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Neuroscience

Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

doi: 10.3791/61431 Published: August 8, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.

Abstract

Los polluelos ciliares (CG) son parte del sistema nervioso parasimpático y son responsables de la inervación de los tejidos musculares presentes en el ojo. Este ganglio está constituido por una población homogénea de neuronas ciliares y coroidales que inergen fibras musculares estriadas y lisas, respectivamente. Cada uno de estos tipos neuronales regulan las estructuras y funciones oculares específicas. Con los años, las culturas neuronales de los polluelos ganglios ciliares se demostraron para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones del sistema músculo-nervioso, que se comunican a través de sinapsis colinérgicas. Las neuronas ganglionares ciliar son, en su mayoría, colinérgicas. Este modelo celular ha demostrado ser útil comparativamente a los modelos celulares heterogéneos utilizados anteriormente que comprenden varios tipos neuronales, además de colinérgicos. Anatómicamente, el ganglio ciliar se localiza entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF). Aquí, describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas ganglias ciliares de embriones de polluelos. Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas CG, destacando los pasos clave del proceso. Estas culturas se pueden mantener in vitro durante 15 días y, por la presente, mostramos el normal desarrollo de las culturas CG. Los resultados también muestran que estas neuronas pueden interactuar con las fibras musculares a través de sinapsis colinérgicas neuromusculares.

Introduction

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Las neuronas del ganglio ciliar (CG) pertenecen al sistema nervioso parasimpático. Estas neuronas son colinérgicas, pudiendo establecer sinapsis muscarnicas o nicotínicos1,2,3. Anatómicamente, el CG se encuentra en la parte posterior del ojo entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF) y consiste en alrededor de 6000 neuronas en las primeras etapas embrionarias1,4. Durante la primera semana en el cultivo, las neuronas ganglionares ciliares presentan una morfología multipolar. Después de una semana, comienzan a pasar a un estado unipolar, con un neurito extendiendo y formando el axón5. Además, aproximadamente la mitad de las neuronas CG mueren entre eldía 8 y 14 del desarrollo del embrión del polluelo, a través de un proceso programado de muerte celular. Esta disminución en el número de neuronas resulta en una población total del ganglio ciliar de alrededor de 3000 neuronas6,7,8. In vitro, no hay reducción en el número de neuronas CG cuando se cultiva con células musculares9 y las neuronas CG se pueden cultivar durante varias semanas1,,9.

El ganglio ciliar consiste en una población homogénea de neuronas ciliares y neuronas coroideas, cada una representando la mitad de la población neuronal en el CG, inervando el músculo del ojo. Estos dos tipos de neuronas son estructural, anatómica y funcionalmente distintas. Las neuronas ciliares inerben las fibras musculares estriadas en el iris y la lente, siendo responsables de la contracción de la pupila. Las neuronas coroideas inerben el músculo liso de la coroides1,10,11,12.

Se ha demostrado que los cultivos de neuronas ganglionares ciliares de pollo son herramientas útiles para el estudio de las sinapsis neuromusculares y la formación de sinapsis1,5,9. Teniendo en cuenta que las sinapsis neuromusculares son colinérgicas13, utilizando una población neuronal que es colinérgico – CG neuronas – surgió como una alternativa potencial a los modelos celulares anteriores14. Estos modelos consistían en una población neuronal heterogénea, en la que sólo una pequeña parte es colinérgico. Alternativamente, las neuronas ganglionares ciliar se desarrollan relativamente rápido invitro, y después de aproximadamente 15 horas ya forman sinapsis1. Las neuronas CG se han utilizado como un sistema modelo a lo largo de los años para estudios de investigación distintos, debido a su relativa facilidad de aislamiento y manipulación. Estas aplicaciones incluyen estudios optogenéticos, desarrollo de sinapsis, apoptosis e interacciones neuromusculares14,15.

Describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas gangliares ciliares de embriones de polluelos embrionarios día 7 (E7). Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas colinérgicas. También destacamos los pasos clave del protocolo que requieren una atención especial y que mejorarán la calidad de las culturas neuronales. Estos cultivos se pueden mantener in vitro durante al menos 15 días.

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Protocol

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1. Preparación de reactivos

NOTA: Los materiales necesarios para este procedimiento son los siguientes: fórceps (no 5 y no 55), pinzas quirúrgicas, disección de placas Petri (fondo negro), placas de 24 pocillos, pipeta de plástico Pasteur, pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego, jeringa de 10 ml, filtro de jeringa de 0,22 m.

  1. Preparar y esterilizar todo el material necesario para el protocolo, incluyendo cubreobjetos de vidrio, fórceps (no 5 y no 55), pinzas quirúrgicas, platos Petri (fondo negro), H2O destilado, pipetas y material para cirugía.
  2. Preparar 0,1 mg/ml de solución de poli-D-lisina (PDL).
    1. Reconstituir PDL en tampón de borato de 0,1 M (pH 8.2) a una concentración de 1 mg/ml (10x solución).
    2. Diluir 1:10 en tampón de borato de 166,6 mM (pH 8.2) para obtener una concentración final de 0,1 mg/ml.
  3. Preparar una solución de laminin de 10 g/ml.
    1. Diluir 1 mg/ml de laminin en medio neurobasal simple a una concentración final de 10 g/ml.
  4. Preparar la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS): KCl de 5,36 mM, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4x2H 2O, 5 mM de glucosa, 1 mM de piruvato sódico, 10 mM de tampón HEPES, 0,001% de fenol rojo. Ajuste el pH a 7.2.
  5. Preparar una solución de trippsina al 0,1%.
    1. Disolver 5 mg de trippsina 1:250 polvo en 5 ml de HBSS para una concentración final de 0,1%.
    2. Colocar en una mezcladora de rodillos a 4 oC hasta que se disuelva por completo.
    3. Filtrar con una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,22 m.
  6. Preparar ganglios ciliar medio incompleto:medio neurobasal sin glutamina, 1X B27 (fotosensible), 10% de suero de caballo termoactivado, 2% DE FBS inactivado por calor, 12,5 U/ml de penicilina/estreptomicina (0,25x) y 2 mM de glutamina. Utilice reactivos estériles y prepare el medio en condiciones estériles.
  7. Preparar ganglios ciliar medio completo (complementado con factores de crecimiento): al medio incompleto, añadir 5 ng/mL GDNF y 5 ng/mL CNTF.

2. Preparación de cubreobjetos de vidrio para placas de 24 pozos

  1. Coloque el número deseado de cubreobjetos de vidrio dentro de un recipiente resistente a los ácidos y agregue un 65% de ácido nítrico hasta que todos los cubreobjetos estén sumergidos. Coloque el recipiente en un agitador orbital e incubar durante la noche a temperatura ambiente (RT) a una velocidad de 1000 rpm.
  2. Al día siguiente, transfiera cuidadosamente el ácido nítrico a un pequeño depósito y guárdelo para su uso posterior. El ácido nítrico se puede volver a utilizar 2-3x.
  3. Con cuidado, agregue H2O destilado a los cubreobjetos para eliminar el ácido nítrico restante. Colocar en agitación durante 30 minutos, desechar la solución de lavado y repetir esta 5x.
  4. Enjuague los cubreobjetos con 75% de etanol dos veces.
  5. Separe cuidadosamente y coloque los cubreobjetos individuales en un estante metálico cubierto con papel de aluminio e incubar a 50 oC durante 10-15 minutos o hasta que esté completamente seco.
    NOTA: No se cubran los cubreobjetos de vidrio de autoclave, ya que se pegarán entre sí.
  6. Esterilice los cubreobjetos bajo la luz UV durante 10-15 minutos. Mantenga los cubreobjetos estériles para el cultivo del tejido neuronal.

3. Recubrimiento de cubreobjetos de vidrio para placas de 24 pozos

  1. Usando una pinza estéril, coloque un cubreobjetos en cada pozo de una placa de 24 pozos.
  2. Añadir 500 l de PDL de 0,1 mg/ml e incubar durante la noche a 37oC.
  3. Al día siguiente, enjuague los cubreobjetos dos veces con H2O destilado estéril. A continuación, agregue 500 l de agua destilada a cada cubrel y déjelo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Deseche el agua y añada 350 l de solución de laminin de 10 g/ml en cada pocópido.
  5. Colocar en una incubadora de 37oC durante 2 h.
  6. Antes del enchapado celular, retire la solución de laminin y lave dos veces con un medio neurobasal liso.
    NOTA: Es importante que los cubreobjetos no se sequen en ningún momento.
  7. Añadir 300 l de medio completo y dejar en una incubadora a 37oC y 5% de CO2 hasta el tiempo de enchapado. Antes de ensopar las células, retire este medio.

4. Cultivo de ganglios ciliarios a partir de embriones de pollo (día embrionario 7)

  1. Disección de ganglios ciliares (CG)
    1. Retire los huevos de la incubadora y rocíelos con 75% de etanol.
      NOTA: Los huevos se almacenan a 16 oC antes de ser incubados a 37,7 oC durante 7 días (o la etapa embrionaria deseada). Los huevos utilizados aquí son de especies de pollo Ross.
    2. Cortar la parte superior del huevo con una tijera y sacar el embrión usando una cuchara. Coloque el embrión en una placa de Petri con HBSS helado y separe la cabeza del cuerpo cortando en la región del cuello.
      NOTA: Tan pronto como el embrión se retira del óvulo, puede producir proteasas que son responsables de la muerte celular. Es importante separar rápidamente la cabeza del cuerpo una vez que el embrión está fuera de la cáscara para minimizar la muerte celular.
    3. Mantenga la cabeza del embrión en el HBSS helado.
    4. Sostenga la cabeza del embrión hacia arriba y fíjela en el pico del polluelo con no 5 fórceps. Luego, con no 55 fórceps, comienza a eliminar la fina capa de piel alrededor del ojo.
    5. Retire cuidadosamente el ojo y gírelo para acceder a la parte posterior. Al separar el ojo de la cabeza del polluelo, observe que el nervio óptico está siendo seccionado. Esto ayudará a localizar el ganglio ciliar.
    6. Una vez que el ojo esté separado, manténgalo con el lado posterior hacia arriba y observe el ganglio ciliar adyacente al nervio óptico seccionado y la fisura coroides. El nervio pregangliónico todavía podría estar unido al ganglio ciliar, lo que facilita su identificación.
    7. Disecciona el ganglio ciliar de cada ojo y limpiar muy bien mediante la eliminación del exceso de tejido alrededor de cada ganglio.
      NOTA: Para tener un rendimiento de 1x106 celdas/ml, disecciona 70 CG. Tenga en cuenta que la población celular obtenida también contiene células no neuronales. Para disminuir el número de células no neuronales y, en consecuencia, aumentar la pureza de la población neuronal, es muy importante limpiar los ganglios ciliar tanto como sea posible, eliminando todo el exceso de tejido.
  2. Disociación y cultura de ganglios ciliares
    1. Recoger todos los ganglios ciliares a un tubo de 15 ml utilizando una pipeta pasteur de plástico estéril.
      NOTA: Es importante pre-mojar la pipeta Pasteur para minimizar la fijación de los ganglios a la pared de la pipeta.
    2. Centrifugar los ganglios ciliares durante 2 minutos a 200 x g.
    3. Con cuidado, retire todo el medio HBSS con una pipeta Pasteur y luego una micropipeta P1000. Añadir 1 ml de solución de trippsina al 0,1% e incubar durante 20 minutos a 37oC en un baño de agua, sin agitación.
    4. Centrífuga durante 2 minutos a 200 x g.
    5. Retire inmediatamente la solución de tripsina y añada 1 ml de medio incompleto.
      NOTA: El medio incompleto contiene suero que detendrá inmediatamente el efecto de la trippsina.
    6. Centrifugar durante 2 minutos a 200 x g y retire todo el medio.
    7. Añadir 350-500 l de medio completo.
      NOTA: El volumen necesario para disociar las células depende del número de ganglios ciliares obtenidos y, por lo tanto, del tamaño del pellet obtenido. Para 70 CG se recomienda utilizar 500 l de medio.
    8. Disocia los GG pipeteando arriba y abajo 10-15x primero usando un P1000 seguido de 10-15x usando una pipeta de vidrio pulido por fuego Pasteur. Evite la formación de burbujas de aire para minimizar la pérdida celular.
      NOTA: Mantenga la suspensión celular sobre hielo hasta el enchapado.
    9. Determinar la densidad celular utilizando una solución azul Trypan y una cámara Neubauer estándar.
    10. Placa 1 x 104 células/ml en cada pocómo de la placa de 24 pocillos diluyendo el volumen adecuado de suspensión celular en 500 l de medio completo (complementado con 10 m 5'-FDU).
    11. Incubar células en una incubadora de 37oC, 5%co-2.

5. Inmunocitoquímica y análisis de imágenes de neuronas ciliares

  1. Realizar el ensayo de inmunocitoquímica presentado en este documento como se describió anteriormente16,17.
  2. Utilice los siguientes anticuerpos primarios: tubulina monoclonal b-III de ratón (1:1000, T8578), neurofilamento monoclonal de pollo M (1:1000, AB5735), SV2 monoclonal de ratón (1:1000, AB2315387).
  3. Como anticuerpos secundarios, utilice Alexa Fluor 568-conjugado anticuerpo anti-ratón cabra (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-conjugado anticuerpo anti-pollo cabra (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-conjugado goat anti-ratón anticuerpo (1:1000, A21235).
  4. Monte los cubreobjetos utilizando un medio de montaje con DAPI, para tinción nuclear (P36935).

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Representative Results

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La duración estimada de este procedimiento depende estrechamente del rendimiento necesario para cada experimento específico y, por lo tanto, del número de ganglios ciliares que deben aislarse. Para un rendimiento estimado de 1 x 106 células/ml, aísle alrededor de 70 ganglios ciliares (35 huevos). Para este número de ganglios, tomará 2-3 horas para el procedimiento de disección y un total de 4-5 horas para el procedimiento total. En la Figura 1Ase muestra una ilustración paso a paso del protocolo de aislamiento. La identificación del ganglio ciliar puede ser difícil, especialmente cuando se realiza este protocolo por primera vez. El ganglio ciliar está localizado cerca del nervio óptico y la fisura coroides (Figura 1B). Los pasos clave del procedimiento de disección se muestran en la Figura 2. En primer lugar, el embrión se extrae del óvulo y se coloca en el HBSS helado. La cabeza se separa del cuerpo y, una vez más, se coloca en HBSS helado en una disección Petri plato (Figura 2A-2C). Luego, el ojo se extrae de la cabeza del polluelo y el ganglio ciliar se aísla(Figura 2D-2H).

Las culturas obtenidas con este protocolo son altamente puras. Sin embargo, limpiar los ganglios y eliminar el exceso de tejido dicta fuertemente el éxito y la pureza del cultivo. Las células se desarrollan rápidamente y se pueden utilizar ya en los primeros días en el cultivo si el experimento general lo requiere. Sin embargo, las culturas se pueden mantener durante 15 días, o más. Si utiliza las culturas durante más de 7-8 días, asegúrese de reemplazar un tercio del medio de cultivo con un medio fresco cada 2-3 días. Después de 1 día in vitro, las neuronas CG muestran una morfología multipolar. Sin embargo, la extensión de la neurita ocurre rápidamente, y una red neuronal primaria ya está establecida después de 24 horas. Después de 8 días in vitro, las neuronas ya pasaron a un estado unipolar, donde una de las neuritas se extiende y forma el axón. La red neuronal es muy densa en esta etapa de desarrollo(Figura 3 y Figura 4).

Las neuronas ganglionares ciliar son neuronas colinérgicas que pertenecen al sistema nervioso parasimpático. In vivo, estas neuronas son responsables de la inervación muscular en el ojo. Estas culturas neuronales son muy adecuadas para el estudio de las sinapsis neuromusculares. Para ello, las neuronas CG se pueden placar en la parte superior de las células musculares. El músculo pectoral del polluelo fue diseccionado y se le permitió desarrollar y madurar in vitro hasta EL DIV 4. Las neuronas CG fueron entonces chapadas en la parte superior de la capa muscular y el co-cultivo permitió desarrollarse durante 3 días más. En este momento, las fibras musculares se forman y se pueden identificar fácilmente por la presencia de múltiples núcleos (azul). La inmunosuproteína de vesícula sináptica 2A (SV2), un marcador presináptico muestra la presencia de sinapsis que se establecen entre las neuronas CG axones y las fibras musculares (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Esquema del protocolo de disección y del ganglio ciliar. (A) Diagrama del protocolo de aislamiento y cultura. (B) Esquema de la localización del ganglio ciliar del polluelo en la parte posterior del ojo. El nervio óptico, el ganglio ciliar y la fisura coroides se indican mediante flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Disección del ganglio ciliar del polluelo E7. (A) Cortar la parte superior del huevo con tijeras. (B) Retire el embrión del óvulo con una cuchara y colóquelo en una disección de petri con HBSS helado. (C) Separe la cabeza del cuerpo cortando en la región del cuello. (D) Fijar la cabeza del embrión en el pico, sosteniendo con forcep no 5. (E) Retire el ojo mediante una rotación suave con forcep no 55. (F) Vista posterior del ojo. Las flechas indican la localización del nervio óptico, la fisura coroides y el ganglio ciliar. (G) Diseccionar el ganglio ciliar. (H) Ganglio ciliar diseccionado. Se debe extraer el exceso de tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Desarrollo in vitro de las neuronas ganglionares ciliar. Imágenes de contraste de fase de las neuronas CG en DIV 1, 3, 8 y 15. A medida que las neuronas CG están chapadas, inician inmediatamente el crecimiento de la neurita. En el DIV 15, la red axonal es muy densa y en esta etapa las neuritas se diferencian por completo en dendritas y axones. Las imágenes de contraste de fase se adquirieron utilizando un microscopio confocal con un objetivo plan-Apocromático 20x ph2. Barra de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Inmunocitoquímica de las neuronas CG en DIV 8. Las neuronas CG muestran una red neuronal bien establecida después de 8 días in vitro. Los núcleos estaban manchados con DAPI (azul) y los axones estaban manchados con tubulina b-III (rojo). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio confocal con un objetivo plan-Apocromático 20x. Barra de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Las neuronas C CG cultivadas establecen sinapsis con fibras musculares. Imágenes inmunocitoquímicas de las neuronas CG-co-cultivos musculares pectorales. Las fibras musculares identificadas por líneas discontinuas presentan múltiples núcleos, que fueron manchados con DAPI (azul). Los axones fueron etiquetados contra neurofilamento (rojo) y las vesículas sinápticas fueron etiquetadas contra SV2 (cian). Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio confocal con un objetivo de aceite plan-Apocromático 63x. Barra de escala: 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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En este protocolo, demostramos cómo preparar y cultivar las neuronas CG. La identificación y disección del ganglio ciliar puede ser difícil para los usuarios sin experiencia. Por lo tanto, presentamos un procedimiento detallado y paso a paso para diseccionar eficientemente los polluelos E7, disociar el tejido y preparar cultivos neuronales que se pueden mantener durante al menos 15 días. Las neuronas ganglionares ciliar obtenidas con este protocolo también son adecuadas para el cocultivo con células musculares.

Los ganglios ciliares en diferentes etapas de desarrollo del desarrollo embrionario de los polluelos se pueden utilizar como modelo celular, dependiendo del propósito del estudio. Sin embargo, para los cultivos de neuronas CG se sugiere que se aíslen del embrión de los polluelos entre los días embrionarios 7 y 818. En la etapa embrionaria E8, las neuronas CG aún no han sido sometidas a procesos de muerte neuronal y el número de células no neuronales se reduce comparativamente con las células neuronales18. Esto, en combinación con un riguroso procedimiento de disección y ganglios muy bien limpiados, contribuirá a un cultivo muy puro de neuronas ganglionares ciliares, con poca contaminación por células no neuronales, como fibroblastos o células gliales.

Durante el aislamiento de las neuronas CG, uno de los puntos críticos es la identificación y la limpieza del CG. La disección de una estructura tan pequeña, como el ganglio ciliar, puede ser difícil teniendo en cuenta la localización, la capacidad de identificar el ganglio, así como el tamaño del ganglio en sí. Es normal que los ganglios se adhieran a los fórceps durante la disección. Los instrumentos de disección de alta calidad son muy importantes para una disección exitosa y minimizarán la fijación de los ganglios a los fórceps. La limpieza del GC es importante para evitar la contaminación con células no neuronales. Es necesario aislar aproximadamente 70 ganglios para obtener una densidad celular de 1x106 células/ml, en contraste con otros tejidos neuronales del sistema nervioso periférico que tienen un 5-15 veces mayor número de ganglios3.

En el cultivo, la adición de 5'-FDU al medio completo disminuye la contaminación del cultivo de GC con células no neuronales. 5'-FDU es un compuesto antimitético que inhibe la proliferación celular, a saber, la proliferación de células gliales y fibroblastos. La concentración de 5'-FDU añadido al medio es suficiente para detener el ciclo celular en la fase S, pero no es perjudicial para el desarrollo normal de las neuronas CG3,19,20. El tiempo de tratamiento con 5'-FDU se puede ajustar. Sin embargo, dado que las neuronas CG establecen una densa red axonal en poco tiempo, 5'-FDU debe añadirse al cultivo ya en el momento del enchapado.

Una de las principales limitaciones de este modelo es que no es representativo del desarrollo normal de las neuronas CG en condiciones fisiológicas. En ovo, aproximadamente la mitad de las neuronas CG mueren entre eldía 8 y 14 del desarrollo del embrión del polluelo. En el cultivo, no hay disminución en el número de neuronas CG cuando el medio se complementa con factores neurotróficos que permiten su supervivencia1,,6,,14.

La población neuronal obtenida de la disección del ganglio ciliar del polluelo es una población homogénea de neuronas colinérgicas, pertenecientes al sistema nervioso autónomo. Cabe señalar que la expresión de neurotransmisores en la población coroides del CG es dirigida por el objetivo, que podría verse obstaculizada dependiendo del tipo de músculo utilizado en el cocultorio24. Si el objetivo del estudio está relacionado con la identidad genética o sub-tipo de la neurona motora en sí, entonces las neuronas CG podrían no ser el mejor modelo neuronal adecuado. Además, la especificidad de las neuronas motoras en la inervación de las fibras musculares puede no lograrse cuando se utilizan co-cultivos de neuronas CG ya que, en este caso, las fibras musculares pueden ser multivavadas25. Sin embargo, este cultivo neuronal tiene varias ventajas, sólo requiere equipo básico para mantener e incubar los huevos, es un procedimiento razonablemente barato y, lo que es más importante, proporciona un excelente modelo para el estudio de las sinapsis neuromusculares1,ya que los mecanismos de neurotransmisión de las neuronas CG son muy similares a los que se producen en las neuronas del motor espinal. Los modelos celulares utilizados anteriormente para este tipo de estudios fueron neuronas sensoriales de la médula espinal12,21,22,23. Sin embargo, estos co-cultivos estaban compuestos por una población heterogénea de neuronas, no todas colinérgicas y, por lo tanto, sólo una pequeña parte de las neuronas fueron capaces de establecer contactos funcionales con las células musculares1. Además del análisis del desarrollo (inmunocitoquímica) demostrado en este trabajo otros ensayos se pueden realizar en cultivos de CG como la electrofisiología y la supervivencia neuronal.

Sobre la base de este protocolo se pueden abordar cuestiones científicas adicionales, por ejemplo, cómo la localización subcelular de los mRNas y proteínas específicos regulan la formación y función de la sinapsis. Por otra parte, los co-cultivos músculo nervioso se pueden establecer fácilmente y se utilizan para estudiar enfermedades neuromusculares cuando el sitio de la lesión es la unión neuromuscular. Las enfermedades neuromusculares son heterogéneas en la naturaleza en el sentido de que la disfunción podría estar asociada con el propio músculo, los nervios periféricos o las uniones neuromusculares26. Así, a través de estas coculturas sería posible estudiar las alteraciones neuromusculares de la unión que en última instancia subyacen al desarrollo y progresión de las enfermedades neuromusculares. Otra posibilidad interesante sería adaptar este protocolo al sistema trigémino del ratón. Estas neuronas son fácilmente accesibles, y su patrón de desarrollo es bien conocido27. Debido a que los ratones son susceptibles a la manipulación genética y el sistema trigémino se caracteriza bien en términos de formación de mapas topográficos, surgen nuevas posibilidades mediante el uso de un protocolo basado en trigémino para estudiar el desarrollo neuronal.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), a través del Programa Operativo Regional Centro 2020 en el marco de los proyectos CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, y a través del PROGRAMA OPERACION 2020 - Programa Operativo para la Competitividad e Internacionalización y fondos nacionales portugueses a través de FCT – Fundación para una Ciudad Europea, I.P., en el marco de los proyectos UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, y las subvenciones individuales SFRH/BD/141092/12018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) y por Marie Curie Actions - IRG, 7th Framework Programme.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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References

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Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons
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Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).More

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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