Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

doi: 10.3791/61431 Published: August 8, 2020
* These authors contributed equally

Summary

גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.

Abstract

גרעינים צ'יק (CG) הם חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית ואחראים לאינבציה של רקמות השריר הקיימות בעין. גנגליון זה הוא היווה על ידי אוכלוסיה הומוגנית של choroidal ונוירונים הinnervate שרירי וחלקה סיבים, בהתאמה. כל אחד מסוגי עצבי אלה לווסת מבנים העין ספציפיים פונקציות. במהלך השנים, תרבויות עצביות של גנגוליה חומוס האפרוח הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים מערכת העצבים, אשר מתקשרים דרך הסינפסות cholinergic. . ברוב הcholinergic מודל תא זה הוכח להיות שימושי יחסית בשימוש בעבר דגמי תאים הטרוגנית המהווים מספר סוגים עצביים, מלבד cholinergic. מבחינה אנטומית, גנגליון הסילארי מקומי בין העצב האופטי (ON) לבין הקרע הדמית (CF). כאן, אנו מתארים הליך מפורט עבור הניתוח, הדיסוציאציה ובתרבות מבחנה של הנוירונים גנגליה גרעינים מעוברי האפרוח. אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להשיג תרבויות הסלולר טהור ויציב מאוד של CG נוירונים, הדגשת צעדי מפתח של התהליך. תרבויות אלה ניתן לשמור על מבחנה במשך 15 ימים, בזאת, אנו מראים את ההתפתחות הנורמלית של התרבויות CG. התוצאות מראות גם כי הנוירונים האלה יכולים לתקשר עם סיבי השריר באמצעות שרירי cholinergic הסינפסות הנוירולוגית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גנגליון (CG) נוירונים שייכים למערכת העצבים הפאראסימפתטית. הנוירונים האלה הם cholinergic, להיות מסוגל להקים מוסריריתיים או הסינפסות ניקולט1,2,3. אנטומית, CG ממוקם בחלק האחורי של העין בין העצב האופטי (על) ואת הקרע דמית (CF) ומורכב סביב 6000 נוירונים בשלבים העובריים המוקדמים1,4. בשבוע הראשון בתרבות, הניריונים גנגליון נוירונים להציג מורפולוגיה רב קוטבי. לאחר שבוע, הם מתחילים לעבור למצב חד קוטבי, עם אחד neurite הרחבה ויצירת אקסון5. בנוסף, כמחצית של הנוירונים למות CG בין היוםה -8 ו -14 של התפתחות העובר צ'יק, באמצעות תהליך מתוכנת של מוות התאים. ירידה זו מספר הנוירונים תוצאות באוכלוסייה הכוללת של גנגליון הגאנגרי של סביב 3000 נוירונים6,7,8. בתוך מבחנה, אין ירידה במספר של CG נוירונים כאשר גדל עם תאים שרירים9 ו-cg נוירונים יכול להיות מתורבת במשך מספר שבועות1,9.

גנגאריה מורכב מאוכלוסיה הומוגנית של נוירונים סיליברי ונוירונים choroidal, כל אחד מייצג חצי מהאוכלוסייה העצבית ב-CG, innervating שריר העין. שני סוגים אלה של נוירונים הם מבנית, מאנטומית ומבחינה פונקציונלית. הנוירונים סיליברי innervate סיבי השריר הסטריבטים על הקשתית והעדשה, האחראים על התכווצות האישון. Choroidal נוירונים innervate השריר החלק של הדמית1,10,11,12.

תרבויות של עוף בצורת גנגליון נוירונים הוכחו להיות כלים שימושיים לחקר הסינפסות נוירוסכולריות והיווצרות סינפסה1,5,9. בהתחשב בעובדה כי סינפסות נוירו-מולקולרית הם cholinergic13, באמצעות אוכלוסייה עצבית כי הוא CHOLINERGIC – CG נוירונים – התפתחה כחלופה פוטנציאלית דגמי התא הקודם14. מודלים אלה היו באוכלוסיה עצבית הטרוסוגלית, שבה רק חלק קטן הוא cholinergic. לחילופין, הנוירונים מתפתחים בצורה מהירה יחסית בתוך מבחנה, ולאחר כ -15 שעות כבר יוצרים את הסינפסות1. הנוירונים CG שימשו מערכת מודל לאורך השנים למחקרים מחקר ברורים, בשל קלות יחסית של בידוד ומניפולציה. יישומים אלה כוללים מחקרים אלקטרואופטיקה, התפתחות סינפסה, אפופטוזיס ואינטראקציות נוירוסקולריות14,15.

אנו מתארים הליך מפורט עבור הניתוח, הדיסוציאציה בתרבות מבחנה של הנוירונים גרעינים של מיום העובריים 7 (E7) בחורה עוברים. אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לקבל תרבויות סלולר טהור ויציב מאוד של נוירונים cholinergic. אנו מדגישים גם את צעדי המפתח של הפרוטוקול הדורשים תשומת לב מיוחדת, ושישפרו את איכות התרבויות הנוירואליות. התרבויות הללו יכולות להישמר. באופן מתורבת לפחות 15 יום

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת ריאגנטים

הערה: החומרים הנחוצים להליך זה הם הבאים: מלקחיים (n º 5 ו-n º 55), מלקחיים כירורגיים, לחיתוך מנות פטרי (שחור תחתון), 24-צלחות, מזרקים פסטר מפלסטיק, זכוכית מלוטשת פסטר הצינורות, 10 מ"ל מזרק, 0.22 יקרומטר מזרק מסנן.

  1. להכין ולעקר את כל החומר הדרוש לפרוטוקול כולל שמיכות זכוכית, מלקחיים (n º 5 ו-n º 55), מלקחיים כירורגיים, מנות פטרי (שחור תחתון), מזוקק H2O, פיפטות וחומר לניתוח.
  2. להכין את 0.1 mg/mL פולי-D ליזין (PDL) פתרון.
    1. מהווים מחדש PDL ב 0.1 M בוראט מאגר (pH 8.2) לריכוז של 1 מ"ג/mL (פתרון 10x).
    2. לדלל 1:10 ב 166.6 mM בוראט מאגר (pH 8.2) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1 mg/mL.
  3. הכנת 10 μg/mL פתרון למינציה.
    1. לדלל 1 מ"ג/mL למינציה במדיום נוירובסיס רגיל לריכוז הסופי של 10 μg/mL.
  4. להכין את הפתרון של מלח מאוזן של האנק (HBSS): 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 137 mm הנאקל, 4.16 mM NaHCO3, 0.34 mm Na2hpo4· 2h2O, 5 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 מ"מ מאגר hepes, 0.001 x פנול אדום. התאם את ה-pH ל-7.2.
  5. הכינו 0.1% טריפסין פתרון.
    1. לפזר 5 מ ג טריפסין 1:250 אבקה ב 5 מ ל של HBSS עבור ריכוז סופי של 0.1%.
    2. הציבו מערבל רולר ב -4 ° c עד התפרקה לחלוטין.
    3. מסנן באמצעות מזרק 10 מ ל ו-0.22 יקרומטר מסנן מזרק.
  6. הכנת מדיום בינוני בלתי מושלם: neurobasal סיס מדיום ללא גלוטמין, 1X B27 (תמונה תלויית), 10% מחממים סרום הסוס, 2% חום המופעל fbs, 12.5 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (0.25 x) ו 2 מ"מ גלוטמין. השתמש ריאגנטים סטרילי ולהכין את המדיום תחת תנאים סטריליים.
  7. הכינו מדיום בינונית להשלים (בתוספת גורמי צמיחה): למדיום לא שלם, להוסיף 5 Ng/ML gdnf ו 5 Ng/ML CNTF.

2. הכנת שמיכות זכוכית עבור צלחות 24-טוב

  1. מניחים את המספר הרצוי של שמיכות זכוכית בתוך מיכל עמיד חומצה ולהוסיף 65% חומצה חנקתית עד כל הכיסויים מתחת לפני השטח. מניחים את המיכל ב שייקר מסלולית ו-דגירה לילה בטמפרטורת החדר (RT) במהירות של 1000 סל ד.
  2. למחרת, בזהירות להעביר את החומצה החנקנית למאגר קטן וחנות לשימוש נוסף. חומצה חנקתית ניתן להשתמש מחדש 2-3x.
  3. בזהירות, להוסיף H מזוקקים2O כדי שמיכות כדי להסיר את החומצה החנקתית שנותרו. מניחים בעצבנות למשך 30 דקות, זורקים את פתרון הכביסה וחוזרים על 5x.
  4. לשטוף את הכיסויים עם 75% אתנול פעמיים.
  5. בזהירות נפרד ומקום שמיכות בודדים בארון מתכת מכוסה רדיד אלומיניום ו דגירה ב 50 º C עבור 10-15 דקות או עד באופן מלא יבש.
    הערה: אין לבצע כיסוי שמיכות זכוכית כפי שהם נדבקים זה לזה.
  6. לחטא את שמיכות תחת אור UV עבור 10-15 דקות. שמור על כיסוי סטרילי. לתרבות הרקמה העצבית

3. ציפוי שמיכות זכוכית לצלחות 24 שעות ביממה

  1. באמצעות tweezer סטרילי, המקום שמיכות אחד בכל טוב של הצלחת 24.
  2. הוסף 500 μL של 0.1 mg/mL PDL ו-דגירה לילה ב 37 ° c.
  3. למחרת, לשטוף את שמיכות פעמיים עם מזוקק H2O סטרילי. לאחר מכן, הוסף 500 μL של מים מזוקקים לכל שמיכות ולעזוב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. להיפטר המים ולהוסיף 350 μL של 10 μg/mL הפתרון בכל טוב.
  5. מניחים בחממה 37 ° c במשך 2 שעות.
  6. לפני ציפוי התא, להסיר את התמיסה למינציה ולשטוף פעמיים עם מדיום נוירובסיס רגיל.
    הערה: חשוב שהכיסויים לא יהיו יבשים בכל עת.
  7. הוסף 300 μL של בינוני מלא ולעזוב בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עד הציפוי הזמן. לפני הציפוי של תאים, הסר מדיום זה.

4. תרבות של גנגוליה מתוך עוף עובר (יום מעובז 7)

  1. חיתוך גנגליה (CG)
    1. להסיר ביצים מאינקובטור ולרסס אותם עם 75% אתנול.
      הערה: הביציות מאוחסנות ב-~ 16 ° c לפני היותה מודחלת ב-37.7 ° c במשך 7 ימים (או בשלב העובריים הרצוי). ביצים שמשמשות כאן. הן ממין עוף רוס
    2. חותכים את החלק העליון של הביצה עם מספריים ולהוציא את העובר באמצעות כפית. מניחים את העובר בצלחת פטרי עם HBSS קר קרח ומפרידים את הראש מהגוף על ידי חיתוך באזור הצוואר.
      הערה: ברגע שהעובר יוסר מן הביצה, הוא יכול לייצר פרוטסים האחראים למוות התאים. חשוב להפריד במהירות את הראש מן הגוף ברגע העובר מחוץ למעטפת כדי למזער את מוות התאים.
    3. שמרו על ראש העובר. בתוך הקרח הקר
    4. תחזיק את ראש העובר למעלה ותתקן אותו. במקור של האפרוח עם מלקחיים משנת 5 ואז עם n º 55 מלקחיים, להתחיל להסיר את השכבה הדק של העור סביב העין.
    5. הסר בזהירות את העין וסובב אותו כדי לגשת לחלק האחורי. , בזמן שהפרדת העין מראש האפרוח. הבחנתי בעצב הראייה מוכן זה יעזור להתאים את. הגנגליון הסילארי
    6. ברגע שהעין מופרדת, שמור אותו עם הצד האחורי ושים לב גנגליון החד הסמוך לעצב הראייה השולי ולסדק הדמית העין. העצב הטרום-גנגיוני עשוי עדיין להיות מחובר לגאנגליון הסיליברי, המקל על זיהויו.
    7. לנתח את גנגליון הסילארי מכל עין ולנקות טוב מאוד על ידי הסרת הרקמה העודפת סביב כל גנגליון.
      הערה: כדי לקבל תשואה של ~ 1x106 תאים/mL, נתח ~ 70 cgs. הינכם מתבקשים לשים לב כי אוכלוסיית התא המתקבלת מכילה גם תאים לא-עצביים. כדי להקטין את מספר התאים הלא-עצביים, וכתוצאה מכך, הגדילו את טוהר האוכלוסיה העצבית, חשוב מאוד לנקות את הגאנגליה הסילרית ככל האפשר, ולהסיר את כל הרקמה העודפת.
  2. דיסוציאציה ותרבות של גנגליה
    1. לאסוף את כל גרעינים כדי 15 מ ל שפופרת באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילי פסטר.
      הערה: חשוב להרטיב מראש את הפיפטה הפסטר כדי למזער את ההחזקה של הגאנגליה לקיר הפיפטה.
    2. צנטריפוגה את הגאנגליה הסיליגיתבמשך 2 דקות ב 200 x g.
    3. בזהירות, להסיר את כל מדיום HBSS באמצעות פיפטה פסטר ולאחר מכן P1000 מיקרופיפטה. הוסף 1 מ ל של 0.1% טריפסין פתרון ו הדגירה למשך 20 דקות ב 37 ° c באמבט מים, ללא עצבנות.
    4. צנטריפוגה 2 דקות ב 200 x g.
    5. הסר באופן מיידי את התמיסה טריפסין והוסף 1 mL של אמצעי בינוני לא שלם.
      הערה: המדיום השלם מכיל סרום אשר יעצור באופן מיידי את השפעת טריפסין.
    6. צנטריפוגה 2 דקות ב 200 x g ולהסיר את כל המדיום.
    7. הוסף 350-500 μL של בינוני מלא.
      הערה: הנפח הדרוש כדי לנתק את התאים תלוי במספר גרעינים המתקבל, ובכך, על גודל גלולה שהושג. עבור ~ 70 CG מומלץ להשתמש 500 μL של בינוני.
    8. הנתק CGs על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10-15x הראשון באמצעות P1000 ואחריו 10-15x באמצעות אש-מלוטש זכוכית פסטר. להימנע היווצרות בועות אוויר כדי למזער את אובדן התאים.
      הערה: השאר את ההשעיה התאית על הקרח עד לציפוי.
    9. קביעת הדחיסות התאית באמצעות פתרון כחול של טריבאואר ובחדר רגיל של נובאוור.
    10. צלחת 1 x 104 תאים/mL בכל באר של הצלחת 24-באר על ידי דילול הנפח המתאים של ההשעיה התא ב 500 μl של בינוני מלא (בתוספת עם 10 μm 5 '-fdu).
    11. התאים הדגירה ב 37 ° צ', 5% החממה CO2 .

5. אימונוציטוכימיה וניתוח תמונה של נוירונים סילברי

  1. בצע את השיטת האימונוציטוכימיה המוצגת במאמר זה כמתואר בעבר16,17.
  2. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: מונושבטים בעכבר b-III טובולין (1:1000, T8578), עוף בטיים שבטים נוירופילמנט M (1:1000, AB5735), מונושבטים של העכבר SV2 (1:1000, AB2315387).
  3. כמו נוגדנים משנית, להשתמש אלקסה Fluor 568-עז מצומדת נגד העכבר נוגדנים (1:1000, A11031), אלקסה Fluor 568-עז מצומדת נגד העוף נוגדן (1:1000, A11041), אלקסה Fluor 647-עז מצומדת נגד העכבר נוגדנים (1:1000, A21235).
  4. שמיכות הר באמצעות הרכבה בינוני עם DAPI, עבור כתמים גרעיניים (P36935).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המשך המשוער של הליך זה תלוי בתשואה הדרושה עבור כל ניסוי מסוים, ולפיכך, על מספר גנגוליה הניתן לבידוד. עבור תשואה מוערכת של 1 x 106 תאים/mL, בודד סביב 70 ביצים (35). עבור מספר זה של ganglia, זה ייקח 2-3 שעות עבור הליך הניתוח ו סך של 4-5 שעות עבור ההליך הכולל. אילוסטרציה צעד-אחר-צעד של פרוטוקול הבידוד מוצגת באיור 1A. הזיהוי של גנגליון יכול להיות קשה, במיוחד בעת ביצוע פרוטוקול זה בפעם הראשונה. גנגליון מקומי ליד העצב האופטי והקרע הדמית הריאה (איור 1B). השלבים המרכזיים של שגרת הניתוח מוצגים באיור 2. ראשית, העובר מוסר מן הביצה והניח HBSS קר קרח. הראש מופרד מן הגוף, ושוב, מוצב בתוך HBSS קר-קרח בצלחת פטרי (איור 2א-2c). לאחר מכן, העין מוסרת מראשו של האפרוח והגנגאריה החד מבודד (איור 2ד-2h).

התרבויות המתקבלות עם הפרוטוקול הזה הן טהורות מאוד. עם זאת, ניקוי הגנגליה והסרת הרקמה העודפת מכתיבה בחוזקה את ההצלחה והטוהר של התרבות. התאים להתפתח מהר יכול לשמש כבר בימים הראשונים בתרבות אם הניסוי הכללי דורש כך. עם זאת, ניתן לשמור על התרבויות במשך 15 יום, או יותר. אם השימוש בתרבויות במשך יותר מ 7-8 ימים, הקפד להחליף שליש של מדיום התרבות עם בינוני טרי כל 2-3 ימים. לאחר יום אחד בבית מתורבת, הנוירונים CG להראות מורפולוגיה רב קוטבי. עם זאת, סיומת neurite מתרחשת במהירות, ורשת עצבית ראשית כבר הוקמה לאחר 24 שעות. לאחר 8 ימים של מבחנה, נוירונים כבר העברה למצב חד קוטבי, שם אחד neurites מרחיב וצורות axon. הרשת העצבית מאוד צפופה בשלב זה של הפיתוח (איור 3 ואיור 4).

סילארי הנוירונים הם cholinergic נוירונים השייכים למערכת העצבים הפאראסימפתטית. ב vivo, הנוירונים האלה אחראים לאינבציה שרירים בעין. התרבויות הנוירואליות הללו מתאימות מאוד. לחקר הסינפסות הנוירו-מולקולרית בשביל זה, הנוירונים CG יכול להיות מצופה על גבי תאי שריר. שריר החזה של האפרוח היה גזור והורשה להתפתח ולעבור במבחנה עד DIV 4. הנוירונים CG היו מצופים אז על גבי שכבת השריר ושיתוף התרבות מותר להתפתח במשך 3 ימים נוספים. בשלב זה, סיבי שריר נוצרות וניתן לזהות בקלות על ידי נוכחות של גרעינים מרובים (כחול). המוח הסינפטית שלפוחית החומרים 2A (SV2) חיסוני, סמן טרום סינפטיות מראה את הנוכחות של סינפסות כי הם הקימו בין מחשב הנוירונים CG ואת סיבי השריר (איור 5).

Figure 1
איור 1: הערכה של פרוטוקול החיתוך והגנגליון החד. (א) תרשים של פרוטוקול הבידוד והתרבות. (ב) שיטת הלוקליזציה של הגוזל בחלק האחורי של העין. עצב הראייה, גנגליון והסדק הדמית הריאה מצוינים על ידי חיצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: חיתוך של גנגליון בחורה משנת E7. (א) לחתוך את החלק העליון של הביצה באמצעות מספריים. (ב) להסיר את העובר מהביצה עם כפית ולמקם אותו בצלחת פטרי עם HBSS קר קרח. (ג) להפריד את הראש מהגוף על ידי חיתוך באזור הצוואר. (ד) לתקן את ראש העובר במקור, מחזיק בכוח מתחת 5. (ה) להסיר את העין על ידי סיבוב עדין באמצעות כוחות n º 55. (ו) מבט אחורי של העין. חיצים מצביעים על לוקליזציה של עצב הראייה, הקרע הדמית והגנגליון החד. (ז) מנתח את הגנגליון הסילארי. (ח) בגזור גנגליון. יש להסיר את הרקמה העודפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התפתחות הנוירונים בניריונים בתוך מבחנה. חדות הפאזה תמונות של CG נוירונים ב DIV 1, 3, 8 ו 15. כמו CG הנוירונים מצופה, הם מיד ליזום neurite outgrowth. ב-DIV 15, רשת סיבי היא צפופה מאוד, neurites בשלב זה מובחנים לחלוטין לתוך דנדטים ואקסונים. ניגודיות שלב-תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם תוכנית-apochromat 20x ph2 המטרה. סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אימונוציטוטוכימיה של CG נוירונים ב-DIV 8. הנוירונים CG להראות רשת עצבית מבוססת היטב לאחר 8 ימים ב מבחנה. הגרעינים היו מוכתמים ב-dapi (כחול) ו אקסונים היו מוכתמים ב-b-III טובולין (אדום). האימגנים פלואורסצנטית נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם תוכנית-apochromat 20 x המטרה. סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הנוירונים מתורבתים הCG להקים הסינפסות עם סיבי שריר. בתמונות אימונוציטוכימיה של CG נוירונים-שריר החזה שיתוף תרבויות. סיבי שריר המזוהים על-ידי קווים מקווקווים מציגים מספר רב של גרעינים, שהיו מוכתמים ב-DAPI (כחול). האקטונים הוקלו על התווית של הנוירופילמנט (אדום) ושלפוחיות סינפטית המסומנות נגד SV2 (ציאן). התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם תוכנית-apochromat 63 x מטרת הנפט. סרגל קנה מידה: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בפרוטוקול זה, הדגמנו כיצד להכין ותרבות CG הנוירונים. הזיהוי והניתוח של גנגאריה יכול להיות קשה עבור משתמשים לא מנוסים. לכן, אנו מציגים הליך מפורט צעד אחר צעד כדי לנתח ביעילות E7 צ'יק בחורה, הנתק את הרקמה ולהכין תרבויות נוירואליות כי ניתן לשמור לפחות 15 ימים. הנוירונים בתאי גנגאריה המתקבלים עם פרוטוקול זה מתאימים גם לתרבות שיתוף עם תאים שרירים.

בשלבים התפתחותיים שונים של התפתחות האפרוח ניתן להשתמש כמודל תא, בהתאם למטרת המחקר. עם זאת, עבור תרבויות של CG נוירונים הוא הציע שהם מבודדים העובר צ'יק בין ימים עובריים 7 ו 818. בשלב העובריים E8, CG הנוירונים לא עברו עדיין תהליכי מוות עצביים ומספר התאים שאינם עצביים מופחת יחסית עם תאים עצביים18. זה, בשילוב עם הליך לנתיחה קפדני ומנוקה היטב ganglia, תתרום לתרבות טהורה מאוד של הנוירונים ganglia מאוד, עם זיהום קטן על ידי תאים שאינם עצביים, כגון פיברותקיעות או תאים גליה.

במהלך הבידוד של CG נוירונים, אחת הנקודות הקריטיות היא זיהוי וניקוי של CG. הניתוח של מבנה קטן כזה, כמו גנגליון, יכול להיות קשה לשקול את הלוקליזציה, את היכולת לזהות גנגליון, כמו גם את הגודל של גנגליון עצמו. זה נורמלי כי הגנגליה עשוי להצמיד את הלקחיים במהלך הניתוח. מכשירים לחיתוך איכות גבוהה מאוד חשובים עבור ניתוח מוצלח ויהיה למזער את ההחזקה של גרעינים כדי מלקחיים. ניקוי ה-GC חשוב למנוע זיהום עם תאים לא-עצביים. יש צורך לבודד כ 70 גרעינים כדי לקבל צפיפות תאית של ~ 1x106 תאים/mL, בניגוד עם רקמות נוירואליות אחרות של מערכת העצבים ההיקפית כי יש 5-15x מספר גדול של גרעינים3.

בתרבות, תוספת של 5 '-FDU למדיום השלם מקטין את הזיהום של התרבות GC עם תאים שאינם עצביים. 5 '-FDU הוא מתחם anti-mitotic כי מעכב את התפשטות התא, כלומר התפשטות של תאים גליאל ופיברופיצוצים. הריכוז של 5 '-fdu הוסיף למדיום הוא מספיק כדי לעצור את מחזור התא בשלב S אבל הוא לא מזיק התפתחות נורמלית של CG נוירונים3,19,20. ניתן לכוונן את זמן הטיפול עם 5 '-FDU. עם זאת, מאז CG הנוירונים ליצור רשת סיבי צפופה בזמן קצר, 5 '-fdu יש להוסיף לתרבות כבר מוקדם ככל הזמן של ציפוי.

אחת המגבלות העיקריות של מודל זה היא שזה לא נציג של ההתפתחות הנורמלית של CG הנוירונים בתנאים פיסיולוגיים. ב ovo, כמחצית של הנוירונים למות CG ביןהיום ה 8 ו 14 של התפתחות העובר צ'יק. בתרבות, אין ירידה במספר של CG נוירונים כאשר המדיום הוא שיושלם עם neurotrophic גורמים המאפשרים ההישרדות שלה1,6,14.

האוכלוסיה העצבית המתקבלת מהחיתוך של גנגליון החומוס היא אוכלוסיה הומוגנית של נוירונים cholinergic, השייכת למערכת העצבים האוטונומית. יצוין כי הביטוי של נוירוטרנסמיטורים באוכלוסיית דמית של CG הוא מונחה היעד, אשר עשוי להיות המוכח בהתאם לסוג של שריר המשמש התרבות המשותף24. אם מטרת המחקר קשורה הזהות הגנטית או תת סוג של תא העצב המנוע עצמו, אז CG נוירונים אולי לא להיות המודל העצבי המתאים ביותר. כמו כן, הספציפיות של נוירונים מוטוריים באינבציה של סיבי שריר לא יכול להתבצע בעת שימוש ב-CG שיתוף התרבויות של החברה מאז, במקרה זה, סיבי השריר ניתן להכפיל innervated25. עם זאת, התרבות העצבית הזאת יש כמה יתרונות, זה רק דורש ציוד בסיסי כדי לשמור ומטילה את הביצים, זה הליך זול באופן סביר, יותר חשוב, מספק מודל מצוין לחקר הסינפסות נוירו מולקולרית1, מאז CG הנוירונים מנגנונים נוירותמסורת דומים מאוד אלה המתרחשים נוירונים מנוע השדרה. מודלים התא ששימשו בעבר עבור סוג זה של מחקרים היו נוירונים חושים מחוט השדרה12,21,22,23. עם זאת, אלה שיתוף תרבויות היו מורכבים האוכלוסייה הטרוגנית של נוירונים, לא כל cholinergic, ולכן, רק חלק קטן של הנוירונים היו מסוגלים להקים קשרים פונקציונליים עם תאים שריר1. מלבד האנליזה ההתפתחותית (אימונולוציטוכימיה) הפגינו בעבודה זו מאמר אחר יכול להתבצע בתרבויות CG כמו אלקטרופיזיולוגיה והישרדות עצבית.

בהתבסס על פרוטוקול זה ניתן לטפל שאלות מדעיות נוספות, למשל כיצד לוקליזציה subcellular של mRNAs ספציפיים וחלבונים מווסת היווצרות סינפסה. יתר על כן, שיתוף תרבויות שרירים העצב ניתן להקים בקלות ולהיות בשימוש נוסף כדי ללמוד מחלות נוירוסקולריות כאשר אתר הפציעה הוא הצומת העצבי. מחלות עצבי הגוף הם הטרוגנית בטבע במובן כי התפקוד הלקוי עשוי להיות משויך השריר עצמו, את העצבים היקפיים או את הצמתים הנוירוקולסאליים26. כך, באמצעות שיתוף התרבויות האלה ניתן יהיה ללמוד את השינויים הנוירוקולסארית הצומת כי בסופו של דבר מתחת להתפתחות והתקדמות של מחלות נוירוסקולריות. עוד אפשרות מעניינת תהיה להתאים את הפרוטוקול הזה למערכת העכבר המשולש. נוירונים אלה נגישים בקלות, הדפוס ההתפתחותי שלהם הוא ידוע27. מכיוון שעכברים הם מבחינת מניפולציה גנטית והמערכת מתאפיינת היטב במונחים של היווצרות מפה טופוגרפית אפשרויות חדשות להתעורר באמצעות פרוטוקול מבוסס הטרימסיס כדי ללמוד פיתוח עצבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (ERDF), באמצעות המרכז 2020 הפעילות האזורית במסגרת פרויקטים סנטרו-01-0145-פדר-000008: בריאות המוח 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-000003 פדר: עמוד, מרכז-01-0246-פדר-00018: MEDISIS, ודרך להתחרות 2020-תוכנית מבצעית לתחרותיות ובאינטראוליזציה ופורטוגזית כספים באמצעות FCT – Fundação באמצעות פרויקטים UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-פדר-022122: PPBI, לפטין/סאו-ניו/104100/2008, ומענקים בודדים SFRH/BD/141092/2018 (md), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) ועל ידי פעולות מארי קירי-IRG, תוכנית המסגרת השביעית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
  2. Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
  3. Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
  4. Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
  5. Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
  6. Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. 737-749 (1974).
  7. Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
  8. Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
  9. Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
  10. Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
  11. Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
  12. Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. 203-216 (1970).
  13. Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
  14. Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
  15. Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
  16. Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
  17. Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
  18. Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. 249-263 (1996).
  19. Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
  20. Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
  21. Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
  22. Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
  23. Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
  24. Squire, L. R. Encyclopedia of Neuroscience. (2010).
  25. Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
  26. Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. 409-418 (2016).
  27. Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).More

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter