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Neuroscience

Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons

doi: 10.3791/61431 Published: August 8, 2020
* These authors contributed equally

Summary

As gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático. Culturas neuronais de neurônios CG foram mostrados como modelos celulares eficazes no estudo das interações musculares nervosas. Descrevemos um protocolo detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios CG de embriões de filhotes.

Abstract

Os gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático e são responsáveis pela inervação dos tecidos musculares presentes no olho. Este gânglio é constituído por uma população homogênea de neurônios ciliares e coroidais que invato fibras musculares e lisas, respectivamente. Cada um desses tipos neuronais regulam estruturas e funções oculares específicas. Ao longo dos anos, as culturas neuronais do gânglio ciliar filhote mostraram-se modelos celulares eficazes no estudo das interações músculo-nervoso do sistema, que se comunicam por meio de sinapses colinérgicas. Os neurônios ciliares são, em sua maioria, colinérgicos. Este modelo celular tem se mostrado útil comparativamente aos modelos celulares heterogêneos anteriormente utilizados que compreendem vários tipos neuronais, além da colinérgica. Anatomicamente, o gânglio ciliar é localizado entre o nervo óptico (ON) e a fissura choroide (CF). Aqui, descrevemos um procedimento detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios gânglios ciliares de embriões de filhotes. Fornecemos um protocolo passo-a-passo para obter culturas celulares altamente puras e estáveis dos neurônios CG, destacando as principais etapas do processo. Essas culturas podem ser mantidas in vitro por 15 dias e, por meio deste, mostramos o desenvolvimento normal das culturas cg. Os resultados também mostram que esses neurônios podem interagir com fibras musculares através de sinapses colinérgicas neuromusmas.

Introduction

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Os neurônios de gânglio ciliar (CG) pertencem ao sistema nervoso parassimpático. Estes neurônios são colinérgicos, sendo capazes de estabelecer sinapses muscarínicos ou nicotínicas1,,2,3. Anatomicamente, o CG está localizado na parte posterior do olho entre o nervo óptico (ON) e a fissura coroóide (CF) e consiste em cerca de 6000 neurônios nos estágios embrionários iniciais1,,4. Para a primeira semana na cultura, os neurônios ciliares de gânglio apresentam uma morfologia multipolar. Após uma semana, eles começam a transição para um estado unipolar, com um neurite estendendo e formando o axônio5. Além disso, aproximadamente metade dos neurônios CG morrem entre os dias8 e 14th do desenvolvimento de embriões de filhotes, através de um processo programado de morte celular. Essa diminuição no número de neurônios resulta em uma população total do gânglio ciliar de cerca de 3000 neurônios6,7,8. In vitro, não há redução no número de neurônios CG quando cultivados com células musculares9 e neurônios CG podem ser cultivados por várias semanas1,9.

O gânglio ciliar consiste em uma população homogênea de neurônios ciliares e neurônios coroidais, cada um representando metade da população neuronal no CG, inervando o músculo do olho. Esses dois tipos de neurônios são estruturalmente, anatomicamente e funcionalmente distintos. Os neurônios ciliares inervam as fibras musculares estriadas na íris e na lente, sendo responsáveis pela contração da pupila. Os neurônios choroidais inervam o músculo liso do coroide1,10,11,12.

Culturas de neurônios gânglios ciliar de frango têm se mostrado ferramentas úteis para o estudo de sinapses neuromusculares e formação de sinapse1,,5,9. Considerando que as sinapses neuromusculares são colinérgicas13, utilizando uma população neuronal que é colinérgica – neurônios CG – emergiu como alternativa potencial aos modelos celulares anteriores14. Esses modelos consistiam em uma população neuronal heterogrógena, na qual apenas uma pequena parte é colinérgica. Alternativamente, os neurônios de gânglio ciliar desenvolvem-se in vitro relativamente rápido, e após aproximadamente 15 horas já formam sinapses1. Os neurônios CG têm sido usados como um sistema modelo ao longo dos anos para estudos de pesquisa distintos, devido à sua relativa facilidade de isolamento e manipulação. Essas aplicações incluem estudos optogenéticos, desenvolvimento de sinapse, apoptose e interações neuromusculares14,15.

Descrevemos um procedimento detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios gânglios ciliares a partir de embriões de filhotes embrionários do dia 7 (E7). Fornecemos um protocolo passo-a-passo para obter culturas celulares altamente puras e estáveis de neurônios colinérgicos. Destacamos também os principais passos do protocolo que requerem atenção especial e que melhorarão a qualidade das culturas neuronais. Essas culturas podem ser mantidas in vitro por pelo menos 15 dias.

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Protocol

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1. Preparação de reagentes

NOTA: Os materiais necessários para este procedimento são os seguintes: fórceps (nº 5 e nº 55), pinça cirúrgica, placas de Petri de dissecção (fundo preto), placas de 24 poços, pipeta pasteur plástica, pipeta Pasteur de vidro polido a fogo, seringa de 10 mL, filtro de seringa de 0,22 μm.

  1. Prepare e esterilize todo o material necessário para o protocolo, incluindo tampas de vidro, fórceps (nº 5 e nº 55), pinças cirúrgicas, placas de Petri (fundo preto), H2O destilada, pipetas e material para cirurgia.
  2. Prepare a solução de 0,1 mg/mL Poly-D-Lysine (PDL).
    1. Reconstituir pdl em tampão de 0,1 M de borate (pH 8.2) a uma concentração de 1 mg/mL (solução 10x).
    2. Diluir 1:10 em 166,6 mM tampão de borate (pH 8.2) para obter uma concentração final de 0,1 mg/mL.
  3. Prepare a solução de laminina de 10 μg/mL.
    1. Diluir 1 mg/mL laminina em meio neurobásal simples até uma concentração final de 10 μg/mL.
  4. Prepare a solução de sal balanceado da Hank (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4·2H2O, 5 mM de glicose, 1 mM piruvato de sódio, 10 mM hepes tampão, 0,001% vermelho fenol. Ajuste o pH para 7,2.
  5. Prepare 0,1% de solução de trippsina.
    1. Dissolver 5 mg de trippsina 1:250 em pó em 5 mL de HBSS para uma concentração final de 0,1%.
    2. Coloque em uma batedeira a 4 °C até dissolver completamente.
    3. Filtrar usando uma seringa de 10 mL e um filtro de seringa de 0,22 μm.
  6. Prepare o meio incompletociliar gânglio: meio neurobásico sem glutamina, 1X B27 (foto-sensível), 10% soro de cavalo inativado por calor, 2% FBS inativados por calor, 12,5 U/mL penicilina/estreptomicina (0,25x) e 2 mM de glutamina. Use reagentes estéreis e prepare o meio em condições estéreis.
  7. Preparar o meio completo de gânglio ciliar (complementado com fatores de crescimento): ao meio incompleto, adicione 5 ng/mL GDNF e 5 ng/mL CNTF.

2. Preparação de tampas de vidro para placas de 24 poços

  1. Coloque o número desejado de tampas de vidro dentro de um recipiente resistente ao ácido e adicione 65% de ácido nítrico até que todas as tampas estejam submersas. Coloque o recipiente em um agitador orbital e incuba durante a noite à temperatura ambiente (RT) a uma velocidade de 1000 rpm.
  2. No dia seguinte, transfira cuidadosamente o ácido nítrico para um pequeno reservatório e armazene para uso posterior. O ácido nítrico pode ser reutilizado 2-3x.
  3. Cuidadosamente, adicione H2O destilado às tampas para remover o ácido nítrico restante. Coloque em agitação por 30 minutos, descarte a solução de lavagem e repita este 5x.
  4. Enxágüe as tampas com 75% de etanol duas vezes.
  5. Separe cuidadosamente e coloque tampas individuais em um rack de metal coberto com papel alumínio e incubar a 50 ºC por 10-15 minutos ou até secar completamente.
    NOTA: Não autoclave tampas de vidro, pois elas grudarão umas nas outras.
  6. Esterilize as tampas sob luz UV por 10-15 minutos. Manter tampas estéreis para a cultura do tecido neuronal.

3. Revestimento de tampas de vidro para placas de 24 poços

  1. Usando uma pinça estéril, coloque uma mancha de cobertura em cada poço de uma placa de 24 poços.
  2. Adicione 500 μL de 0,1 mg/mL PDL e incubar durante a noite a 37 °C.
  3. No dia seguinte, enxágue as tampas duas vezes com H2O destilado estéril. Em seguida, adicione 500 μL de água destilada a cada deslizamento de cobertura e deixe por 30 minutos em temperatura ambiente.
  4. Descarte a água e adicione 350 μL de solução de laminina de 10 μg/mL em cada poço.
  5. Coloque em uma incubadora de 37 °C por 2 h.
  6. Antes do revestimento celular, remova a solução de laminina e lave duas vezes com meio neurobásal simples.
    NOTA: É importante que as tampas não sequem em nenhum momento.
  7. Adicione 300 μL de meio completo e deixe em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 até o tempo de chapeamento. Antes de emplacamento de células, remova este meio.

4. Cultura de gânglio ciliar do embrião de frango (dia 7 embrionário)

  1. Dissecção de gânglios ciliares (CG)
    1. Retire os ovos da incubadora e pulverize-os com 75% de etanol.
      NOTA: Os ovos são armazenados a ~16 °C antes de serem incubados a 37,7 °C durante 7 dias (ou o estágio embrionário desejado). Os ovos usados aqui são da espécie de frango Ross.
    2. Corte a parte superior do ovo com uma tesoura e retire o embrião usando uma colher. Coloque o embrião em uma placa de Petri com HBSS gelado e separe a cabeça do corpo cortando na região do pescoço.
      NOTA: Assim que o embrião é removido do óvulo, ele pode produzir proteases responsáveis pela morte celular. É importante separar rapidamente a cabeça do corpo uma vez que o embrião está fora da concha para minimizar a morte celular.
    3. Mantenha a cabeça do embrião em HBSS gelado.
    4. Segure a cabeça do embrião e fixe-a no bico do filhote com fórceps nº 5. Em seguida, com nº 55 fórceps, comece a remover a fina camada de pele ao redor do olho.
    5. Remova cuidadosamente o olho e gire-o para acessar a parte posterior. Ao separar o olho da cabeça do filhote, observe o nervo óptico sendo seccionado. Isso ajudará a localizar o gânglio ciliar.
    6. Uma vez que o olho esteja separado, mantenha-o com o lado posterior para cima e observe o gânglio ciliar adjacente ao nervo óptico seccionado e à fissura coroide. O nervo pré-brilhante ainda pode estar ligado ao gânglio ciliar, o que facilita sua identificação.
    7. Dissecar o gânglio ciliar de cada olho e limpar muito bem removendo o excesso de tecido ao redor de cada gânglio.
      NOTA: Para ter um rendimento de ~1x106 células/mL, dissecar ~70 CGs. Por favor, note que a população celular obtida contém células não-neuronais também. Para diminuir o número de células não neuronais e, consequentemente, aumentar a pureza da população neuronal, é muito importante limpar o gânglio ciliar o máximo possível, removendo todo o excesso de tecido.
  2. Dissociação e cultura de gânglios ciliares
    1. Colete todas as gânglios ciliares em um tubo de 15 mL usando uma pipeta pasteur de plástico estéril.
      NOTA: É importante pré-molhar a pipeta Pasteur para minimizar a fixação do gânglio na parede da pipeta.
    2. Centrifugar o gânglio ciliar por 2 minutos a 200 x g.
    3. Remova cuidadosamente todo o meio HBSS usando uma pipeta Pasteur e, em seguida, uma micropipette P1000. Adicione 1 mL de solução de trippsina de 0,1% e incubar por 20 minutos a 37 °C em banho-maria, sem agitação.
    4. Centrífuga por 2 minutos a 200 x g.
    5. Remova imediatamente a solução de trippsina e adicione 1 mL de meio incompleto.
      NOTA: O meio incompleto contém soro que interromperá imediatamente o efeito da trippsina.
    6. Centrifugar por 2 minutos a 200 x g e remover todo o meio.
    7. Adicione 350-500 μL de meio completo.
      NOTA: O volume necessário para dissociar as células depende do número de gânglios ciliares obtidos e, assim, do tamanho da pelota obtido. Para ~70 CG recomenda-se usar 500 μL de médio.
    8. Dissociar CGs por pipetar para cima e para baixo 10-15x primeiro usando um P1000 seguido por 10-15x usando uma pipeta Pasteur de vidro polido com fogo. Evite a formação de bolhas de ar para minimizar a perda celular.
      NOTA: Mantenha a suspensão do celular no gelo até chapeamento.
    9. Determine a densidade celular usando uma solução azul Trypan e uma câmara neubauer padrão.
    10. Placa 1 x 104 células/mL em cada poço da placa de 24 poços diluindo o volume apropriado de suspensão celular em 500 μL de meio completo (suplementado com 10 μM 5'-FDU).
    11. Incubar células em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.

5. Imunocytoquímica e análise de imagem de neurônios ciliares

  1. Realizar o ensaio de imunocitoquímica apresentado neste artigo como descrito anteriormente16,17.
  2. Use os seguintes anticorpos primários: tubulina monoclonal do rato (1:1000, T8578), neurofilamento monoclonal de frango M (1:1000, AB5735), SV2 monoclonal do rato (1:1000, AB2315387).
  3. Como anticorpos secundários, use o anticorpo anti-rato de cabra alexa Fluor 568 (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-conjugado anticorpo anti-frango de cabra (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-conjugado anticorpo anti-rato de cabra (1:1000, A21235).
  4. Montagem de tampas usando meio de montagem com DAPI, para coloração nuclear (P36935).

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Representative Results

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A duração estimada para este procedimento depende firmemente do rendimento necessário para cada experimento específico e, portanto, do número de gânglios ciliares que precisam ser isolados. Para um rendimento estimado de 1 x 106 células/mL, isole cerca de 70 gânglios ciliares (35 ovos). Para este número de gânglios, levará de 2 a 3 horas para o procedimento de dissecção e um total de 4-5 horas para o procedimento total. Uma ilustração passo a passo do protocolo de isolamento é mostrada na Figura 1A. A identificação do gânglio ciliar pode ser difícil, especialmente quando se realiza este protocolo pela primeira vez. O gânglio ciliar é localizado perto do nervo óptico e da fissura choroide(Figura 1B). As etapas-chave do procedimento de dissecção são mostradas na Figura 2. Primeiro, o embrião é removido do ovo e colocado em HBSS gelado. A cabeça é separada do corpo e, mais uma vez, colocada em HBSS gelado em uma placa de Petri dissecção(Figura 2A-2C). Em seguida, o olho é removido da cabeça do filhote e o gânglio ciliar é isolado(Figura 2D-2H).

As culturas obtidas com este protocolo são altamente puras. No entanto, limpar os gânglios e remover o excesso de tecido dita fortemente o sucesso e a pureza da cultura. As células se desenvolvem rapidamente e podem ser usadas já nos primeiros dias de cultura se o experimento geral exigir isso. No entanto, as culturas podem ser mantidas por 15 dias, ou mais. Se usar as culturas por mais de 7-8 dias, certifique-se de substituir um terço do meio de cultura por meio fresco a cada 2-3 dias. Após 1 dia in vitro, os neurônios CG mostram uma morfologia multipolar. No entanto, a extensão de neurite ocorre rapidamente, e uma rede neuronal primária já está estabelecida após 24 horas. Após 8 dias in vitro, os neurônios já transitaram para um estado unipolar, onde um dos neurites se estende e forma o axônio. A rede neuronal é muito densa nesta fase de desenvolvimento(Figura 3 e Figura 4).

Neurônios ciliares de gânglios são neurônios colinérgicos que pertencem ao sistema nervoso parassimpático. In vivo, esses neurônios são responsáveis pela inervação muscular no olho. Essas culturas neuronais são muito adequadas para o estudo de sinapses neuromusculares. Para isso, os neurônios CG podem ser banhados em cima de células musculares. O músculo peitoral do filhote foi dissecado e autorizado a desenvolver e amadurecer in vitro até DIV 4. Os neurônios CG foram então banhados em cima da camada muscular e a co-cultura permitiu desenvolver-se por mais 3 dias. Neste momento, as fibras musculares são formadas e podem ser facilmente identificadas pela presença de múltiplos núcleos (azul). A imunostenção de glicoproteína de vesícula sináptica 2A (SV2), um marcador pré-sináptico, mostra a presença de sinapses estabelecidas entre os axônios dos neurônios CG e as fibras musculares(Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Esquema do protocolo de dissecação e do gânglio ciliar. (A) Diagrama do protocolo de isolamento e cultura. (B) Esquema da localização do gânglio ciliar de filhotes na parte posterior do olho. Nervo óptico, gânglio ciliar e fissura coroóide são indicados por flechas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Dissecção do gânglio ciliário de pintinhos E7. (A) Corte a parte superior do ovo usando uma tesoura. (B) Retire o embrião do ovo com uma colher e coloque-o em uma placa de Petri dissecção com HBSS gelado. (C) Separe a cabeça do corpo cortando a região do pescoço. (D) Fixar a cabeça do embrião no bico, segurando com força nº 5. (E) Remova o olho por rotação suave usando o forcep nº 55. (F) Visão posterior do olho. Setas indicam a localização do nervo óptico, fissura coroide e gânglio ciliar. (G) Dissecar o gânglio ciliar. (H) Dissecado gânglio ciliário. O excesso de tecido deve ser removido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Desenvolvimento de neurônios de gânglios ciliares in vitro. Imagens de contraste de fase de neurônios CG em DIV 1, 3, 8 e 15. À medida que os neurônios CG são banhados, eles imediatamente iniciam o crescimento de neurite. Na DIV 15, a rede axonal é muito densa e nesta fase os neuritos são completamente diferenciados em dendritos e axônios. As imagens de contraste de fase foram adquiridas utilizando um microscópio confocal com um objetivo de 20x ph2 de plano-Apochromat. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imunocytoquímica de neurônios CG em DIV 8. Os neurônios CG mostram uma rede neuronal bem estabelecida após 8 dias in vitro. Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul) e os axônios estavam manchados com tubulina b-III (vermelho). Imagens de fluorescência foram adquiridas utilizando um microscópio confocal com um objetivo plan-Apochromat 20x. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Neurônios CG cultivados estabelecem sinapses com fibras musculares. Imagens imunocitoquímicas de co-culturas musculares cg neurônios-peitorais. As fibras musculares identificadas por linhas tracejadas apresentam múltiplos núcleos, que foram manchados com DAPI (azul). Axons foram rotulados contra neurofilamento (vermelho) e vesículas sinápticas foram rotuladas contra SV2 (ciano). As imagens foram adquiridas usando um microscópio confocal com um plano-Apochromat 63x de óleo objetivo. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Neste protocolo, demonstramos como preparar e cultivar neurônios CG. A identificação e dissecação do gânglio ciliar pode ser difícil para usuários não-experimentais. Por isso, apresentamos um procedimento detalhado e passo a passo para dissecar eficientemente o Gânglio ciliar do pintinho E7, dissociar o tecido e preparar culturas neuronais que podem ser mantidas por pelo menos 15 dias. Os neurônios gânglios ciliares obtidos com este protocolo também são adequados para a co-cultura com células musculares.

Gânglios ciliares em diferentes estágios de desenvolvimento do desenvolvimento embrionário de filhotes podem ser usados como modelo celular, dependendo da finalidade do estudo. No entanto, para culturas de neurônios CG, sugere-se que eles sejam isolados do embrião de filhotes entre os dias 7 e 818. No estágio embrionário E8, os neurônios CG ainda não sofreram processos de morte neuronal e o número de células não neuronais é reduzido comparativamente com as células neuronais18. Isso, em combinação com um rigoroso procedimento de dissecção e gânglios muito bem limpos, contribuirá para uma cultura altamente pura de neurônios gânglios ciliares, com pouca contaminação por células não neuronais, como fibroblastos ou células gliais.

Durante o isolamento dos neurônios CG, um dos pontos críticos é a identificação e a limpeza do CG. A dissecação de uma estrutura tão pequena, como o gânglio ciliar, pode ser difícil considerando a localização, a capacidade de identificar o gânglio, bem como o tamanho do próprio gânglio. É normal que os gânglios possam se anexar aos fórceps durante a dissecação. Instrumentos de dissecção de alta qualidade são muito importantes para uma dissecção bem sucedida e minimizarão a ligação dos gânglios aos fórceps. A limpeza do GC é importante para evitar a contaminação com células não neuronais. É necessário isolar aproximadamente 70 gânglios para obter uma densidade celular de ~1x106 células/mL, em contraste com outros tecidos neuronais do sistema nervoso periférico que têm um número 5-15x maior de gânglios3.

Na cultura, a adição de 5'-FDU ao meio completo diminui a contaminação da cultura GC com células não neuronais. 5'-FDU é um composto anti-mitótico que inibe a proliferação celular, ou seja, a proliferação de células gliais e fibroblastos. A concentração de 5'-FDU adicionada ao meio é suficiente para parar o ciclo celular na fase S, mas não é prejudicial ao desenvolvimento normal dos neurônios CG3,,19,,20. O tempo de tratamento com 5'-FDU pode ser ajustado. No entanto, uma vez que os neurônios CG estabelecem uma densa rede axonal em pouco tempo, 5'-FDU deve ser adicionado à cultura tão cedo quanto o tempo de chapeamento.

Uma das principais limitações desse modelo é que ele não é representativo do desenvolvimento normal dos neurônios CG em condições fisiológicas. No ovo, cerca de metade dos neurônios CG morrem entre os dias8 e 14 do desenvolvimento de embriões de filhotes. Na cultura, não há diminuição no número de neurônios CG quando o meio é suplementado com fatores neurotróficos que permitem sua sobrevivência1,,6,,14.

A população neuronal obtida a partir da dissecação do gânglio ciliar filhote é uma população homogênea de neurônios colinérgicos, pertencentes ao sistema nervoso autônomo. Deve-se notar que a expressão dos neurotransmissores na população coroide do CG é orientada para o alvo, o que pode ser dificultado dependendo do tipo de músculo utilizado na cocultura24. Se o objetivo do estudo está relacionado à identidade genética ou ao subtipo do próprio neurônio motor, então os neurônios CG podem não ser o modelo neuronal mais adequado. Além disso, a especificidade dos neurônios motores na inervação das fibras musculares pode não ser realizada ao utilizar co-culturas de neurônios CG, uma vez que, neste caso, as fibras musculares podem ser multiplicadas inervated25. No entanto, essa cultura neuronal tem várias vantagens, requer apenas equipamentos básicos para manter e incubar os ovos, é um procedimento razoavelmente barato e, mais importante, fornece um excelente modelo para o estudo das sinapses neuromusculares1,uma vez que os mecanismos de neurotransmissão dos neurônios CG são muito semelhantes aos que ocorrem nos neurônios motores espinhais. Os modelos celulares utilizados anteriormente para este tipo de estudo foram neurônios sensoriais da medulaespinhal 12,,21,22,23. No entanto, essas coculturas eram compostas por uma população heterogênea de neurônios, nem todas cholinergic e, assim, apenas uma pequena parte dos neurônios foi capaz de estabelecer contatos funcionais com as células musculares1. Além da análise de desenvolvimento (imunocitoquímica) demonstrada neste trabalho outros ensaios podem ser realizados em culturas de CG como eletrofisiologia e sobrevivência neuronal.

Com base neste protocolo podem ser abordadas questões científicas adicionais, por exemplo, como a localização subcelular de mRNAs e proteínas específicas regulam a formação e a função da sinapse. Além disso, as co-culturas músculos nervosos podem ser facilmente estabelecidas e mais utilizadas para estudar doenças neuromusculares quando o local da lesão é a junção neuromuscular. As doenças neuromusculares são heterogêneas na natureza no sentido de que a disfunção pode estar associada com o próprio músculo, os nervos periféricos ou as junções neuromusculares26. Assim, através dessas co-culturas seria possível estudar as alterações neuromusculares de junção que, em última análise, estão por trás do desenvolvimento e progressão das doenças neuromusculares. Outra possibilidade interessante seria adaptar este protocolo ao sistema trigêmeo do mouse. Esses neurônios são facilmente acessíveis, e seu padrão de desenvolvimento é bem conhecidocomo 27. Como os camundongos são favoráveis à manipulação genética e o sistema trigêmeo é bem caracterizado em termos de formação de mapas topográficos novas possibilidades surgem usando um protocolo de base trigeminal para estudar o desenvolvimento neuronal.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF), por meio do Programa Operacional Regional centro 2020, sob os projetos CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, e através do COMPETE 2020 - Programa Operacional de Competitividade e Internacionalização e Fundos Nacionais Portugueses via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., sob os projetos UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, e as bolsas individuais SFRH/BD/141092/22018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) e por Marie Curie Actions - IRG, 7º Programa-Quadro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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References

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Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons
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Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).More

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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