Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

قرب متزامنة ليزر المسح Confocal والقوة الذرية المجهرية (Conpokal) على الخلايا الحية

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

هنا هو بروتوكول تقنية Conpokal ، الذي يجمع بين المجهر confocal والقوة الذرية في منصة صك واحد. يوفر Conpokal نفس الخلية ، نفس المنطقة ، بالقرب من التصوير confocal في وقت واحد والتوصيف الميكانيكي للعينات البيولوجية الحية.

Abstract

وقد انفجرت التقنيات المتاحة للتوصيف الميكانيكي على نطاقات صغيرة ونانو في العقود القليلة الماضية. من زيادة تطوير المجهر الإلكتروني المسح ونقل، لاختراع المجهر القوة الذرية، والتقدم في التصوير الفلورسنت، كانت هناك مكاسب كبيرة في التكنولوجيات التي تمكن من دراسة المواد الصغيرة. Conpokal هو portmanteau الذي يجمع بين المجهر confocal مع مجهر القوة الذرية (AFM) ، حيث المسبار "كزة" السطح. على الرغم من أن كل تقنية فعالة للغاية لجمع الصور النوعية و / أو الكمية من تلقاء نفسها، يوفر Conpokal القدرة على اختبار مع التصوير المفلور المخلوطة والتوصيف الميكانيكي. مصممة للتصوير confocal في وقت واحد تقريبا والقوة الذرية التحقيق، Conpokal يسهل التجريب على عينات الميكروبيولوجية الحية. توفر البصيرة المضافة من الأجهزة المقترنة توطينًا مشتركًا للخصائص الميكانيكية المقاسة(على سبيل المثال، معامل مرن ، التصاق ، خشونة السطح) من قبل AFM مع مكونات تحت الخلية أو نشاط يمكن ملاحظته من خلال المجهر confocal. يوفر هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتشغيل التصوير المجهري بالليزر والمجهرية للقوة الذرية ، في وقت واحد ، لتحقيق نفس الخلية ، ونفس المنطقة ، والتصوير confocal ، والتوصيف الميكانيكي.

Introduction

وكثيرا ما تستخدم أدوات التقييم الميكانيكية على نطاق صغير أو نانو للكشف عن خصائص تشوه على مستوى خلية واحدة أو الكائنات الدقيقة، في حين تستخدم أدوات منفصلة المجهرية عالية الدقة لتصور العمليات دون الخلوية والميزات الهيكلية. Conpokal، هو مزيج من المجهر المجهر المسح الضوئي بالليزر والمجهر القوة الذرية (AFM) في منصة مفيدة واحدة. تم تنفيذ تقنية Conpokal لأول مرة في نظام البوليمر غير البيولوجي ، حيث كان الهدف هو تحديد الالتصاق ، والمرونة ، والتوتر السطحي للأسطح الصلبة في ملامسة الأسطح الناعمة. قدمت الصور Confocal تقديم البصرية لكيفية تشوه البوليمر ، ويتمسك ، والإفراج عن مسبارالثابت 1،2. من البوليمرات إلى العينات البيولوجية ، توفر هذه التقنية الفرصة للتصوير شبه المباشر للخلايا الحية أو الكائنات الحية الدقيقة والتصوير confocal AFM.

وقد تورطت التغيرات في مرونة الخلية في التسبب في العديد من الأمراض البشرية3 بما في ذلك اضطرابات الأوعية الدموية4الملاريا5,6، فقر الدم المنجلي7التهاب المفاصل8الربو9، والسرطان6,10,11,12,13,14,15. وتشمل التقنيات الشائعة لقياس ميكانيكا الخلايا استخدام الخرز المغناطيسي16,17، ملاقط بصرية18,19، التطلع إلى ميكرويبيت8,20,21,22، و AFM11,23,24,25,26. منذ تطبيق AFM على الخلايا الحية ، فقد تم تكييفها بسهولة لتوصيف تضاريس الخلايا27,28 فضلا عن الخصائص الميكانيكية11,24,29,30,31 مع دقة النانو. وقد تم تكييف AFM أكثر لmicrorheology32,33، تعديل التردد34,35، وزحف25,36,37 تجارب لدراسة خصائص اللزوجة من خطوط الخلايا المختلفة. إن استخدام نموذج دقيق مناسب أمر بالغ الأهمية لاستخراج قيم المرونة الكمية من قياسات المسافة البادئة للقوة المنتجة من قبل AFM1,2. وقد أظهرت الدراسات AFM التي تحقق تأثير الأدوية الخلوية على مرونة الخلية أن يكون معامل مرن تتأثر بشدة38. استنادا إلى قياسات معامل مرن، وقد أظهرت العديد من الباحثين أن الخلايا السرطانية هي أكثر ليونة من نظيراتها غير المحولة11,38,39. زيادة تشوه من المرجح أن يلعب دورا بارزا في قدرة الخلايا السرطانية على الانبثاث والتسلل إلى الأنسجة40. وينظم هذا السلوك من خلال تعديلات في تنظيم الخلايا الخلايا38,41,42. بالإضافة إلى السرطان، هناك فئة أخرى من الأمراض التي تعتمد على الميكانيكا هي أمراض الجهاز التنفسي. على سبيل المثال، تؤثر متلازمة الإجهاد التنفسي الحاد على المزيد والمزيد من البشر كل عام. وقد ثبت أنه عندما يتم وضع المرضى على التهوية الميكانيكية، مع تركيزات عالية من الأوكسجين، يمكن أن تسوء حالتهم43. في سلسلة من الدراسات التي رصدت الضامة الظهارية السنخية مع AFM ، وجد العلماء أن إضافة بيئة غنية بالأكسجين زادت من صلابة الخلايا بسبب تكوين الأكتئة. مثال رئيسي على التأثير الذي يحدثه الاتحاد على فهمنا التفصيلي للتأثير البيئي في الغلاف الجوي على وظيفة الجهاز التنفسي على المستوى الخلوي، وفي نهاية المطاف، الشفاء والصحة البشرية44,45,46. يمكن أيضًا تقييم تصلب الخلايا الظهارية أثناء الهجرة نحو الجرح عن طريق AFM وأن الاختلاف في المعامل المرن يحدث للإشارة إلى انتشار الخلايا في المستقبل47,48. لذلك، هناك حاجة عملية لقياس ميكانيكا الخلايا كميا لفهم كيفية الخلايا المريضة تختلف عن، والتفاعل مع، منها صحية.

كما يستخدم AFM لدراسة خصائص لاصقة وهيكل السطح. مجهر القوة الذرية لديه مجموعة متنوعة من وسائط لجمع المعلومات حول عينة باستخدام ميكانيكا الاتصال. بالنسبة للعينات البيولوجية الحية، اثنين من الأهداف الرئيسية هي الحصول على قيم كمية الملكية الميكانيكية(على سبيل المثال،مودولي مرنة، قوات لاصقة) وكذلك ارتفاع سطح الخريطة. وتشمل هذه الأوضاع وضع التنصت (المعروف أيضا باسم الاتصال المتقطع)، الذي يحافظ على السعة cantilever ثابت الاتصال بشكل متقطع سطح العينة ووضع الاتصال، الذي يثير أو يخفض cantilever للحفاظ على انحراف ثابت49. يمكن جمع خرائط التصاق باستخدام رسم خرائط القوة على نظام AFM. الـ cantilever المسافات البادئة العينة إلى قوة معينة ثم يتم سحبها. يتم قياس القوة التي تقاوم التراجع بواسطة الكاشف لتوليد رسم بياني لتشريد القوة. قوة الالتصاق هي أقصى قوة تقاس أثناء التراجع. يوفر مورفولوجيا السطح عرضًا تفصيليًا للعينة على المستوى الصغير أو النانو. يكمل الـ cantilever مسحًا ضوئيًا عبر العينة استنادًا إلى المسافة البادئة والانحراف الذي تم التقاطه بحركة الـ cantilever عند كل بكسل ، مما يكشف عن ميزات صغيرة ونانوية الحجم. مع AFM، وحجم الميزات الصغيرة مثل هيكل peptidoglycan50، البوليمر محاذاة سلسلة51، flagella52، lamellipodia53، و filipodia54 يمكن قياسها. في حين أن قوة AFM تكمن في منحنيات القوة الإزاحة والصور الطوبولوجية غير البصرية ، فإن المجهر confocal يقدم تصويرًا تفصيليًا للعينات ذات العلامات الفلورية.

المجهر المسح الضوئي بالليزر Confocal (CLSM) هو تقنية مهيمنة لتصوير الخلايا الحية، والخلايا الثابتة، والأنسجة55،56،57. وقد تم استخدام CLSM للتصوير البيولوجي منذ عام 1955 أي، منذإنشائها 58،59. في حين أن مبدأ العمل من المجاهر confocal(أي، ورفض من الضوء من التركيز من خلال ثقب) ظلت إلى حد كبير على حالها ، وتنفيذ التقنية أصبحت متنوعة جدا56،57،58،60. يمكن تنفيذ التصوير Confocal عن طريق المسح الضوئي متعددة النقاط، كما هو الحال في نظام القرص الغزل61، نقطة المسح الضوئي لشعاع ليزر واحد، كما هو الحال في خط المسح62، أو تصوير وظيفة انتشار نقطة مع إعادة انتداب بكسل اللاحقة عبر كاشف متعدد العناصر57. التطورات الأخيرة التي توسع فائدة التصوير confocal تشمل القدرة على المسح الضوئي بالليزر، وارتفاع سرعة المسح بالرنين الضوئي، وأجهزة الكشف عن حساسية عالية63،64،65. ميزة أن جميع أنظمة confocal على المجاهر widefield هو القدرة على تنفيذ المقطع البصري في محور z مع مزيد من التفاصيل، وخاصة في العينات سميكة. وتقوم المجاهر العريضة باستخدام الكشف القائم على الكاميرا بجمع الضوء المنبعث من الطائرة المحورية، وفي نفس الوقت، الضوء المنبعث من كل مكان في مسار الإضاءة. عن طريق إغلاق الثقب، على حساب الحد من الإشارة، يمكن زيادة كل من محوري ودقة جانبية66. في CLSM، يتم بناء الصور بكسل بكسل من خلال جمع إشارة الانبعاثات كما يتم مسح ليزر الإثارة عبر حقل عرض س ص. ويمكن بعد ذلك جمع عدة طائرات س ص على طول محور z من العينة يمكن استخدامها لإعادة بناء 3-الأبعاد هندسة العينة57،67. كونفوكال مجهرية بالتزامن مع إدخال البروتينات الفلورية، وقد أحدثت ثورة فهمنا لعلم الأحياء الخلية68. على سبيل المثال، فقد أصبح أداة أساسية في علم الأعصاب69. ويستخدم CLSM بانتظام لمراقبة الأنسجة واضحة، والحصول على صور شاملة من الدماغ الملطخة المناعية والهندسة العصبية شبكة70. وقد أدى هذا التطبيق في رؤى جديدة في الاتصالات متشابك والتواصل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ71. من خلايا الدماغ إلى الفُيْسَيْس، تدعم بروتوكولات تلطيخ الفلورسنت التفتيش والتقاط وظائف الخلايا عن طريق المجهر الناتقني للتقدّم في التقنيات العلاجية72،73.

على الرغم من أنها أدوات مثيرة للإعجاب وتنوعا على حدة، والجمع بين المجهر confocal والقوة الذرية (Conpokal) يسمح للباحثين لربط فريد الطوبوغرافية وميكولوجيا الخلوية / خصائص الأنسجة مع مراقبة organelles الخلوية المختلفة وديناميكيتها كل منها. الأجهزة المقترنة تسمح للمستخدمين ، أساسا ، "رؤية" ما هي التحقيق ؛ ميزة كبيرة على تقنية واحدة من تلقاء نفسها. مع Conpokal، يتم تراكب رسم خرائط القوة من خلال AFM على الصور confocal لربط صلابة الخلايا، التصاق، أو مورفولوجيا إلى هيكل الهيكل العظمي للخلايا داخل العينة، على سبيل المثال. الهدف العام لأسلوب Conpokal هو توفير منصة للباحثين لدراسة العينات الحية بطريقة موجزة وفعالة ، وتوفير كل من البيانات المتعلقة بالممتلكات المادية والصورة في منصة واحدة. في هذا العمل، نبرهن على تشغيل Conpokal بما في ذلك اختيار العينة المناسبة وإعدادها وإعداد الأداة ومعايرة النتليفر وتوفير إرشادات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها بنجاح. بعد البروتوكول ، نقدم نتائج تمثيلية تشمل البكتيريا الناجحة والخلية رسم خرائط ارتفاع AFM ، والبكتيريا والخلية AFM معامل رسم الخرائط ، والتصوير confocal من الخلايا متعددة التسميات ، من خلال نفس الخلية confocal و AFM. نختم بمناقشة الإجراء Conpokal الخطوات الهامة، والتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والقيود التقنية، وأهمية، والتوقعات المستقبلية للأسلوب.

Protocol

1. إعداد الأدوات ووسائل الإعلام الثقافية والأطباق

  1. قم بتشغيل مصادر الطاقة لكل من المجهر confocal ومجهر القوة الذرية، وكذلك أي أدوات أو أجهزة أخرى مرتبطة بها تستخدم أثناء كونبوكال. السماح بما يكفي من الوقت للأدوات لتكبيل حراري واستقرار قبل بدء القياسات. عادة، 1 ساعة كافية.
  2. إعداد واحد نظيفة، وافق النظام، طبق بيتري الزجاج القاع وملء نصف كامل، ولكن لا يزيد عن ثلثي كامل، مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS)، أو السائل واضحة مماثلة. هذا الطبق (المشار إليه باسم "طبق المعايرة") منفصل عن أطباق العينة وسيتم استخدامه لتحديد ومعايرة مجهر القوة الذرية (AFM) cantilever.
    ملاحظة: من المهم أن يكون السائل واضحًا ولديه نقص في الفلوروس لمنع أي تداخل مع أطياف الفلورسنس. ينصح برنامج تلفزيوني لأنه يحاكي البيئة البيولوجية.
  3. إعداد أطباق عينة تجريبية بحيث تملأ السائل المرتبطة طبق ما لا يقل عن نصف كامل. إذا كانت العينة الفلورسنت، تأكد من تغطيتها أو في مكان مظلم حتى الحاجة. تنظيف الجزء السفلي من جميع الأطباق الزجاجية باستخدام نظافة العدسة ومناديل العدسة.
  4. إنشاء مجلدات تخزين البيانات ل confocal و AFM على الكمبيوتر (ق) القرص الصلب( ق).

2. اختيار الخلايا أو الكائنات الحية الدقيقة

  1. لإنشاء محلول مخزون البكتيريا، تلقيح المكورات العقدية التكرار البكتيريا، وذلك باستخدام حلقة تلقيح، في 15 مل من تود هيويت الخميرة (THY) بين عشية وضحاها (للمرحلة الأسية) في 5٪ CO2 حاضنة.
  2. 1 ساعة قبل اكتمال الحضانة بين عشية وضحاها، معطف أطباق عينة تجريبية مع 1 مل من حل بولي ل-ليسين أو ما يكفي لتغطية الجزء الزجاجي من الطبق الزجاجي القاع وترك في مجلس الوزراء السلامة الحيوية لمدة 1 ساعة. بعد وضع، وسبيرات بولي ل-ليسين الحل وشطف الأطباق 3x مع برنامج تلفزيوني.
  3. بعد 18 - 24 ساعة من الحضانة البكتيرية، تلقيح THY مع 1 مل من التعليق البكتيري حتى يتم تحقيق كثافة بصرية من 0.6 – 0.7 (القيم النموذجية لللقح هي 3 مل من THY مع 1 مل من التعليق البكتيري لكل طبق). إضافة 1 مل من حل البكتيريا الجديدة لكل طبق بولي-ل-ليسين المغلفة واحتضان لمدة 1 ساعة. خلال آخر 10 دقيقة، إضافة 1 مل من غشاء الفلورسنت الأخضر وصمة عار (تركيز 1 μM) إلى كل طبق.
  4. شطف كل طبق 3x مع برنامج تلفزيوني. إصلاح بلطف البكتيريا مع حوالي 1 مل من 4٪ محلول شبهformaldehyde لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. شطف كل طبق 3x مع برنامج تلفزيوني بعد التثبيت.
  5. تخزين الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293 الخلايا في النيتروجين السائل. أداء ذوبان سريع في 37 درجة مئوية حمام الماء قبل الطلاء.
  6. إضافة 1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي حل في وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى كل طبق عينة الخلية واحتضان (5٪ CO2) في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استلهم الحل وغسل الأطباق مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية. لوحة العدد المطلوب من خلايا HEK 293(على سبيل المثال،100،000 خلية لكل طبق 35 ملم) وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. ثم، احتضان (5٪ CO2) الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  7. بعد 48 ساعة، إضافة 2 ميكرولتر من صبغة الخلايا الفلورية ميكروتوبول (تركيز 1x) لكل طبق عينة الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة. التعرق الحل الذي يحتوي على الصبغة، وغسل الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
  8. إضافة 1 ميكرولتر من صبغة غشاء البلازما (تركيز 10 μM) إلى أطباق العينة واحتضان لمدة 30 دقيقة. غسل الحل الذي يحتوي على صبغ 3x مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
  9. Counterstain النواة عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من صبغة حمض نووي (تركيز 10 μM) حل لأطباق العينة واحتضان لمدة 30 دقيقة. غسل الحل الذي يحتوي على صبغة 3x مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة.

3. إجراء AFM

  1. فتح مجهر القوة الذرية (AFM) برنامج التشغيل عن طريق النقر على رمز البرنامج على الكمبيوتر.
  2. قم بتدوير هدف هواء منخفض التكبير أو إدراجه (10x أو 20x). إن مسافة العمل الطويلة التي تُعد 5 مم أو أكثر مفيدة أثناء خفض التلميح والمعايرة.
  3. قم بتحميل مرحلة نموذج الخلية المختارة إذا لم تكن مثبتة بالفعل. للحصول على عينات حية، استخدم سخان طبق للحفاظ على العينة في درجة الحرارة المطلوبة.
  4. تحميل نظيفة، والنظام وافق طبق بيتري شغل نصف كامل من برنامج تلفزيوني (أعدت في الخطوة 1.2) أو السائل واضحة مماثلة (طبق المعايرة). إذا كانت مرحلة العينة قد المدمج في المشابك، واستخدام هذه، وإلا، واستخدام الشحوم فراغ لتحقيق الاستقرار في العينة.
  5. حدد afm cantilever المناسبة لجمع البيانات المطلوبة وتثبيته باتباع الخطوات التالية.
    1. باستخدام القفازات، قم بتركيب شريحة AFM في الكتلة الزجاجية باستخدام مرحلة التركيب رقاقة AFM، ملاقط، ومفك صغير. ضع رقاقة AFM بعناية على الكتلة الزجاجية واوجهها بحيث تتركز. وينبغي أن تكون كانتليفر، بالإضافة إلى جزء صغير جدا من رقاقة AFM، في الجزء المرئي وغير المبهم من كتلة تصاعد.
    2. تأمين رقاقة مع مفك البراغي عن طريق تشديد المسمار حتى رقاقة دافئ ضد كتلة الزجاج. تحقق من أن AFM cantilever موجهة بشكل صحيح باستخدام مجهر ستيريو أو تجسس محمول باليد. ضبط حسب الحاجة. مرة واحدة موجهة بشكل صحيح، ووضع كتلة الزجاج في رأس AFM في الاتجاه السليم وقفل في مكان.
      ملاحظة: إن اتجاه شريحة AFM داخل الكتلة الزجاجية مهم بحيث تهدف ليزر النظام إلى الجانب الخلفي من الـ cantilever وتعكس على المُنَفَف الضوئي بشكل صحيح. يجب الحرص على عدم الإفراط في مسامير أثناء وضع هذا الإجراء قد يسبب رقاقة AFM، cantilever، أو تلميح لكسر.
  6. باستخدام خيار brightfield من المجهر confocal، حدد الجزء السفلي من طبق المعايرة باستخدام مقبض التركيز. يحيط علما بهذا الارتفاع z كقيمة حيث يقع الجزء السفلي من الطبق فيما يتعلق الهدف المجهر.
  7. باستخدام لوحة التحكم في المحركات نظام AFM على الكمبيوتر الذي يشغل محركات السائر z، نقل afm cantilever بعيدا عن العينة صعودا 2000 μm.
  8. باستخدام كلتا اليدين، ضع بلطف رأس AFM مع شريحة AFM على مرحلة العينة مع التأكد من أن كل نقطة من النقاط الرأسية على رأس AFM يتم تعيينها بقوة في الأخاخي المعينة على مرحلة AFM. بمجرد أن يكون رأس AFM في مكانه ، نرى بصريًا مدى قرب حامل الـ cantilever من الطبق. إذا كان يبدو أن تكون قريبة جدا، بحيث رئيس AFM هو في اتصال أو داخل 1 ملم من الجزء العلوي من طبق العينة، والعودة إلى ذلك باستخدام محركات السائر Z قبل خفض طرف AFM نحو العينة.
  9. باستخدام الإضاءة brightfield، ببطء خفض رقاقة AFM إلى الجزء السفلي من الطبق الزجاجي باستخدام لوحة التحكم المحرك z stepper على برنامج AFM. حدد موقع ميكرومترات يدوية التي تتحكم في حركة س ص أو في الطائرة من رئيس AFM على منصة الصك. ضبط موقف كانتليف AFM ضمن مجال الرؤية من خلال تصحيح رأس AFM كما تأتي cantilever في العرض.
    1. منذ الموقع فيما يتعلق الجزء السفلي من الطبق غير معروف في هذا الوقت، أقل مع خطوات من 100 – 200 μm لتجنب تحطمها تلميح AFM في طبق بيتري. عادة، يجب خفض التلميح 800 - 2000 ميكرومتر. كما يتم تخفيض الطرف، ومشاهدة للظل لتظهر على عرض برنامج المجهر، مما يشير إلى تلميح AFM هو الاقتراب من الجزء السفلي من الطبق.
    2. خفض الزيادات إلى 20 - 50 ميكرومتر. تأكد من ضبط الجداول البحث عن (LUTs) من صورة الكاميرا كما يقلل من تلميح في الطبق باستخدام لوحة LUTs على برنامج confocal. استمر في خفض رأس AFM باستخدام خطوات صغيرة حتى يكون في الغالب في التركيز.
    3. تأكد من أن الطرف هو الظلام بما فيه الكفاية بحيث يمكن رؤية الشكل العام لها وتمركزها في مجال الرؤية. تأكد أيضًا من أن الطرف يبدو ضبابيًا ، مما يؤكد أنه لم يواجه الجزء السفلي من الطبق ، حتى الآن.
  10. ضبط التركيز المجهر بحيث تلميح هو الآن في التركيز، مع الأخذ في الاعتبار المسافة العمل من الهدف. قبل الانتقال إلى هدف التكبير أعلى، استخدم أداة قياس المجهر لجمع عرض وطول الـ AFM cantilever من خلال الوصول إلى لوحة أدوات القياس على برنامج confocal. يحيط علما بهذه القياسات.
    ملاحظة: من المهم عدم الاصطدام بالهدف في الجزء السفلي من طبق العينة الذي قد يتسبب أيضًا في ملامسة طبق العينة مع طرف AFM ، مما قد يضر به.
  11. إذا كان موجودا، وإزالة فلتر ضوء الليزر، وضمان الليزر AFM على، بحيث يصبح ضوء الليزر مرئية في البصريات.
    1. باستخدام المحاذاة بالليزر، حرك الليزر في مجال الرؤية وبالقرب من طرف AFM. مرة واحدة في الليزر في هذا الموقع، استبدال فلتر ضوء الليزر.
    2. باستخدام المحاذاة بالليزر، ضع الليزر على الجانب الخلفي من حيث يقع طرف AFM على الـ cantilever. عند هذه النقطة، يجب أن تكون لوحة محاذاة الليزر قراءة إشارة مجموع أكبر من 0.0 V. إذا لم يتم الحصول على إشارة مجموع، ضبط المرآة باستخدام مقبض المرآة التي تسيطر عليها يدويا حتى إشارة مبلغ أكبر من 0.0 V يقرأ على الشاشة.
    3. نقل الليزر بكميات صغيرة في جميع الاتجاهات على afm cantilever حتى يتم تحقيق إشارة المبلغ الأقصى ولكن الموقف هو في طرف AFM. بمجرد تعيين موضع الليزر، صفر انحراف عمودي واتصال أفقي باستخدام بطلب انحراف يتم التحكم يدوياً.
    4. مراقبة لوحة محاذاة الليزر على البرمجيات AFM وباستخدام المقابض انحراف عمودي واتّصالي على رأس AFM، محاذاة كاشف بحيث يكون محور الهدف (نقطة حمراء في وسط مرمى) وليس هناك انحراف عمودي أو أفقي.
  12. افتح نافذة المعايرة في برنامج AFM. إدخال كافة معلومات محددة للتجربة. قبل المعايرة، قم بإيقاف مصدر ضوء المجهر confocal وإغلاق حاوية AFM، إن وجدت، لإخماد أي ضوضاء محتملة قادمة من ضوء الغرفة أو اهتزازات الغرفة. ثم اضغط على زر المعايرة للسماح تلقائيا للنظام لمعايرة الطرف. بعد اكتمال المعايرة، سيتم توفير صلابة الـ cantilever (N/m) وحساسيتها (nm/V) داخل لوحة المعايرة. لاحظ هذه لتحليل لاحق.
  13. سحب كانتليف AFM على الأقل 2000 μm مع المحركات السائر. خذ رأس AFM خارج المسرح وأزل طبق المعايرة. قم بتدوير الهدف المطلوب أو إدراجه. سحب الهدف 10٪ من مسافة العمل إذا كان النظام مبرمجا للحفاظ على نفس المستوى البؤري بين الأهداف. إذا كان هذا هو هدف النفط، ضع قطرة واحدة من زيت الغمر على عين الهدف.
    ملاحظة: تراجع الهدف يقلل من احتمال الاتصال الموضوعي طبق العينة أثناء وضع.
  14. لعقد بشكل آمن طبق العينة في مكان، واستخدام مسحة القطن لتطبيق الدبابيس الصغيرة من الشحوم فراغ حول حافة حلقة عينة داخل مرحلة العينة، أو استخدام مقاطع عينة. تحميل بعناية طبق العينة في مرحلة العينة.
  15. مرة واحدة يتم وضع العينة، تدويره عدة مرات لضمان ختم جيد من الطبق إلى حامل العينة عن طريق الشحوم. رفع الهدف إلى أسفل الطبق حتى النفط فقط الفتائل على عين الهدف.
  16. باستخدام المجهر، دون رأس AFM على المسرح، والتركيز على نظام التصوير بحيث العينة في التركيز. لاحظ هذا الارتفاع z للرجوع إليها.
  17. استبدال بعناية رئيس AFM على المنصة.
  18. باستخدام محركات السائر Z، خفض طرف نحو العينة. كما يتم تخفيض تلميح AFM، ضبط البحث عن الجداول (LUTs) في صورة brightfield حسب الحاجة. خفض الطرف حتى حاد تقريبا. باستخدام ميكرومتر موضع AFM الطرفية التي يتم تشغيلها يدويًا ، حرّك رأس AFM بحيث يكون طرف AFM في الوسط أو اليسار في مجال الرؤية.
    ملاحظة: منذ أن لوحظ ارتفاع Z من AFM من قبل في الخطوة 3.6، ويمكن اتخاذ خطوات أكبر لخفض طرف AFM، ومع ذلك، تم إضافة الشحوم إلى الجزء السفلي من الطبق وربما النفط إلى الهدف، لذلك هذه القيمة هو فقط للرجوع اليها. من المستحسن أن تأخذ 50 – 100 μm الخطوات وضبط أصغر كما يأتي تلميح في التركيز
  19. قم بإعادة ضبط موضع الليزر باستخدام ميكرومترات يدوية على رأس AFM. إذا لزم الأمر، صفر الانحرافات الرأسية واللمائية عن طريق ضبط المقابض المعنية وإعادة معايرة cantilever AFM في طبق العينة.
    ملاحظة: إذا تم معايرة الـ cantilever في وسط مختلف عن العينة، يجب إعادة معايرتها في الوسيلة المسحية لحساب تغيير محتمل في معامل الانكسار. بالإضافة إلى ذلك، قد ينجرف الليزر من الجانب الخلفي من الـ cantilever بسبب تغيرات في الضوضاء أو درجة الحرارة. فقط تعديل الليزر وإعادة معايرة إذا لزم الأمر وفي طبق العينة فوق الركيزة الزجاجية إذا كان استخدام معايرة عدم الاتصال. إذا كنت تستخدم معايرة الاتصال، إعادة معايرة داخل طبق المعايرة باستخدام متوسط العينة.
  20. لتحقيق جودة عالية صور المجهر confocal، استبدال مرشح الضوء المخفف الحالي مع مرشح كتل جميع ضوء الليزر AFM. لا يضمن فلتر الضوء هذا أي تداخل من الضوء الساطع بالليزر AFM.
  21. باستخدام زر الأمر النهج التلقائي، الذي يتم الإشارة إليه عادةً بواسطة سهم متجه لأسفل، خفض الطرف إلى أسفل طبق العينة. تعيين حجم /مساحة المسح الضوئي، ودقة، نقطة set، وطول z، ووقت بكسل (أو استخدام القيم معايرة/ نشر) على لوحة التحكم التصوير وبدء المسح الضوئي.
  22. بعد اكتمال الفحص، ارفع شريحة AFM 50 – 100 ميكرومتر قبل الانتقال إلى موضع قياس جديد في طبق العينة. بمجرد العثور على موقع جديد، اقترب من الزجاج، وابدأ في المسح الضوئي مرة أخرى باتباع الخطوتين 3.21 و 3.22.
  23. حدد خيار الحفظ التلقائي، أو احفظ كل ملف تم إنشاؤه يدويًا من كل فحص فردي بالنقر على حفظ.

4. إجراء الكونفوكال

  1. افتح برنامج التشغيل confocal. تأكد من تشغيل جميع الأجهزة الطرفية ومصادر الإضاءة ووحدات التحكم المرتبطة بها وتعمل بشكل طبيعي.
  2. قم بتدوير أو إدراج هدف من التكبير المنخفض (10x أو 20x) لعرض العينة. ضمان الهدف هو على مسافة عمل آمنة من حيث سيكون طبق العينة وإذا لزم الأمر، التراجع عن الهدف لتجنب أي تصادم محتمل من الهدف مع العينة. باستخدام مسحة القطن، الداب فراغ الشحوم حول حافة عينة حلقة طبق. إذا كان استخدام هدف النفط، ووضع قطرة واحدة من النفط الغمر على العدسة الأمامية للهدف
  3. ضع العينة المطلوبة في مرحلة العينة. تدور عينة حول عدة مرات لضمان أن الشحوم فراغ ولدت السندات ضيق إلى مرحلة العينة إدراج أو توظيف مقاطع عينة. إذا كان استخدام هدف النفط، ورفع الهدف إلى الجزء السفلي من الطبق حتى النفط فقط الفتائل على قاع الزجاج. لتجنب التبييض المفرط، تقليل الإضاءة المحيطة.
  4. باستخدام وضعات brightfield أو epifluorescence عبر الكاميرا أو العدسة، وتحديد موقع العينة واستخدام مقبض التركيز، والتركيز على منطقة ذات فائدة تحتوي على خلايا متعددة أو خلية واحدة. في كثير من الأحيان، يكون مجال الرؤية داخل المجهر البصري أكبر من نافذة المسح الضوئي x-y على نظام AFM (100 × 100 ميكرومتر). إجراء تعديلات على موقف AFM داخل مجال الرؤية confocal باستخدام لوحة التحكم في المحركات في برنامج AFM بحيث يقوم مسح AFM والبصريات confocal بتصوير نفس الميزات.
    ملاحظة: ضمن مجال العرض، عادة ما تكون هناك خلايا قليلة فقط، لذا فمن الأسهل تحديد الخلية التي ترغب في التحقيق. كما يتم إجراء AFM، الخلية تصبح مرئية على برنامج AFM، ومن هناك، يمكن للمستخدم تحديد مناطق محددة من الفائدة للتحقيق.
  5. إذا رغبت في ذلك، التقاط الصور في مجال مشرق أو epifluorescence باستخدام الكاميرا أو وسائط CLSM على أساس تسمية العينة، ومقابض التركيز، وأزرار التقاط على برنامج المجهر.
  6. باستخدام برنامج المجهر، حدد الخيار أو افتح اللوحة لتمكين قدرات confocal(على سبيل المثال،الليزر والمعلمات اللاحقة). عادةً ما يتم ملاحظة هذا الخيار بواسطة قيم طول موجة خط الليزر.
  7. حدد خطوط الليزر المناسبة للصبغات التي تستخدم في تلطيخ العينات. تشغيل واحد أو خطوط ليزر متعددة لإثارة وصورة تلك الميزات في العينة.
  8. تعيين الكسب إلى قيمة التي يحسن الفلوريسنس العينات ولكن يحد من مقدار الضوضاء. قيمة البدء النموذجية هي ربح 70.
  9. اضبط قوة الليزر لتجنب البيكسلات المشبعة ولكن قم بزيادة النطاق الديناميكي إلى أقصى حد. نطاق بداية نموذجي لأشعة الليزر هو 1 – 3٪
  10. قم بتعيين حجم الثقب على وحدة واحدة من وحدة Airy لزيادة الدقة للقطع البصري. إذا كانت العينة خافتة وقوة الليزر مرتفعة بالفعل، افتح الثقب لزيادة الإشارة على حساب تقليل دقة محور z.
  11. تعيين بكسل وقت يسكن (أي.سرعة المسح الضوئي). تبدأ مع 2 μs يسكن الوقت وإذا لزم الأمر، وضبط لتعكس سطوع العينة. اختر حجم البكسل/حجم المسح الضوئي للهدف المحدد عن طريق السماح للصك بحسابه عبر زر الخيار Nyquist والعدد المختار من البيكسلات في الصورة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي أطول أوقات يسكن في عينات أكثر سمكا إلى التبييض المفرط عندما يتم جمع مكدسات z.
  12. حدد الخيار Scan على برنامج الجهاز وابدأ في جمع البيانات.
    ملاحظة: إذا كان الجهاز يحتوي على ليزر متعددة، يمكن تحسين كل منها بشكل مستقل، ثم يتم تشغيلها في وقت واحد للصور متعددة الفلورسنت.
  13. استخدام مقبض التركيز على التكبير والتصغير وتحديد موقع مجال الرؤية الأمثل في العينة.
  14. التقاط الصور باستخدام زر الالتقاط في النظام وحفظ كافة تنسيقات الملفات اللازمة للعينة إلى الموقع/المجلد المطلوب على القرص الصلب للكمبيوتر، أو محرك الأقراص الثابتة الخارجي المحلي.
  15. استمر في ضبط الكسب، وقوة الليزر، وحجم الثقب، ومعدل أخذ العينات، والقيم الأخرى وفقًا لذلك لتحسين الصورة. يمكن تنشيط مؤشر تشبع البكسل للتحقق مما إذا كانت البكسل مشبعة أكثر من ذلك. إذا كان هذا التشبع المفرط موجودًا، فيمكن إعادة ضبط قوة الكسب والليزر للقضاء على البيكسلات المشبعة. استخدم LUTs كدليل لإجراء تعديلات محددة.
  16. استخدم معدل أخذ العينات في نظام Nyquist، الذي يتم عرضه في البرنامج كلوحة أو زر، إذا أمكن، لضمان جمع الصور عند الحد الأقصى للدقة التي يمكن الحصول عليها.
  17. تنشيط نظام confocal 'sكمام z أو أداة جمع حجم الصورة. باستخدام خيار من أسفل إلى أعلى، مع خط ليزر واحد فقط، وتحديدا خط الليزر الذي يضيء ميزة في العينة أوضح، تعيين بداية والانتهاء من الطائرات لوحدة التخزين التي يتعين قياسها.
  18. استخدم التباعد المقترح بين المقاييس في المكدس z، والذي يتم حسابه للوفاء بمعايير أخذ العينات Nyquist للحصول على أفضل دقة محورية يمكن الحصول عليها والتي يوفرها الجهاز وخط الليزر المستخدم.
  19. عند استخدام خطوط ليزر متعددة، استخدم أقصر طول موجة لحساب التباعد. عند انتهاء عملية الامتلاك، احفظ الملف في المجلد المناسب.
  20. بدلاً من ذلك، إذا كانت هناك معرفة مسبقة بسماكة العينة، حدد مستوى الصوت عن طريق تحديد المستوى الأوسط، وهو المستوى الذي يظهر الأكثر سطوعًا. في هذه الحالة، تعيين أعلى إلى نصف سمك العينة فوق الطائرة الوسطى وأسفل إلى نصف سمك تحت المستوى الأوسط.
  21. بعد اكتمال جمع العينات في مجال العرض هذا، أو إذا تم تبييض العينة، استخدم المرحلة الآلية أو التي يتم التحكم فيها يدويًا للعثور على مكان آخر من الاهتمامات على العينة وتكرار الخطوات لجمع الصور.

5. تنظيف الإجراءات

  1. تأكد من حفظ جميع ملفات البيانات، سواء من CLSM أو AFM، إلى المواقع المناسبة.
  2. سحب رقاقة AFM باستخدام محركات السائر Z على الأقل 2000 μm أو المسافة التي تم قطعها للوصول إلى سطح العينة. إزالة رئيس AFM من المسرح ووضعها بعناية في مكان الراحة.
  3. سحب الهدف المجهر بحيث يكون بعيدا عن العينة. إذا تم استخدام هدف النفط، ينبغي التراجع عن الهدف بما فيه الكفاية بحيث لم يعد هناك اتصال بين الهدف والركيزة العينة.
  4. باستخدام القفازات، وإزالة العينة وتنظيف قبالة الشحوم، والزيت إذا كان ذلك ممكنا، من الجزء السفلي من طبق العينة. الحصول على جديد، نظيفة، طبق بيتري فارغة وملئه مع 70٪ حل الإيثانول نصف إلى ثلاثة أرباع كاملة. ضعه في حامل العينة واستبدل رأس AFM للسماح لرقاقة AFM بالانقع في محلول الإيثانول لمدة 5 دقائق.
  5. في حين أن رقاقة AFM يتم نقع، فمن المستحسن أن تبدأ نسخ بيانات التجربة على قرص صلب خارجي. بعد الانغماس في رقاقة AFM في محلول الإيثانول لمدة 5 دقائق على الأقل، قم بإزالة رأس AFM وضعه في مكان الراحة.
  6. باستخدام القفازات، قم بإزالة حامل شريحة AFM وضعه في محطة التركيب. قم بإزالة شرائح AFM بعناية باستخدام الملاقط ذات القبضات المطاطية. ضع الطرف المستخدم مرة أخرى إلى موقع مربع أنها جاءت من محور المنحى للإشارة إلى أنه قد تم استخدامه. بالنسبة للرجوع إليها في المستقبل، لاحظ أي طرف تم استخدامه في التجربة.
  7. خذ طبق بيتري المملوء بمحلول الإيثانول خارج النظام والتخلص من السائل والطبق. باستخدام القفازات، منظف العدسة، ومناديل العدسة، قم بتنظيف الزيت بلطف من هدف المجهر بعد البروتوكولات القياسية. تنظيف حامل العينة عن طريق إزالة أي الشحوم. التخلص من جميع النفايات وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية وأدوات العودة إلى مواقعها المعروفة.
  8. إنهاء تجميع البيانات من الكمبيوتر (أجهزة) وإيقاف تشغيلها. قم بإيقاف تشغيل جميع الصكوك أو الملحقات أو الأجهزة الطرفية أو الأجهزة الأخرى المستخدمة في التجربة.

Representative Results

يتم تمثيل تقنية Conpokal تخطيطيا في الشكل 1A وتظهر صورة الإعداد في الشكل 1B. من أجل بدقة في موقع الهياكل البيولوجية عن طريق المجهر confocal مع نفس الهياكل في AFM، ومحاذاة النظامين أثناء التركيب أمر بالغ الأهمية. حدد مصنعي confocal و AFM ذوي السمعة الطيبة الذين هم على دراية بالمتطلبات المكانية لبعضنا البعض. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد التنفيذ الناجح لهذه التقنية على إجراءات تلطيخ جيدة ، وشل الهيكل البيولوجي ، والاختيار المناسب لتلميح AFM. ارتفاع الخلايا الحية غالبا ما يمثل تحديا للتصوير AFM. يتم عرض مسح AFM على خلية HEK حية في الشكل 2A. وكان ارتفاع هذه الخلية HEK خاصة حوالي 10 ميكرومتر، أظهرت من قبل مسح خط باللون الأخضر (الشكل 2B). AFM تلميح مع إما صفر الإزاحة (تلميح في نهاية جدا من cantilever) أو ارتفاع تلميح أكبر من ارتفاع الخلية(على سبيل المثال، وارتفاع الطرف ≥ 10 μm) سوف تنتج صورة حل للغاية من الخلايا الفردية. مثال على ضعف المسح الضوئي بسبب اختيار تلميح AFM غير لائق مدرج في الشكل 2C. في هذه الصورة، ظهرت بيكسلات سوداء في قمة الخلية تشير إلى أن AFM piezo خارج النطاق بسبب ارتفاع الخلية الكبيرة. ظهرت نهاية afm cantilever في الصورة (مربع مستدير) بسبب إزاحة طرف جنبا إلى جنب مع ارتفاع تلميح غير كافية مقارنة بارتفاع الخلية. هذه القطع الأثرية في صورة AFM تشير إلى أنه يجب اختيار طرف AFM مختلف لتصوير الخلية.

وضع العلامات الفعالة في التألق الملطخة مع المجس الصحيح لتصوير الخلايا الحية مطلوب لهذه الطريقة. قمنا بأداء صورة ثلاثية الألوان الثققة المعروضة في الشكل 3A مع وصمة عار نووية (الأزرق المفلور)، وصمة عار ميكروتوم (الأخضر المفلور)، وبقعة غشاء ليبوفيلي (أحمر الفلوري). تم اختيار هذه المسابير الخلية الحية بسبب تداخلها الطيفي المحدود وتوافقها مع مكعبات التصفية القياسية. لقد أدرجنا أيضا الصورة البصرية brightfield في الشكل 3B.

من AFM ، تحليل المسافات البادئة تلميح جنبا إلى جنب مع نموذج نانوميكانيكية ، وتنتج خريطة معامل من السطح. مثال على خريطة معامل شيدت باستخدام تناسب نموذج هرتز وملف تعريف مكافئ (نصف قطرها 8 نانومتر) لشكل تلميح مضاف على إعادة بناء 3D من شكل الخلية في الشكل 4A (وهو نفس الخلايا اثنين هو موضح في الشكل 3). يتم عرض الإسقاطات 3D المقابلة من رزمة z confocal الليزر في الشكل 4B.

الطريقة هي أيضا مناسبة للهياكل البيولوجية أصغر، بما في ذلك البكتيريا واحدة التي من الصعب حل ملامحها الدقيقة والناسكوبية باستخدام المجهر الخفيفة. دراسة مستمرة تستخدم تقنية Conpokal لاستكشاف الآليات الميكانيكية داخل جدار الخلية التي تؤثر على مقاومة المضادات الحيوية في المكورات العقدية في74 التلاعب بمكونات جدار الخلية أدى إلى تغييرات في مورفولوجيا ومقاومة المضادات الحيوية. Conpokal يسهل العيش، في حل، وجمع البيانات(على سبيل المثال،مورفولوجيا السطح، معامل مرن، قوة التصاق، وخشونة السطح) على عينات من نفس الخلية لزوجين الخصائص الميكانيكية مع وجود أو عدم وجود مكونات جدار الخلية. الشكل 5A,B تشمل مسح AFM وخريطة معامل قياس من بكتيريا نتوبة الطفرات. تم تحقيق قرار أفضل في هذا النطاق مع AFM من مع المجهر confocal التقليدية.

يحتوي الشكل 6 على صورة نقوش لمستعمرة من براز Enterococcus الملطخة ببقعة بنية الخلايا الفلورية الخضراء ، والتي تعلق على جدار الخلية. ويبين الشكل 5 والشكل 6 مدى انطباق تقنية كونبوكال على الميكروبات بالإضافة إلى الخلايا الكاوية.

Figure 1
الشكل 1: إعداد Conpokal.
(أ) التخطيطي لتقنية Conpokal. (B) صورة إعداد الصك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مجهر القوة الذرية للخلايا الحية.
(A) AM صورة من اثنين من خلايا HEK. (B) الارتفاع الشخصي (الخط الأخضر في A) من خلية HEK تشير إلى ارتفاع الخلية كبير جداً عند 10 ميكرومتر. (C) صورة AFM الفقراء من خلية astrocyte حيث AFM piezo خارج النطاق في قمة الخلية ، وهناك أدلة على التصوير العكسي من نهاية cantilever. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المجهر الكونفال و brightfield من الخلايا الحية.
(أ) الليزر المسح المجهري confocal من خلايا HEK الحية الملطخة بصبغة نووية (الفلوريسينغ الأزرق)، وصمة عار ميكروتوم (الأخضر الفلوري) وبقعة غشاء lipophilic (الفلوريسينغ الأحمر). (B) المقابلة brightfield البصرية الصورة. أشرطة مقياس 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مقارنة بين الاداءات ثلاثية الأبعاد لـ AFM والمجهر الميكروفي للخلايا الحية HEK.
(أ)خريطة معامل شيدت باستخدام نموذج هيرتز تناسب وملف جانبي مكافئ (نصف قطرها 8 نانومتر) لشكل طرف مضاف على إعادة بناء 3D من الخلية من AFM. (B) الإسقاط ثلاثي الأبعاد المقابل للكومة z اللزوجة بالليزر مع بقعة نووية (اللون الأزرق المفلور) ، وصمة عار ميكروتوم (خضراء الفلوريسكينغ) وبقعة غشاء ليبوفيلي (أحمر الفلوري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: AFM عينة البكتيريا.
(A) AFM المسح الضوئي و (ب) قياس خريطة معامل من بكتيريا المكورات العقدية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: المجهر الكونكنتال لعينة البكتيريا.
صورة Confocal لمستعمرة من البراز Enterococcus مع وصمة عار غشاء الفلورسنت الأخضر. شريط مقياس هو 5 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

Conpokal هو تقنية متقدمة وفعالة لجمع صور عالية الجودة والخصائص الميكانيكية في الموقع من المواد الحيوية الحية في بيئة سائلة. تمتد القدرة على جمع صور مورفولوجيا وتضاريس استثنائية جنبا إلى جنب مع الخصائص الميكانيكية عينة حية الماضية الإلكترون نموذجي وتقنيات المجهر الخفيفة. بشكل منفصل، يوفر المجهر النافورقfield، epifluorescence، والقدرات الالتقاء المسح الضوئي بالليزر لتحقيق جودة عالية، صور الفلورسنت مفصلة من العينات. AFM يوفر التوصيف الميكانيكية، ولكن بدون البصريات المساعدة يصبح من الصعب التنقل في العينة. مع النظامين مجتمعة، يمكن للمستخدم جمع كل من الصور والخواص الميكانيكية لنفس الخلية بالضبط خلال التجربة، والتي هي ميزة كبيرة على اثنين من الأدوات منفصلة. الغرض من هذه المخطوطة هو إعلام وتوجيه المستخدمين حول القدرات الواسعة لنظام Conpokal المشترك لمستقبل البيولوجيا والهندسة والصحة. ويتضمن البروتوكول إعداد الأدوات، ووسائل الإعلام الثقافية، والأطباق، واختيار الكائنات الحية الدقيقة، وإجراء AFM، وإجراء ال confocal، وتنظيف. الخطوات الأكثر أهمية لنجاح العيش ، في الحل ، Conpokal الدورة هي نموذج شل الحركة ، واختيار تلميح حكيم ، والتنفيذ البقعة الحية. سيفصّل قسم المناقشة لهذه المخطوطة توصيات الثقافة، ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمبادئ التوجيهية التشغيلية، والعمل المستقبلي لتقنية Conpokal. وستغطي التوصيات المتعلقة بالثقافة توجيهات بشأن ثقافة العينات، والجمود، والتلطيخ. AFM، confocal، وConpokal نصائح والمبادئ التوجيهية سوف تناقش اختيار تلميح والمعايرة، والقرار، والقيود، والتشغيل في وقت واحد تقريبا. ويشمل العمل في المستقبل التوقعات والإمكانات لمسارات البحث المحتملة.

يغطي البروتوكول الثقافة، التحقيق، وتصوير كل من عينات الخلايا الحية والبكتيريا الثابتة. أحد التحديات الحالية عند إجراء AFM في السائل ينبع من عرقلة حركة cantilever بسبب عائق عينة والسحب هيدرودينامي. إذا لم يتم التقيد العينة جيدا الركيزة، وهناك احتمال لتكفر من cantilever من قبل أجزاء من عينة عائمة في السائل. في هذه الحالة ، يتم اختراق القياسات لأنها افتراض الالتزام المرن والخصائص micromechanical للعينة. لم يتم التعامل مع خلايا HEK مع المثبت، ومع ذلك، S. الطفرات والبراز E. تتطلب شل إضافية، على غرار الخلايا الأخرى prokaryotic. وأظهرت البكتيريا التي تم اختيارها حركة نشطة التي أعاقت التحقيق في الخلايا والتصوير، وبالتالي، كانت العينات بلطف، كيميائيا ثابتة لتعزيز شل الحركة. هناك بدائل لل التثبيت الكيميائي، مثل أغشية المرشح التي تحاصر الخلايا الفردية في المسام75.

اختيار تلميح هو أيضا عنصرا حاسما في إعداد وتشغيل AFM. عندما يتم البحث عن الخصائص الميكانيكية على أساس تشوه المواد الحيوية ، يجب على المرء أن ينظر في صلابة النتليفل والتوافق صلابة المواد ، وهي مهمة غير تافهة. الهدف الرئيسي هو أفضل لمطابقة صلابة المواد مع صلابة من cantilever المختارة. إذا كانت cantilever هو أكثر ليونة من العينة، وسوف تكون عرضة لتنحدر كثيرا. إذا كانت كانتليفر أكثر صلابة من العينة، ثم كاشف AFM قد تكون غير قادرة على التقاط هذه الانحرافات الصغيرة. فمن المستحسن أن عند اختيار am cantilever مناسبة، لاختيار على أساس التطبيق التجريبي. لجمع صور مفصلة في وضع الاتصال المتقطع، نصائح AFM ضمن نطاق 0.1 - 0.3 نيوتن /م لصلابة ونصف قطرها داخل 5 نانومتر – 100 نانومتر فعالة للتصوير الخلية الحية. ويوصى نصائح مخروطية صغيرة. نصائح حادة توفر منطقة اتصال صغيرة والقدرة على المسافة البادئة مساعدة إضافية في جمع التفاصيل الصغيرة والميزات في عينة مورفولوجيا76. ومع ذلك، يمكن أن تكون النصائح الحادة أيضا إشكالية لأنها عرضة لعينات ثقب عندما الإعدادات(على سبيل المثال،نقطة تعيين، بكسل الوقت، سرعة الاقتراب) تتطلب الكثير من المسافة البادئة أو المسافة البادئة سريع جدا. لتجنب آثار معدل الضغط العالي ، سلالة المحلية تصلب بالقرب من طرف حاد ، أو ببساطة للسيطرة على منطقة التماس وسرعة الاقتراب ، وكثير من اختيار استخدام القوة الطيفية مع طرف الغروية لقياس معامل مرن.

نصائح AFM ضمن نطاق 0.01 - 1.0 N /m لصلابة ونصف قطرها في غضون 1 – 5 ينصح μm لقياس مودولي مرنة من الخلايا الحية. أحجام تلميح كبيرة، عادة الغرويات الزجاجية، وتوفير منطقة اتصال معروفة ومن غير المرجح أن ثقب الخلية أثناء الاتصال. ويفضل التكاين المستطيل على الثلاثي لأنه أثناء المعايرة، يمكن استخدام طريقة الاتصال الخالية من هندسة مستطيلة بالمقارنة مع المعايرة القائمة على الاتصال للهندسة الثلاثية. أيضا، نظرا للطبيعة الحساسة من نصائح AFM، فمن المستحسن أن المشغل ينفذ ملاقط مع نصائح المطاط للحد من إمكانية إتلاف رقاقة AFM الحساسة أو كتلة تصاعد. وتشمل المعلمات الأخرى التي يجب أن تضع في اعتبارها سرعة الاقتراب من طرف AFM ومقدار المسافة البادئة في العينة. وهناك مبدأ توجيهي جيد هو الحفاظ على المسافة البادئة لحوالي 10٪ من سمك (أو ارتفاع) من العينة واختيار السرعة التي تمنع المقاومة الهيدروديناميكية المحتملة التي تعاني منها cantilever38.

عادة ما تأتي الأدوات التجريبية المعقدة مع حواجز الطرق التي تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها في إعداد الجهاز والمعايرة والتشغيل. تحطم طرف AFM أو cantilever في عينة أو الركيزة عينة هو خطأ شائع للمستخدمين الجدد. لتجنب هذه المسألة، يقترح البروتوكول دعم الـ cantilever من 2000 ميكرومتر. هذه الخطوة تضمن أن الطرف لن يتلامس مع الجزء السفلي من الطبق إذا نسي المستخدم السابق التراجع عن الطرف عند التنظيف بعد التجريب. ومع ذلك، تم اختيار مسافة 2000 ميكرومتر لصاحب الطبق المختار المستخدم في هذا البروتوكول. قد تحتاج مجموعة مختلفة، أكبر أو أصغر، إلى أن يتم اختيار اعتمادا على نمط حامل الطبق المستخدمة. أثناء محاذاة الليزر وجهاز الكشف، ويذكر البروتوكول تعديل مقبض المرآة لتحقيق أقصى قدر من إشارة المجموع. قد لا يكون مقبض تعديل المرآة موجودًا على جميع AFMs. إذا كان موجودا، ومع ذلك، طريقة واحدة من التلاعب أداة لاستكشاف إشارة مبلغ منخفض هو ضبط مقبض المرآة، وتستخدم لحساب المتوسطة التي سيتم المسح الضوئي. إما السائل(على سبيل المثال، الماء ، وسائل الإعلام ، برنامج تلفزيوني) أو الهواء. بسبب الفرق في مؤشر الانكسار للضوء من خلال الهواء ومن خلال السائل، قد تحتاج إلى تعديل مقبض المرآة. أقصى حساسية الانحناء من cantilever AFM سيكون في موقع طرف AFM، لذلك، ضوء الليزر، الذي يعود موقف الانحناء من خلال وضعه على الصمام الضوئي، يجب أن يكون موجودا في موقع طرف AFM. اعتمادا على طرف AFM المختار، يمكن أن تختلف قيمة إشارة المبلغ من 0.3 - 3.0 V. طلاء المؤخر على cantilever AFM مثل Cr-Au أو Al سيزيد من إشارة المجموع وحساسية القياس.

هندسة التلميح تكون ذات صلة عند إكمال معايرة التلميح أثناء عملية AFM. وقد لوحظ اتفاق جيد بين عدم الاتصال ومعايرة الاتصال. إذا كان AFM cantilever المختارة ليست مستطيلة، سوف تحتاج إلى إجراء معايرة الاتصال. ضع في اعتبارك أن الوسيط الذي يتم معايرة التلميح فيه يجب أن يكون نفس الوسيطة العينة. إذا كانت هذه السوائل تختلف، يجب على المستخدم إعادة معايرة. عند استخدام نصائح AFM في السائل، ينبغي أن يكون التردد الذي يقاس من قبل النظام من ربع إلى ثلث تردد الرنين الطبيعي الذي يشير إليه الصانع. وهناك طريقة جيدة للتحقق من أن النظام معايرة تلميح بشكل صحيح للتحقق من القيم داخل ملف الضوضاء الحرارية التي يتم إنشاؤها. تأكد من حفظ هذا الملف إلى المجلد المناسب. إذا كان النظام لديه مشكلة في معايرة أو القيم غير المحتملة يخرج ، وإعادة معايرة ، أو ضبط موضع الليزر قليلا ثم إعادة معايرة.

سبب آخر من ضعف إشارة المبلغ قد يكون بسبب AFM cantilever محاذاة. عندما يتم تركيب رقاقة AFM في الكتلة الزجاجية ، فمن الضروري أن يبقى طرف الـ cantilever داخل نافذة الليزر الصغيرة (منطقة الزجاج الملساء). إذا كانت الشريحة بعيدة جدا إلى الأمام، قد تسبب الزاوية التي تقع فيها الـ cantilever بشكل طبيعي مشكلة مع انعكاس قبالة الـ cantilever، في عداد المفقودين في المُنَفَع الضوئي، مما يؤدي إلى ضعف إشارة المبلغ. إذا كانت الشريحة بعيدة جداً عن الخلف، فإن الليزر لن يتمكن من التأمل في الجزء الخلفي من الـ cantilever، مما يسبب إشارة مبلغ ضعيف. لهذه الأسباب، قد تحتاج إلى تعديل رقاقة AFM المثبتة. بالإضافة إلى ذلك، تحدث مشكلة أخرى قد تتم مواجهتها مع ارتفاع النموذج. أداة AFM المستخدمة في هذا البروتوكول لديها أقصى نطاق بيزو z (ارتفاع) من 15 ميكرومتر. إذا وجد المستخدم أن البرنامج غير قادر على جمع بيانات الارتفاع وفرض الخرائط في بكسل معين، سيظهر مربع أسود يشير إلى أن النظام خارج النطاق (الشكل 2C). طريقة واحدة لمشكلة اطلاق النار هذه المسألة هو تعيين ارتفاع بيزو إلى قيمة أقل، مثل 2 أو 3 μm حتى يتم الالتزام معظم نطاق 15 ميكرومتر لرسم خرائط الارتفاع المتوقع من الخلية. يجب أن تعمل هذه التقنية، في معظم التجارب المتعلقة بالخلايا أو البكتيريا، على إصلاح المشكلة المرتبطة بنطاق z.

قد تحتاج التجريبية التي تتطلب نطاق z موسعة لعينات طويل القامة مع ارتفاعات أكبر من 10 - 15 ميكرومتر لمتابعة وحدة إضافية على AFM. مصنعي AFM لديهم هذا الخيار متاح بتكاليف إضافية لمعظم الأنظمة. من خلال توسيع نطاق z ، فإن التجريبي لديه التوافر لمسح العينات التي تعتبر طويلة على النطاق الصغير مع قضايا صغيرة لقيم خارج النطاق أو تعديل المحرك AFM piezo. على الرغم من أن تكلفة هذه الوحدات إضافية، بعض، اعتمادا على الصانع، يمكن أن تقدم ارتفاع إضافي، تصل إلى 100 μm في اتجاه z. Confocal لا يزال ممكنا مع عينات أطول إذا كان المستخدم لديه مسافة عمل طويلة ، وارتفاع الهدف التكبير أو هو على استعداد لاستخدام هدف الهواء ، وربما 20x أو 40x. عن طريق خفض المجهر التكبير الهدف، ومسافة العمل يزيد، وكسب المسافة لعرض قمة عينة أطول. هذا التعديل إلى هدف تكبير أقل سوف تضحي الدقة. في إعداد Conpokal المشار إليه في هذه المخطوطة، فإن هدف TIRF 60x (الانعكاس الداخلي الكلي للفلورس) له مسافة عمل تقارب 100 ميكرومتر بعد غطاء طبق العينة الزجاجي القاع.

فيما يتعلق بالمجهر confocal المشار إليها في هذه المخطوطة، يتم مناقشة بعض الشروط الهامة. وقد نفذ نظام الالتقاء المستخدم لإنتاج الأرقام في هذه المخطوطة هدفاً نفطياً من 60x TIRF مع فتحة رقمية 1.49. واستخدمت خطوط الليزر في 405 نانومتر، 488 نانومتر و 561 نانومتر الطول الموجي الإثارة للتصوير عينة الخلية الحية، كما هو مبين في الشكل 3 والشكل 4. يمكن تحديد حد الانعراج للمجهر confocal باستخدام معادلة الدقة في Abbe، قرار Abbe(x، ص) = λ/2NA، حيث λ هو الطول الموجي للإثارة لليكسا 488، في 488 نانومتر، وNA هو الفتحة العددية للمكثف confocal، وهو 0.3. لذلك، يتم تحديد دقة محورية من 272 نانومتر. بالنسبة لتصوير الفرجة، يتم النظر في حالتين لتحديد القرار حيث يتم تعيين الثقب على وحدة واحدة مُهية الهواء (AU) و 0.5 AU. في الحالة الأخيرة ، يتم إغلاق الثقب لأسفل بحيث يحدث فقدان كبير للضوء ، ولكن يزيد القرار. يحسب البرنامج confocal القرارات الأصلية ومحورية في 170 نانومتر و 290 نانومتر للثقب في 0.5 الاتحاد الافريقي، و 200 نانومتر و 370 نانومتر للثقب في 1 الاتحاد الافريقي، على التوالي. يمكن حساب الانحرافات الكروية التي تم إدخالها في النظام من خلال عملية فك التباين لزيادة التباين والدقة في صور المجهر. بسبب القيود الحيود التي هي متأصلة مع المجاهر confocal، صورة confocal من مستعمرة البكتيريا في الشكل 6 يفتقر إلى دقة مطابقة للتفاصيل التي ينظر إليها في مسح AFM من البكتيريا في الشكل 5. يوفر AFM إمكانية الوصول إلى ميزات النانو والتفاصيل التي يصعب التقاطها باستخدام مجهر مشترك. ومع ذلك، اعتمادا على دقة الفلوريسنس المطلوبة، الشكل 5 والشكل 6 تبين إمكانية تطبيق تقنية كونكبوكال على الميكروبات بالإضافة إلى الخلايا eukaryotic.

ميزة استخدام المجهر confocal يسمح للمشغل لجمع صور 3D من مناطق محددة في عينة مع تفاصيل شحذ. ترتبط هذه الصور مع AFM من خلال عرض السطح الذي تم فحصه عبر صورة AFM ومسح confocal للمنطقة نفسها. منذ المجهر هو مقلوب، صورة epifluorescence يجمع معلومات الضوء من الجانب الآخر من العينة التي تم التحقيق. ثقب داخل نظام confocal يساعد على الحد من طائرة واحدة من مسافة معينة في حين تصفية الضوء الذي يأتي من بقية العينة أو حتى الغرفة. أساسا، يساعد الثقب على عزل الضوء القادم من الطائرة واحدة من الفائدة في العينة. عادة، يجب أن يحتوي هذا المستوى من الفائدة على علامات فلورية قوية لأنه، بالنسبة للأنظمة confocal المقلوب، فإن الكشف عن جزيء واحد سيكون محدوداً إلى المجاهر confocal أعلى دقة. Epifluorescence الإضاءة هو أقل من المرغوب فيه يرجع ذلك إلى حقيقة أنه في وضع التصوير epifluorescence ، يتم جمع أي ضوء من العينة التي تنعكس في الهدف وتستخدم لتوليد صورة ، وبالتالي ، من المستحيل لعزل طائرة واحدة. تقنيات Confocal توفير صورة أكثر عزلة طائرة واحدة من ميزة العينة في السؤال بسبب الثقب77. إذا، على سبيل المثال، يتم التحقيق قمة الخلية eukaryotic من قبل AFM، يمكن عزل هذا السطح نفسه مع قدرات المجهر المسح الضوئي بالليزر، بدلا من وضع التصوير epifluorescence. من المستحسن مراقبة صحة / شكل الخلايا أثناء الحصول على البيانات عن طريق التصوير في وقت واحد في وضع التباين التفاضلي مع مساعدة كاشف الضوء المنقول وخط الليزر 488 نانومتر. عند التقاط كومة z من العينة، للإجراء مفصلة أعلاه، يتم تعديل فقط كسب الكاشف. أي تغيير شكلي في الخلايا أثناء القياس، والذي لا يكون مرئياً بالضرورة في القنوات الفلورية، يشير إلى أن القطع الأثرية يتم إدخالها في القياس.

ويمكن الحصول على تباعد مثالي بين الطائرات باتباع توصية البرنامج لأقصر طول موجي المستخدمة في تقنية التصوير. يمكن تحسين دقة الأصلي ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في أحجام الصور بشكل فعال من خلال توظيف خوارزميات deconvolution المتاحة في وحدة معالجة الصور من برنامج الاستحواذ. ومع ذلك، فإن إجراء المجهر الفلورسنت، واختيار بقع وأصباغ محددة أمر حيوي لتجنب التبييض المبكر أو التنافر المتبادل من الإثارة المتداخلة/أطياف الانبعاثات. في بعض الأحيان ، قد يتعرض المستخدم لعطل في توليد الضوء confocal. إذا كان المستخدم يواجه نقصًا في الانبعاثات الخفيفة أو خطوط الليزر المعطلة، فإن إحدى الطرق لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها هي إعادة ضبط النظام، ويتم ذلك عادةً عن طريق إعادة تشغيل برنامج التشغيل. إذا استمرت المشكلة، قد يكون جهاز الكشف عن الضوء المنقول قد فشل في الانتقال إلى أو خارج المكان داخل المسار البصري للمجهر الخفيف. قد تساعد إعادة تعيين موضع جهاز الكشف عن المرسل على تخفيف مشكلات التقاط الضوء أو التصوير بالليزر.

وينصب تركيز أداة Conpokal على تزويد المستخدمين بالقدرة على جمع المعلومات البصرية والقائمة على القوة على المواد الحيوية الحية في بيئة سائلة، في وقت واحد وعلى نفس الخلية أو الميزة. يصف هذا العمل صراحة كيفية إجراء هذه التجارب في السائل، وهو منزل طبيعي للعديد من المواد الحيوية، على الرغم من أن التجارب الجافة لا يزال من الممكن تنفيذها باستخدام الأجهزة. مع عينات أعدت في أطباق بيتري، وارتفاع الطبق هو الحد. بسبب تكوين كتلة الزجاج الذي يحمل كانتليف AFM ، يجب أن تكون الجدران الجانبية للأطباق أقل من 10 ملم في الارتفاع ؛ إذا كان الطبق طويل القامة جدا، فإن الصك لن تكون قادرة على خفض طرف AFM إلى سطح العينة أو الركيزة.

11- وعلى الرغم من وجود حدود لحجم العينة، لا يوجد أي قيد على قدرات الأداة أو البرامجيات فيما يتعلق بتأخير الوقت. في وقت واحد confocal وAFM ممكن مع العوامل الصحيحة في المكان. يشير القيد الذي يساهم في قدرته القريبة المتزامنة إلى الضوضاء التي يتم إنشاؤها عند أداء بعض وظائف المجهر الناسخ ووظائف المجهر والقوة الذرية في وقت واحد. سيتم إضافة الاهتزازات من المحركات التي تحرك هدف المجهر أثناء جمع مكدس z إلى الإشارة من طرف مسبار AFM أثناء حركته. وسيتم تعزيز الضوضاء من قبل هدف النفط، كما تتحرك المحركات صعودا وهبوطا في اتجاه z لإلقاء الضوء على الطائرات المتتابعة في العينة. لذلك، يتضمن البروتوكول الموصى به مجموعة متسلسلة من مسح AFM وصور المكدس z confocal. في وقت واحد CLSM و AFM تتطلب التصوير الثابتة مع confocal، ومع ذلك، مع التقنية الحالية، يمكن أن يكون وقت التأخير للأدوات اثنين قصيرة مثل عشرات ثانية. وكان الوقت الفعلي للتبديل من عملية AFM للتصوير confocal حوالي 2 – 4 دقائق للصور التي تم جمعها في الشكل 2A والشكل 4B. تم تحديد هذه القيمة عن طريق طرح فترتي وقت جمع الصور من الوقت الإجمالي لـ 33 دقيقة ، والذي يتضمن الوقت لبدء واستكمال مسح AFM ، ومفتاح أوضاع الأدوات لتنشيط التصوير confocal ، والبدء في كومة الصورة confocal z وإكمالها.

يهدف مستقبل Conpokal إلى استكشاف علاقات جديدة بين الهيكل والوظيفة بالإضافة إلى البصيرة الدقيقة لعمليات الخلية الواحدة. على سبيل المثال، فإن تجريب العلاجات الدوائية في الموقع على عينات الخلايا أو البكتيرية لتحديد آثار مرونة الخلية سيكون التقدم في مجالات المواد الحيوية والبيولوجيا والميكانيكا الحيوية. العلاج في طبق العينة أثناء التصوير والتد من شأنه أن يوفر المعرفة حول كيفية استجابة العينة للعلاجات في بيئة حية ومتحكم فيها بعناية ، مع مرور الوقت. دمج دواء جديد أو تحديا البيئية من شأنه أن يوسع فهم كيفية الهيكل السيتوسلتون أو موقع organelle يؤثر على الحركة، طوبولوجيا، صلابة، الخ. آخر التقدم المحتمل لConpokal هو القدرة على السيطرة البيئية الكاملة للنظام. يقع Conpokal الحالي المذكور في هذا البروتوكول داخل حاوية صوتية مصممة لتقليل الضوضاء من داخل المختبر. ومن شأن النهوض بهذا السكن أن يوفر القدرة على اختبار أحد العوامل، ربما، أو مجموعة من العوامل، لا تقتصر على تلك العوامل مثل البيئة العقيمة، أو التي تسيطر عليها درجة الحرارة، أو حتى الجاذبية المتغيرة. كما هو الحال، طريقة Conpokal يوفر نهجا فعالا ومفيدا لتميز الحية، في السائلة المواد الحيوية، ولكن مستقبل هذه التقنية سوف تقدم فقط هذه القدرات.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نحن نعترف بتمويل NIH COBRE تحت رقم P20GM130456. نشكر شركة Uk Light Microscopy Core، التي يدعمها نائب الرئيس للأبحاث، على المساعدة في هذا العمل. وقدمت الدكتورة ناتاليا كوروتكوفا سلالات من الـ S. mutans وE. faecalis.  أول ذكر لـ "اللعب على الكلمات" Conpokal ، لوصف مزيج من المجهر confocal والمجهر والقوة الذرية يعزى إلى الدكتور براد بيرون ، الكيميائية والمواد الهندسية ، في جامعة كنتاكي ، في مناقشة مع الدكتور مارثا جرادي (المؤلف المقابل) تحسبا لوصول المتحدث ندوة الدكتور جوناثان فام ، الذي انضم إلى هيئة التدريس في الهندسة الكيميائية والمواد في جامعة كنتاكي في خريف عام 2017.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602 (2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102 (2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102 (2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809 (2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9 (2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101 (2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429 (2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564 (2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54 (2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011 (2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427 (1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236 (2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546 (2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 162، المجهر confocal، المجهرية القوة الذرية، AFM، conpokal، البكتيريا، بيولوجيا الخلايا، المواد الحيوية، التصوير الخلية الحية، علم الأحياء
قرب متزامنة ليزر المسح Confocal والقوة الذرية المجهرية (Conpokal) على الخلايا الحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter