤维形成，可以很容易地识别多核（蓝色）的存在。突触囊泡糖蛋白2A（SV2）免疫着色，一个突触标记显示在CG神经元轴突和肌肉纤维之间建立的突触的存在（图5）。
图1：解剖方案方案及硅体结节。（A） 隔离和文化协议图。（B） 眼睛后部的小鸡丝结利定位方案。视神经、胆结和胆状肌瘤由箭头指示。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：E7小鸡丝结的解剖。（A） 用剪刀切掉鸡蛋的顶部。（B） 用勺子将胚胎从卵子中取出，并放在用冰冷的HSS解剖培养皿中。（C） 通过颈部区域切割将头部与身体分开。（D） 将胚胎的头部固定在嘴上，用力握住第5号。（E） 使用力p 55 轻轻旋转，通过柔和的旋转去除眼睛。（F） 眼睛的后视图。箭头表示视神经、胆状肌瘤和胆结的定位。（G） 解剖丝质结节。（H） 解剖的丝质结节。应去除多余的组织。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：体外细胞神经元发育。2001年、3日、8和15号CG神经元的相位对比度图像。当CG神经元被镀上时，它们会立即启动神经土生长。在DIV 15，轴突网络非常密集，在这个阶段，中性被完全区分成树突和轴突。相位对比度图像是使用共和显微镜获得的，具有平面-Apochromat 20x ph2 目标。比例线： 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：CG神经元在DIV 8的免疫细胞化学。CG神经元在体外8天后显示一个成熟的神经元网络。核沾有DAPI（蓝色）和轴角沾染b-III浴缸（红色）。荧光成像仪是使用具有平面-Apochromat 20倍目标的共理显微镜获得的。比例线： 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：培养的CG神经元建立与肌肉纤维的突触。CG神经元-胸肌共培养物的免疫细胞化学图像。由虚线识别的肌肉纤维存在多个核，这些核被染上DAPI（蓝色）。轴突被标记为对神经丝（红色）和突触囊泡被标记为对SV2（青色）。图像是使用共和显微镜获得的，其平面为阿波奇罗马特63倍油目标。比例线： 20 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在该协议中，我们演示了如何准备和培养CG神经元。对于没有经验的用户来说，对西里结子的识别和解剖可能很困难。因此，我们提出了一个详细的和分步的程序，以有效地解剖E7小鸡丝骨神经，分离组织，并准备神经元培养，可以保持至少15天。通过此协议获得的 ciliion 节神经元也适合与肌肉细胞共培养。
根据研究的目的，在小鸡胚胎发育的不同发育阶段，可用作细胞模型。然而，对于CG神经元的培养，建议它们从胚胎7和818之间的小鸡胚胎中分离。在胚胎阶段E8中，CG神经元尚未经历神经元死亡过程，非神经元细胞数量相对减少，神经元细胞18。这，结合严格的解剖程序和非常清洁的节神经，将有助于一个高度纯化的培养的硅丝结节神经元，很少污染非神经元细胞，如成纤维细胞或胶质细胞。
在 CG 神经元的分离过程中，其中一个关键点是 CG 的识别和清洁。考虑到定位、识别结节的能力以及结节本身的大小，解剖如此小的结构（如西里结节）可能很困难。在解剖过程中，小将可能附着在钳子上是正常的。高质量的解剖仪器对于成功的解剖非常重要，并且会最大限度地减少小将附着在钳子上。清洁GC对于防止非神经元细胞污染非常重要。有必要分离约70个神经脂，以获得+1x106细胞/mL的细胞密度，与周围神经系统的其他神经元组织相比，其神经群数量为5-15倍。
在培养中，在完整培养基中加入5'-FDU可减少非神经元细胞对GC培养物的污染。5'-FDU是一种抑制细胞增殖的抗肌酸化合物，即胶质细胞和成纤维细胞的增殖。添加到介质中的5'-FDU浓度足以阻止S相细胞周期，但不会对CG神经元,3、19、2019的正常发育造成不利影响。35'-FDU 的治疗时间可以调整。然而，由于CG神经元在短时间内建立了密集的斧质网络，5'-FDU应尽早加入到培养中。
该模型的主要局限性之一是，它并不代表生理条件下CG神经元的正常发育。在卵子，大约一半的CG神经元在小鸡胚胎发育的第8天至第14天之间死亡。在培养文化中，当培养基补充神经营养因子，允许其生存1，6，14时，CG6神经元的数量不会减少。
从解剖小鸡胆结的神经元获得的神经元群是属于自主神经系统的胆碱神经元的同质种群。应当指出，CG的胆小球群中神经递质的表达是目标驱动的，这可能根据共培养24中使用的肌肉类型而受阻。如果研究的目的是与运动神经元本身的遗传特性或亚类型有关，那么CG神经元可能不是最合适的神经元模型。此外，使用CG神经元共培养物时，运动神经元在肌肉纤维内侧增强中的特异性可能无法实现，因为在这种情况下，肌肉纤维可以乘以内侧增强25。然而，这种神经元培养有几个优点，它只需要基本的设备来维护和孵化卵子，这是一个相当便宜的程序，更重要的是，为研究神经肌肉突触1提供了一个很好的模型，因为CG神经元神经传递机制是非常类似于发生在脊髓运动神经元。以前用于这类研究的细胞模型是脊髓12、21、22、23,21,的感官神经元。然而，这些共培养物由一个异质的神经元群组成，不是所有的胆碱性，因此，只有一小部分神经元能够与肌肉细胞1建立功能接触。除了在这项工作中证明的发育分析（免疫细胞化学）之外，其他分析可以在CG培养文化中进行，如电生理学和神经元生存。
基于此协议，可以解决额外的科学问题，例如特定mRNA和蛋白质的亚细胞定位如何调节突触的形成和功能。此外，神经-肌肉共培养物可以很容易地建立，并进一步用于研究神经肌肉疾病时，伤害的位点是神经肌肉结。神经肌肉疾病本质上是异质的，其意义是功能障碍可能与肌肉本身、周围神经或神经肌肉结部26相关。因此，通过这些共培养，有可能研究神经肌肉结的变化，最终基础神经肌肉疾病的发展和发展。另一个有趣的可能性是使这个协议适应鼠标三叉系统。这些神经元很容易获得，它们的发育模式是众所周知的27。由于小鼠容易接受基因操纵，并且三叉系统在地形图形成方面具有良好的特征，因此使用基于三叉的方案来研究神经元发育，出现了新的可能性。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作由欧洲区域发展基金（ERDF）通过 CentRO-01-0145-FEDER-00008 项目下的区域业务方案供资：脑健康 2020，CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-00003：pAGE， CENTRO-01-0246-FEDER-00018：MEDISIS，并通过竞争2020 - 竞争力和国际化业务方案，葡萄牙国家基金通过FCT - 基金会，即国际电信协会，在UIDB/04539/2020项目下， UIDB/04501/2020，POCI-01-0145-FEDER-02212：PPBI，PTDC/SAU-NEU/104100/2008，以及个人赠款SFRH/BD/141092/141092/2 2018（M.D.），DL57/2016/CP1448/CT0009（R.O.C.），SFRH/BD/77789/2011（J.R.P.）和玛丽居里行动 - IRG，第七框架方案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
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