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Bioengineering

近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜(康波卡尔)

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433

Summary

这里介绍的是康波卡尔技术的协议,该技术将共和力和原子力显微镜结合到一个仪器平台上。Conpokal 提供相同的细胞、同一区域、近同时的共生成像和活生物样品的机械表征。

Abstract

过去几十年中,可用于微和纳米级机械表征的技术已经爆炸式增长。从扫描和透射电子显微镜的进一步发展,到原子力显微镜的发明,以及荧光成像的进步,在小型材料研究的技术方面取得了重大进展。Conpokal 是一种将共和显微镜与原子力显微镜 (AFM) 相结合的波特曼托,其中探测器"戳"表面。尽管每种技术对于定性和/或定量图像采集本身非常有效,但 Conpokal 提供了通过混合荧光成像和机械特性进行测试的能力。Conpokal 专为近同步共生成像和原子力探测而设计,可促进实时微生物样本的实验。从配对仪器增加的洞察力提供了由AFM与亚细胞成分或通过共和显微镜观察到的活动共同定位测量的机械性能(例如,弹性模量、粘附度、表面粗糙度)。这项工作为激光扫描共和和原子显微镜的操作提供了一个逐步的协议,同时实现相同的细胞、相同的区域、共体成像和机械特性。

Introduction

微尺度或纳米级机械评估工具通常用于发现单个细胞或微生物水平的变形特征,而单独的高分辨率显微镜工具用于可视化亚细胞过程和结构特征。Conpokal,是激光扫描共声显微镜和原子力显微镜(AFM)组合成一个单一的仪器平台。Conpokal 技术首先在非生物聚合物系统中实施,其目标是确定与软表面接触的硬表面的附着力、弹性和表面张力。共和图像提供了聚合物如何变形、粘附和释放硬探针1,2的视觉渲染。从聚合物到生物样品,该技术为几乎同时进行活细胞或微生物共体成像和AFM提供了机会。

细胞弹性的变化与许多人类疾病的发病机制有关3 包括血管疾病4疟疾5,6, 刀状细胞贫血7关节炎8哮喘9, 和癌症6,10,11,12,13,14,15.测量细胞力学的常用技术包括使用磁珠16,17, 光学钳子18,19, 微管吸气8,20,21,22, 和 Afm11,23,24,25,26.自AFM应用到活细胞以来,它很容易适应细胞地形特征27,28 以及机械性能11,24,29,30,31 纳米级精度。AFM 已进一步适应微河学32,33调频34,35, 和蠕变25,36,37 实验研究各种细胞系的粘弹性特性。使用适当的纳米联系模型对于从 AFM 生产的力缩进测量中提取定量弹性值至关重要1,2.研究细胞骨骼药物对细胞弹性影响的AFM研究表明弹性模量受到严重影响38.根据弹性模量测量结果,许多研究人员已经表明癌细胞比非转化细胞柔软11,38,39.增加的畸形性可能在癌细胞转移和渗透组织的能力中起一个突出的作用40.这种行为是由细胞骨骼组织的修饰调节的38,41,42.除了癌症,另一类机械依赖性疾病是呼吸系统疾病。例如,急性呼吸应激综合征每年影响越来越多的人类。研究表明,当患者接受机械通风时,氧气浓度高,其病情会恶化43.在一系列观察ALvealthalnet巨噬细胞与AFM的研究中,科学家发现,加入富氧环境增加了细胞由于作用素的形成而的刚度;AFM 在我们详细了解大气环境对细胞水平呼吸功能的影响,并最终影响人类愈合和健康方面的影响的一个示例44,45,46.通过 AFM 也可以评估向伤口迁移期间的上皮细胞刚度,并且出现弹性模数的变化,以表示未来的细胞扩散47,48.因此,有实际需要定量测量细胞力学,以了解患病细胞如何与健康细胞不同,并与健康细胞相互作用。

AFM还用于研究粘合剂的特性和表面结构。原子力显微镜具有多种模式,可使用接触力学收集有关样品的信息。对于活的生物样品,两个主要目标是获得定量机械属性值(例如,弹性模态、粘合力)以及地图表面高度。这些模式包括攻丝模式(也称为间歇性接触),它保持恒定的悬臂振幅间歇性地接触样品表面和接触模式,从而提升或降低悬臂以保持恒定的偏转49。可以使用 AFM 系统的力图收集粘附贴图。悬臂将样品缩进到一定力,然后缩回。抗回缩力由探测器测量,以生成力位移图。附力是缩回过程中测量的最大力。表面形态学提供了微或纳米级样品的详细视图。悬臂完成对样品的栅格扫描,根据悬臂在每个像素上的运动所捕获的凹痕和偏转,揭示微和纳米大小的特征。使用AFM,小特征的大小,如petidoglycan结构50,聚合物链对齐51,旗杆52,拉梅利波迪亚53,和菲律宾54 可以测量。虽然 AFM 的功率在于力位移曲线和非光学拓扑图像,但共声显微镜提供了荧光标记样品的详细成像。

共声激光扫描显微镜(CLSM)是一种主要技术,用于成像活细胞、固定细胞和组织55、56、57。CLSM自1955(即成立58,59)以来一直从事生物成像工作。虽然共聚焦显微镜的工作原理(即通过针孔抑制对焦光)基本保持不变,但技术实施已变得非常多样化,56、57、58、60。共聚焦成像可以通过多点扫描实现,如在旋转光盘系统61中,对单个激光束进行点扫描,如线扫描62,或通过多元素探测器57通过后续像素重新分配成像点传播功能。最近不断扩展共声成像的用途的进步包括激光扫描能力、高速共振扫描和高灵敏度探测器63、64、65。与宽场显微镜不同,所有共和系统的优势在于能够在 z 轴中更详细地执行光学剖切,尤其是在厚样品中。使用基于摄像机的探测的宽场显微镜可收集来自焦平面发出的光,同时收集照明路径中任何地方发出的光。通过关闭针孔,以降低信号的成本,轴向和横向分辨率都可以增加66。在 CLSM 中,图像通过发射信号收集建立像素,因为激励激光器在 x-y 视野中扫描。然后,可以使用样本的 z 轴上几个 x-y 平面的集合来重建样本57, 67三维体系结构。共体显微镜结合荧光蛋白的引入,彻底改变了我们对细胞生物学的理解。例如,它已成为神经科学中必不可少的工具。CLSM经常用于观察清除的组织,并获取免疫染色大脑和神经元网络结构70的综合图像。这一应用产生了对大脑71神经元和胶质细胞之间的突触接触和沟通的新见解。从脑细胞到囊泡,荧光染色协议支持通过共和显微镜检查和捕获细胞功能,以取得治疗技术72,73。

虽然它们是令人印象深刻的和通用的工具单独,结合和原子力显微镜(Conpokal)的组合使研究人员能够独特的关联地形和微机械细胞/组织属性与观察各种细胞器及其各自的动力学。配对检测允许用户,本质上,"看到"他们正在探测什么;比一种技术本身的巨大优势。使用 Conpokal,通过 AFM 的力图覆盖在共和图像上,以将细胞刚度、粘附或形态与样本中的细胞骨骼结构关联。Conpokal 方法的总体目标是为研究人员提供一个平台,以简洁、有效的方式研究活体样本,在单个平台中提供图像和材料属性数据。在这项工作中,我们演示了 Conpokal 的操作,包括正确的样品选择和制备、仪器设置、悬臂校准,并为成功的故障排除提供指南。在协议实施后,我们提供具有代表性的结果,包括成功的细菌和细胞AFM高度映射、细菌和细胞AFM模态图,以及通过同一细胞共和和AFM的多标记细胞的共生成像。最后,我们将讨论 Conpokal 过程的关键步骤、故障排除建议、技术限制、重要性以及该方法的未来前景。

Protocol

1. 乐器、文化媒体、菜肴的制备

  1. 打开共体显微镜和原子力显微镜的电源,以及康波卡尔期间使用的其他相关仪器或设备。留出足够的时间让仪器在开始测量之前进行热平衡和稳定。通常,1 小时就足够了。
  2. 准备一个干净的,系统批准的,玻璃底的培养皿,并填补半满,但不超过三分之二满,与磷酸盐缓冲盐水(PBS),或类似清澈液体。该盘(称为"校准盘")与样品盘分离,将用于定位和校准原子力显微镜 (AFM) 悬臂。
    注:重要的是液体是清澈的,具有低自荧光,以防止任何干扰荧光光谱。建议使用PBS,因为它模仿生物环境。
  3. 准备实验样品盘,使相关的液体已经填补了至少一半满。如果样品是荧光的,请确保被覆盖或在黑暗的地方,直到需要。使用镜头清洁剂和镜头擦拭清洁所有玻璃盘的底部。
  4. 为计算机硬盘上的共和和 AFM 创建数据存储文件夹。

2. 细胞或微生物的选择

  1. 为了产生细菌库存溶液,在5%CO2培养箱中,使用接种循环在15 mL的托德·休伊特酵母(THY)过夜(指数相)中接种链球菌突变菌。
  2. 在隔夜孵育完成前1小时,用1mL的聚-l-lysine溶液涂覆实验样品盘,或足以覆盖玻璃底盘的玻璃部分,并留在生物安全柜中1小时。设置后,吸气聚-l-lysine溶液,并用PBS冲洗餐具3倍。
  3. 经过18~24小时细菌孵育后,用1 mL的细菌悬浮液接种THY,直到达到0.6~0.7的光学密度(接种的典型值为3 mL的THY,每盘1 mL的细菌悬浮液)。在每个聚-l-lysine涂层的菜中加入1 mL的新细菌溶液,孵育1小时。在过去10分钟内,在每道菜中加入1 mL的绿色荧光膜污渍(浓度为1μM)。
  4. 用 PBS 冲洗每道菜 3 倍。在生物安全柜内的室温下,用约1 mL的4%半甲醛溶液轻轻固定细菌15分钟。固定后,用 PBS 冲洗每道菜 3 倍。
  5. 将人类胚胎肾脏(HEK)293细胞储存在液氮中。电镀前在 37°C 水浴下快速解冻。
  6. 在细胞培养培养基中加入1 mL的基膜基质溶液,并在37°C下孵育(5%CO2),1小时。吸溶液,用细胞培养培养剂洗碗。板所需的 HEK 293 细胞数(例如,每 35 mm 培养皿 100,000 个细胞),并添加 2 mL 的细胞培养基。然后,在37°C下孵育(5%CO2)细胞48小时。
  7. 48小时后,将2μL的荧光微管细胞骨架染料(浓度为1倍)加入每个细胞样品盘,孵育30分钟。吸进含有染料的溶液,用PBS洗涤细胞3倍,并加入2mL的细胞培养培养。
  8. 将1 μL的等离子膜染料(浓度为10μM)加入样品盘,孵育30分钟。用 PBS 清洗含有染料 3 倍的溶液,并加入 2 mL 的细胞培养培养。
  9. 将1μL的核酸染料(浓度为10 μM)溶液加入样品盘,孵育30分钟,从而对核进行反染色。用 PBS 清洗含有染料 3 倍的溶液,并添加 2 mL 的培养介质。

3. AFM 程序

  1. 单击计算机上的软件图标打开原子力显微镜 (AFM) 操作软件。
  2. 旋转到或插入低放大率空气目标(建议 10 倍或 20 倍)。在尖端降低和校准过程中,5 mm 或 5 mm 以上的长期工作距离是有益的。
  3. 如果尚未安装,安装所选的单元样本级。对于活样品,使用碟加热器将样品保持在所需的温度。
  4. 装载经过系统批准的清洁培养皿,该培养皿填充半满 PBS(在步骤 1.2 中准备)或类似透明液体(校准盘)。如果样品阶段具有内置扣子,请使用这些扣子,否则,请使用真空润滑脂来稳定样品。
  5. 为所需的数据收集选择适当的 AFM 悬臂,然后按照以下步骤安装。
    1. 使用手套,使用 AFM 芯片安装阶段、钳子和一个小螺丝刀将 AFM 芯片安装到玻璃块中。小心地将 AFM 芯片放在玻璃块上,并定向以使其居中。悬臂,加上AFM芯片的一小部分,应在安装块的可见、非不透明部分。
    2. 拧紧螺钉,用螺丝刀固定芯片,直到芯片紧贴着玻璃块。使用立体显微镜或手持式间谍玻璃检查 AFM 悬臂是否正确定向。根据需要进行调整。正确方向后,将玻璃块以正确的方向放入 AFM 头并锁定到位。
      注:玻璃块内的 AFM 芯片的方向非常重要,因此系统激光器可瞄准悬臂的背面并正确反射到光电探测器上。在放置过程中,请注意不要过度拧紧螺钉,因为此过程可能会导致 AFM 芯片、悬臂或尖端断裂。
  6. 使用共聚焦显微镜的亮场选项,使用对焦旋钮定位校准盘的底部。注意此 z 高度作为菜底与显微镜目标有关的值。
  7. 使用操作 z 步进电机的计算机上的 AFM 系统的电机控制面板,将 AFM 悬臂从样品向上移动 2000 μm。
  8. 用双手轻轻将带 AFM 芯片的 AFM 头放在样品舞台上,确保 AFM 头上的每个垂直点都牢固地固定在 AFM 舞台上指定的凹槽中。一旦 AFM 头就位,目视地看到悬臂支架离盘子有多近。如果它似乎太近,使 AFM 头接触或样品盘顶部 1 mm 范围内,则使用 z 步进电机将 AFM 尖端朝样品降低。
  9. 使用亮场照明,使用 AFM 软件上的 z 步进电机控制面板,缓慢地将 AFM 芯片降到玻璃盘的底部。在仪器平台上找到控制 AFM 头 x-y 或平面中运动的手动千分尺。在视野中校正 AFM 头,调整 AFM 悬臂在视野中的位置。
    1. 由于此时与菜底有关的位置未知,因此下部步骤为 100 ~ 200 μm,以避免将 AFM 尖端撞到培养皿中。通常,尖端需要降低 800 ~ 2000 μm。当尖端降低时,注意显微镜软件视图上出现阴影,这表明 AFM 尖端越来越接近菜底。
    2. 将增量减至 20 ± 50 μm。请务必使用共和软件上的 LUT 面板,在尖端降低到盘中时调整相机图像的查找表 (LUT)。继续使用小步骤降低 AFM 提示,直到它主要对焦。
    3. 确保尖端足够暗,以便可以看到尖端的一般形状并在视野中居中。还要确保尖端看起来模糊,这确认它还没有遇到菜底。
  10. 调整显微镜焦点,使尖端现在聚焦,同时牢记目标的工作距离。在移动到更高的放大目标之前,使用显微镜测量工具通过访问共和软件上的测量工具面板来收集 AFM 悬臂的宽度和长度。注意这些测量结果。
    注意:重要的是不要将目标撞入样品盘的底部,这还可能导致样品盘与 AFM 尖端接触,从而可能损坏样品盘。
  11. 如果存在,请移除激光滤光片,并确保 AFM 激光已打开,以便激光在光学元件中可见。
    1. 使用激光对齐表盘,将激光移动到视野中,并在 AFM 尖端附近移动。激光进入此位置后,更换激光滤光片。
    2. 使用激光定位表盘,将激光放在 AFM 尖端位于悬臂上的背面。此时,激光对准面板应读取大于 0.0 V 的总和信号。如果未获得总和信号,请使用手动控制的镜像旋钮调整镜像,直到屏幕上读取大于 0.0 V 的总和信号。
    3. 在 AFM 悬臂上,在所有方向上少量移动激光器,直到达到最大总和信号,但位置位于 AFM 尖端。设置激光位置后,使用手动控制的偏转表盘将垂直和横向偏转归零。
    4. 观察 AFM 软件上的激光对齐面板,并使用 AFM 头上的垂直和横向偏转旋钮,对齐探测器,使目标居中(十字线中心的红点),并且没有垂直或横向偏转。
  12. 打开 AFM 软件中的校准窗口。输入所有实验特定信息。校准前,请关闭共体显微镜光源并关闭 AFM 外壳(如果适用)以抑制来自室内灯光或房间振动的任何潜在噪音。然后按下校准按钮,自动允许系统校准尖端。校准完成后,悬臂 (N/m) 的刚度及其灵敏度 (nm/V) 将在校准面板中提供。请注意这些,供以后分析。
  13. 使用步进电机将 AFM 悬臂回缩至少 2000 μm。将 AFM 头从舞台上取下并拆下校准盘。旋转到或插入所需的目标。如果系统被编程为在目标之间保持相同的焦平面,将收回目标 10% 的工作距离。如果这是油目标,则将一滴浸入油放在目标的眼睛上。
    注:目标的缩回可降低目标在放置过程中接触样品盘的可能性。
  14. 要牢固地将样品盘固定到位,请使用棉签在样品级内样品环边缘周围涂抹少量真空润滑脂,或使用样品夹。小心地将样品盘装入样品阶段。
  15. 放置样品后,旋转几次,以确保通过润滑脂将盘子密封在样品架上。将目标提升到菜底,直到油刚刚在目标的眼睛上吸芯。
  16. 使用显微镜,没有 AFM 头在舞台上,聚焦成像系统,使样品聚焦。请注意此 z 高度,供参考。
  17. 小心地将 AFM 头更换到平台上。
  18. 使用 z 步进电机,将尖端朝下样品。降低 AFM 提示时,根据需要调整亮场图像中的查找表 (LUT)。降低尖端,直到几乎尖锐。使用手动操作的 AFM 尖端位置微米,移动 AFM 头,使 AFM 尖端位于视野中居中或居中。
    注:由于 AFM 的 z 高度在步骤 3.6 中之前已注意到,因此可以采取较大的步骤来降低 AFM 尖端,但是,油脂已添加到培养皿的底部,并可能向目标添加油,因此此值只是供参考。建议采取 50 × 100 μm 的步骤,并在尖端进入焦点时调整较小
  19. 使用 AFM 头上的手动千分尺重新调整激光位置。如果需要,通过调整各自的旋钮并在样品盘中重新校准 AFM 悬臂,使垂直和横向偏转归零。
    注:如果悬臂在与样品不同的介质中校准,则必须在扫描介质中重新校准,以考虑折射率的潜在变化。此外,由于噪音或温度变化,激光可能会从悬臂的背面漂移。仅根据需要重新调整激光并重新校准,并在使用非接触式校准时在玻璃基板上方的样品盘中重新校准。如果使用接触校准,则使用样品介质重新校准校准盘内部。
  20. 为了实现高质量的共和显微镜图像,请用阻挡所有 AFM 激光激光的滤光片替换当前衰减光滤光片。此滤光片可确保 AFM 激光器的明亮光线不会干扰。
  21. 使用自动方法命令按钮(通常由朝下箭头表示)将尖端降到样品盘的底部。在成像控制面板上设置扫描的大小/面积、分辨率、设定点、z 长度和像素时间(或使用校准/传播值),并开始扫描。
  22. 扫描完成后,将 AFM 芯片提升 50 ~ 100 μm,然后导航到样品盘中的新测量位置。找到新位置后,接近玻璃,然后按照步骤 3.21 和 3.22 再次开始扫描。
  23. 选择" 自动保存" 选项,或通过单击"保存",从每个单独的扫描中手动保存每个生成的 文件

4. 共和程序

  1. 打开共和操作软件。确保所有相关的外设、光源和控制器都已打开并正常工作。
  2. 旋转或插入低放大率(10 倍或 20 倍)的物体以查看样品。确保目标与样品盘位于安全工作距离,如果需要,将目标备份,以避免目标与样品发生任何潜在碰撞。使用棉签,在样品盘环边缘涂抹真空润滑脂。如果使用油目标,将一滴浸入油放在目标的前透镜上
  3. 将所需样品放入样品阶段。旋转样品几次,以确保真空润滑脂与样品级插入或使用样品夹产生紧密粘结。如果使用油目标,将目标提升到盘子的底部,使油只是芯在玻璃底部。为了避免过度漂白,请尽量减少环境照明。
  4. 使用通过相机或目镜的亮场或荧光模式,定位样品并使用对焦旋钮,聚焦在包含多个细胞或单个单元的感兴趣区域。通常,光学显微镜内的视场将大于 AFM 系统上的 x-y 扫描窗口(100 x 100 μm)。使用 AFM 软件中的电机控制面板,调整共声视野内的 AFM 位置,使 AFM 扫描和共声光学成像相同的功能。
    注:在视野中,通常只有几个单元格,因此更容易确定需要哪个单元格来探测。在进行 AFM 时,该单元在 AFM 软件上变得可见,用户可以从那里确定要探测的特定感兴趣区域。
  5. 如果需要,使用基于样品标签的相机或 CLSM 模式,在亮场或荧光中捕获图像,并基于显微镜软件上的对焦旋钮和捕获按钮。
  6. 使用显微镜软件,选择选项或打开面板以启用共合功能(例如,激光和随后的参数)。此选项通常由激光线波长值显示。
  7. 选择适用于用于染色样品的染料的激光线。打开一条或多条激光线,以激发和成像样本中的这些特征。
  8. 将增益设置为优化样品荧光但限制噪声量的值。典型的起始值是增益 70。
  9. 调整激光功率以避免饱和像素,但最大化动态范围。激光功率的典型起动范围为 1 ~ 3 %。
  10. 将针孔尺寸设置为 1 个 Airy 单元,以最大限度地提高光学剖面的分辨率。如果样品变暗且激光功率已高,则打开针孔以增加信号,但代价是降低 z 轴分辨率。
  11. 设置像素停留时间(即扫描速度)。从 2 μs 停留时间开始,如果需要,调整以反映样品亮度。通过让仪器通过奈奎斯特选项按钮和图像中所选的像素数来计算所选目标的像素大小/扫描大小。
    注:在收集 z 堆栈时,较厚样品的停留时间较长会导致过度漂白。
  12. 选择仪器 软件上的"扫描"选项并开始数据收集。
    注:如果仪器有多个激光器,每个激光器都可以独立优化,然后同时运行多荧光图像。
  13. 使用对焦旋钮放大和缩小,并在样品中找到最佳视野。
  14. 使用系统的"捕获"按钮 捕获图像 ,并保存示例的所有必要文件格式到计算机硬盘驱动器或本地外部硬盘驱动器上所需的位置/文件夹。
  15. 继续相应地调整增益、激光功率、针孔尺寸、采样率和其他值,以优化图像。可以激活像素饱和度索引,以检查像素是否过度饱和。如果存在这种超饱和度,可以重新调整增益和激光功率以消除饱和像素。使用 LUT 作为指南进行特定调整。
  16. 如果可能,请使用系统的奈奎斯特采样率(在软件中显示为面板或按钮),以确保以最大可获得分辨率收集图像。
  17. 激活共和系统的 z 堆栈或图像卷收集工具。使用从下到上选项,只有一条激光线,特别是最清晰的激光线,为要测量的体积设置开始和完成平面。
  18. 使用 z 堆栈中平面之间的建议间距,该间距计算为满足奈奎斯特采样标准,以获得仪器和使用的激光线提供的最佳可获得的轴向分辨率。
  19. 当使用多条激光线时,使用最短波长计算间距。采集完成后,将文件保存到相应的文件夹中。
  20. 或者,如果 存在对样品厚度 的先验知识,则通过选择中间平面来定义体积,中间平面是显示最亮和最锐利的平面。在这种情况下,将顶部设置为中间平面上方的样本厚度的一半,将底部设置为中间平面下方的一半厚度。
  21. 此视图字段中的样本收集完成或样本已漂白后,使用电动或手动控制的阶段在样本上查找其他感兴趣的位置,并重复图像收集的步骤。

5. 清理程序

  1. 确保 CLSM 和 AFM 的所有数据文件都保存到正确的位置。
  2. 使用 z 步进电机至少 2000 μm 或到达样品表面的距离收回 AFM 芯片。将 AFM 头从舞台上拆下,并小心地放在其静止位置。
  3. 收回显微镜目标,使它远离样品。如果使用油目标,目标应收回足够远,以便目标与样品基板之间不再接触。
  4. 使用手套,取出样品,从样品盘底部清除润滑脂和油(如果适用)。获得一个新的,干净的,空的培养皿,并填补70%乙醇溶液的一半到四分之三满。将其放入样品架中,更换 AFM 头,使 AFM 芯片在乙醇溶液中浸泡 5 分钟。
  5. 当 AFM 芯片浸泡时,建议开始将实验数据复制到外部硬盘驱动器上。将AFM芯片浸入乙醇溶液中至少5分钟后,取出AFM头并将其放在其静止位置。
  6. 使用手套,拆下 AFM 芯片支架并将其放入安装站。使用带橡胶手柄的钳子小心地取出 AFM 芯片。将用过的尖端放回来自轴外方向的框的位置,以表示已使用。供将来参考,请注意实验中使用的提示。
  7. 将装满乙醇溶液的培养皿从系统中拿出来,处理液体和盘子。使用手套、镜头清洁剂和镜头擦拭,按照标准协议轻轻清洁显微镜目标上的空气。通过清除任何润滑脂清洁样品架。根据生物安全协议处理所有废料,并返回已知位置的工具。
  8. 完成从计算机收集数据并关闭它们。关闭用于实验的所有仪器、附件、外设或其他设备的电源。

Representative Results

Conpokal 技术在图 1A 中以示意图 表示,设置的图像如图 1B 所示。为了通过与 AFM 中相同结构的共生显微镜准确定位生物结构,在安装过程中对两个系统的对齐至关重要。选择熟悉彼此空间要求的知名公司和 AFM 制造商。此外,该技术的成功实施还依赖于良好的染色程序、生物结构的固定以及 AFM 尖端的适当选择。活细胞的高度通常对AFM成像提出了挑战。图 2A中显示了对活的 HEK 细胞的 AFM 扫描。此特定 HEK 细胞的高度约为 10 μm,绿色线扫描(图2B ) 证明了这一点。具有零偏移(尖端位于悬臂的末尾)或大于细胞高度(例如尖端高度≥10 μm)的 AFM 尖端将产生单个细胞的高度解析图像。图 2C中包括了由于 AFM 提示选择不当导致扫描不良的示例。在此图像中,黑色像素出现在单元格的顶点,表示 AFM 压电由于单元格高度较大而出范围。AFM 悬臂的端出现在图像中(圆形正方形),因为与单元格高度相比,尖端偏移与尖端高度不足相结合。AFM 图像中的这些伪影表示应选择不同的 AFM 提示来对单元格进行映像。

这种方法需要荧光染色的高效标记以及活细胞成像的正确探针。我们执行了图 3A 所示的三色共和图像,其中有核污渍(荧光蓝色)、微管污渍(荧光绿色)和亲脂膜污渍(荧光红)。之所以选择这些活细胞探测器,是因为它们的光谱重叠有限,并且与标准滤波器立方体兼容。我们还在图3B中包括了 光明场光学图像

从 AFM 中,对尖端凹痕和纳米机械模型的分析可生成曲面的模量图。图 4A 中用 Hertz 模型拟合和尖端形状的抛物线轮廓(半径 8 nm)构建的模数图示例叠加在图 4A 中单元格形状的 3D 重建(如图 3所示的两个单元格相同)。图4B中显示了激光共和 z 堆栈的相应 3D 投影

该方法也适用于较小的生物结构,包括使用光显微镜难以解决的微生物和纳米特征的单一细菌。一项正在进行的研究利用康波卡尔技术来探索细胞壁内的机械机制,这些机制会影响链球菌突变的抗生素耐药性Conpokal 可促进同细胞样品上的活体、内溶液、数据收集(例如表面形态、弹性模数、粘附强度和表面粗糙度),从而将机械性能与细胞壁组件的存在或缺失进行交叉。图5A,B包括AFM扫描和测量的链球菌突变细菌的模量图。与传统的共微显微镜相比,AFM 在这种尺度上实现了更好的分辨率。

图6 包含一组肠球菌的共和 图像,这些细胞被 染上绿色荧光细胞结构污渍,附着在细胞壁上。 图 5 和图 6 演示了 Conpokal 技术除了对真核细胞外对微生物的适用性。

Figure 1
图 1:Conpokal 设置。
A) 康波卡尔技术的示意图.(B) 仪器设置的图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:活细胞的原子力显微镜。
A) 两个 HEK 细胞的 AFM 图像。(B) HEK 细胞的高度轮廓(A 中的绿线),指示 10 μm 时细胞高度相当大。(C) AFM的星细胞图像不佳,其中AFM压电在细胞的顶点范围,并且有证据表明悬臂端的反向成像。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:活细胞的共和和光明场显微镜。
A) 激光扫描沾有核污渍(荧光蓝色)、微管渍(荧光绿色)和亲脂膜污渍(荧光红)的活的HK细胞的共声显微镜。(B) 对应的亮场光学图像。比例线为 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:AFM的3D渲染和活的 HEK 细胞的共和显微镜的比较。
A) 使用赫兹模型拟合和抛物线轮廓(半径为 8 nm)构建的模数图,用于覆盖在 AFM 单元格的 3D 重建中。(B) 激光共合 z 堆栈的相应 3D 投影,具有核污渍(荧光蓝色)、微管污渍(荧光绿色)和亲脂膜污渍(荧光红)。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:AFM细菌样本。
A) AFM扫描和(B) 测量链 球菌细菌的模 量图. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:细菌样本的共生显微镜。
具有绿色荧光膜 污渍的肠球菌菌 群的共和图像。比例杆为 5 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

Conpokal 是一种先进的、有效的技术,用于收集液态环境中 生物材料的高质量图像和原位机械性能。收集特殊形态和地形图像以及活采样机械特性的能力超越了典型的电子和光显微镜技术。另外,共声显微镜提供光场、荧光和激光扫描共声能力,以实现高质量、详细的样品荧光图像。AFM 提供机械特性,但没有辅助光学元件,则很难导航样品。结合这两个系统,用户可以在实验过程中收集相同细胞的图像和机械性能,与两种独立的仪器不同,这是一个很大的优势。本手稿的目的是告知和指导用户结合 Conpokal 系统的广泛功能,促进生物学、工程学和健康的未来。该协议包括准备仪器、培养介质、菜肴、微生物选择、AFM 程序、共合程序以及清理。成功的实时、解决方案中、Conpokal 会话最关键的步骤是示例固定、明智的提示选择和实时污渍执行。本手稿的讨论部分将详细阐述文化建议、故障排除提示和操作指南,以及 Conpokal 技术的未来工作。文化建议将涵盖关于样品培养、固定和染色的指导。AFM、共和和 Conpokal 提示和指南将讨论尖端选择和校准、分辨率、限制和几乎同时操作。今后的工作包括未来研究途径的前景和潜力。

该协议涵盖活细胞和固定细菌样本的培养、探测和成像。在液体中传导 AFM 时,存在一个挑战源于由于样品阻因和流体动力阻力而导致的悬臂运动阻碍。如果样品未很好地粘附在基材上,则样品中浮于液体中的部分可能会污染悬臂。在这种情况下,测量会受到影响,因为它们是样品弹性粘附性和微力学特性的假设。HEK细胞没有经过固定治疗,但是,S.突变和E.粪便需要额外的固定,类似于其他原核细胞。所选择的细菌表现出活动活动,妨碍了细胞的探测和成像,因此,样品被轻轻、化学地固定,以促进固定。化学固定有替代品,例如过滤膜,物理上捕获孔隙中的单个细胞75。

提示选择也是 AFM 设置和操作的关键组件。在寻求基于生物材料变形的机械性能时,必须考虑悬臂刚度和材料刚度相容性,这是一项不平凡的任务。主要目标是最好地匹配材料的刚度与所选悬臂的刚度。如果悬臂比样品软得多,就会受到太多的偏转。如果悬臂比样品更硬,则 AFM 探测器可能无法捕获如此小的偏转。建议在选择合适的AFM悬臂时,根据实验应用选择。为了在间歇性接触模式下收集详细图像,AFM 尖端在 0.1 - 0.3 N/m 范围内,用于 5 nm ~ 100 nm 内的刚度和尖端半径,对活细胞成像非常有效。建议使用小圆锥形尖端。夏普提示提供了一个小的接触区域和能力缩进进一步有助于收集小的细节和特征在样品形态76。但是,尖锐的尖端也可能有问题,因为它们容易穿刺样品时,设置(例如,设定点,像素时间,接近速度)需要太多的缩进或缩进太快。为了避免高应变率效应,局部应变硬化附近的尖锐尖端,或只是控制接触区域和接近速度,许多人选择使用力光谱与胶体尖端测量弹性模量。

AFM尖端在0.01 - 1.0 N/m的范围内,用于1~5μm的刚度和尖端半径,用于测量活细胞的弹性模态。较大的尖端尺寸(通常是玻璃胶体)提供已知的接触区域,并且不太可能在接触时刺穿细胞。矩形连接器优先于三角形,因为在校准过程中,与三角形几何体基于接触的校准相比,无接触方法可用于矩形几何体。此外,由于 AFM 尖端的微妙性质,建议操作员使用橡胶尖端安装钳子,以减少损坏细腻的 AFM 芯片或安装块的可能性。需要记住的其他参数包括 AFM 尖端的接近速度和对样品的缩进量。一个好的准则是保持缩进到样品厚度(或高度)的10%左右,并选择一个速度,排除悬臂38所经历的潜在流体动力阻力

复杂的实验仪器通常配有路障,需要在仪器设置、校准和操作中进行故障排除。将 AFM 尖端或悬臂撞入样品或样品基板是新用户的常见错误。为了避免此问题,协议建议支持悬臂出 2000 μm。如果前一个用户在实验后清理时忘记退出提示,此步骤可确保提示不会与菜底接触。但是,为本协议中使用的选定菜架选择了 2000 μm 距离。可能需要根据使用的菜架样式选择不同的范围,更大或更小。在激光和探测器对准期间,协议提到对镜旋钮的调整,以最大化总和信号。镜像调节旋钮可能不存在于所有 AM 上。但是,如果存在,则操纵仪器以排除低总和信号的一种方法是调整镜像旋钮,用于解释进行扫描的介质;液体(如水、介质、PBS)或空气。由于光线通过空气和液体的折射率不同,可能需要调整镜旋钮。AFM 悬臂的最大弯曲灵敏度将位于 AFM 尖端的位置,因此,激光(通过其在光电二极管上的位置返回弯曲位置)必须位于 AFM 尖端的位置。根据所选的 AFM 提示,总和信号值可能从 0.3 到 3.0 V 不等。AFM 悬臂上的背面涂层(如 Cr-Au 或 Al)将增加测量的总和信号和灵敏度。

在 AFM 操作期间完成尖端校准时,尖端几何形状是相关的。在非接触式校准和接触校准之间,已观察到良好的一致。如果所选的 AFM 悬臂不是矩形,则需要执行接触校准。请记住,校准尖端的介质必须与样品介质相同。如果这些液体不同,用户必须重新校准。在液体中使用 AFM 尖端时,系统测量的频率应为制造商表示的自然谐振频率的四分之一到三分之一。检查系统是否正确校准尖端的一个好方法就是验证生成的热噪声文件中的值。确保此文件保存到相应的文件夹。如果系统校准困难或无法显示值,请重新校准或稍微调整激光位置,然后重新校准。

总和信号差的另一个原因可能是由于AFM悬臂对齐。当 AFM 芯片安装到玻璃块中时,悬臂的尖端必须保留在小激光窗(光滑的玻璃区域)内。如果芯片向前太远,悬臂自然倾斜的角度可能会导致悬臂上的反射问题,缺少光电探测器并导致总和信号差。如果芯片背得太远,激光将无法反射悬臂背面,导致总和信号差。出于这些原因,可能需要调整安装的 AFM 芯片。此外,在样本的高度方面可能会遇到另一个问题。该协议中使用的 AFM 仪器的最大压电 z 范围(高度)为 15 μm。如果用户发现软件无法收集特定像素中的高度数据和强制贴图,将显示一个黑框,指示系统范围不一(图 2C)。制造此问题的一个方法是将压电高度设置为较低的值,例如 2 或 3 μm,因此 15 μm 范围内的大多数都用于映射单元格的预期高度。在大多数与细胞或细菌相关的实验中,这种技术应该可以修复与 z 范围相关的问题。

对于高度大于 10 ± 15 μm 的高样本,需要扩展 z 范围的实验者可能需要在 AFM 上寻求一个额外的模块。AFM 制造商可在大多数系统以额外费用提供此选项。通过扩展 z 范围,实验人员可以扫描在微尺度上被认为高大的样品,而超出范围值或 AFM 压电电机修改的问题很少。尽管这些模块需要额外付费,但根据制造商的不同,有些模块可以提供额外的高度,在 z 方向上高达 100 μm。如果用户具有长工作距离、高放大率目标或愿意使用空气目标(可能是 20 倍或 40 倍),则使用较高的样本仍可能进行通信。通过降低显微镜目标放大率,工作距离增加,获得距离查看更高样本的顶点。这种对较低放大目标的修改将牺牲分辨率。在本手稿中提及的 Conpokal 设置中,60x TIRF(总内部反射荧光)目标的工作距离超过玻璃底样品盘的盖玻片近 100 μm。

关于本手稿中提到的共体显微镜,讨论了一些重要规定。用于制作本手稿中数字的共和系统实现了 60 倍 TIRF 油目标,数值孔径为 1.49。405 nm、488 nm 和 561 nm 激发波长的激光线用于活细胞样本成像,如图3 和图 4 所示。可使用 Abbe 分辨率方程(Abbe 分辨率(x,y) = 2NA 确定共合一显微镜的衍射极限,其中 α 是 Alexa 488 的激发波长,为 488 nm,NA是孔径冷凝器的数值,即 0.3。因此,确定 272 nm 的轴向分辨率。对于荧光成像,考虑使用两个病例来确定针孔设置为一个通风单元 (AU) 和 0.5 AU 的分辨率。在后一种情况下,针孔关闭,从而产生显著的光损耗,但分辨率增加。共和软件计算横向本机和轴向本机分辨率为 170 nm 和 290 nm 的针孔在 0.5 AU,和 200 nm 和 370 nm 的针孔在 1 AU,系统中引入的球形畸变可以通过去卷积过程来解释,以提高显微镜图像的对比度和分辨率。由于共合显微镜固有的衍射限制,图 6 中细菌菌落的共生图像缺乏图5中细菌 AFM 扫描中细节的匹配分辨率。AFM 提供对纳米级特征和细节的访问,这些特征和细节很难用共和显微镜捕捉。然而,根据所需的荧光分辨率,图5和图6演示了康波卡尔技术除了真核细胞外,对微生物的适用性。

使用共体显微镜的优点是,操作员可以收集样品中具有锐化细节的特定区域的 3D 图像。这些图像通过查看通过 AFM 图像探测的表面和同一区域的共生扫描与 AFM 关联。由于显微镜是倒置的,因此荧光图像会从被探测的样品的对面收集光信息。共声系统中的针孔有助于从一定距离限制在单个平面上,同时过滤掉来自样品其余部分甚至房间的光线。从本质上讲,针孔有助于隔离从样品中感兴趣的单个平面返回的光线。通常,这种感兴趣的平面必须包含强荧光标记,因为对于倒置共体系统,单分子检测将仅限于高分辨率共体显微镜。由于在荧光成像模式下,从反射到目标中的样品中的任何光被收集并用于生成图像,因此无法隔离单个平面,因此不太可取。由于针孔77,共和技术提供了一个更隔离的单平面图像的样本特征的问题。例如,如果 AFM 探测真核细胞的顶点,则可以通过显微镜的激光扫描共生功能(而不是荧光成像模式)隔离相同的表面。建议在透光探测器和 488 nm 激光线辅助下,通过差分干扰对比度模式下通过成像同时监控数据采集过程中细胞的健康/形状。捕获样品的 z 堆栈时,对于上面详细描述的过程,仅调整探测器的增益。测量过程中细胞的任何形态变化(在荧光通道中不一定可见)都表明伪影被引入到测量中。

通过遵循成像技术中使用的最短波长的软件建议,可以获得平面之间的理想间距。通过采用采集软件图像处理模块中可用的去卷积算法,可以有效地提高图像卷中的本机分辨率和信噪比。然而,执行荧光显微镜,选择特定的污渍和染料是至关重要的,以避免早期设置漂白或串扰重叠的激发/发射光谱。有时,用户可能会遇到共和光生成故障。如果用户遇到光发射或激光线路故障,故障排除的一种方法就是重置系统,通常通过重新启动操作软件完成。如果问题仍然存在,则透光探测器可能无法在光显微镜的光路径内移入或移出。重置发射器探测器的位置可能有助于缓解光线收集或激光成像问题。

Conpokal 仪器的重点是为用户提供在液体环境中同时在同一细胞或特征上收集基于活生物材料的光学和力信息的能力。这项工作明确描述了如何用液体进行这些实验,液体是许多生物材料的天然家园,不过,干实验仍然可以使用仪器进行。在培养皿中准备样品时,菜的高度是一个限制。由于容纳 AFM 悬臂的玻璃块的配置,盘子的侧壁高度必须低于 10 mm;如果盘高,仪器将无法将 AFM 尖端降低至样品或基材的表面。

尽管样本大小有限制,但仪器或软件功能在时间延迟方面没有限制。同时进行共和和 AFM,并可使用正确的因素。有助于其近同步能力的限制是指同时执行某些共声显微镜功能和原子力显微镜功能时产生的噪声。在收集 z 堆栈期间移动显微镜目标的电机的振动将在 AFM 探针尖端运动期间添加到信号中。当电机在 z 方向上下移动以照亮样品中的顺序平面时,油目标将增强噪声。因此,建议的协议包括 AFM 扫描和共和 z 堆栈图像的顺序集合。同时CLSM和AFM需要与共体进行固定成像,但是,根据目前的技术,两个仪器的延迟时间可能短于几十秒。从AFM操作切换到共声成像的实际时间是2~4分钟左右,图 2A和4B中采集的图像。此值通过从 33 分钟的总时间中减去两个图像收集时间段(包括开始和完成 AFM 扫描、切换仪器模式以激活共和成像以及开始和完成共和图像 z 堆栈)来确定。

Conpokal 的未来旨在探索新的结构-功能关系,以及敏锐的洞察力的单细胞过程。例如,对 细胞或 细菌样本进行原位药物治疗以确定细胞弹性作用的实验将是生物材料、生物学和生物力学领域的一个进步。治疗治疗到样品盘,而成像和探测将提供知识,样品如何反应治疗在活和仔细控制的环境中,随着时间的推移。纳入一种新的药物或环境挑战将扩大对细胞骨架或细胞器位置如何影响运动、拓扑、僵硬等的理解。Conpokal 的另一个潜在进步是能够对系统进行完全的环境控制。本协议中提到的当前 Conpokal 位于声学外壳内,旨在减少实验室内部的噪音。这种外壳的推进将提供在一种或多种因素内进行测试的能力,不限于无菌环境、温度控制因素,甚至可变重力因素。就目前情况,Conpokal方法为活体、液体生物材料的特性提供了一种有效和有用的方法,但该技术的未来只会进一步推进这些功能。

Disclosures

提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们承认NIH COBRE根据编号P20GM130456提供资金。我们感谢英国光显微镜核心,这是支持副总统的研究,协助这项工作。娜塔莉亚·科罗特科娃博士提供了S.穆坦和E.粪便。第一次提到"Conpokal"来描述共和显微镜和原子力显微镜的结合,是肯塔基大学化学和材料工程系的布拉德·贝伦博士与玛莎·格雷迪博士(相应的作者)讨论,他期待着研讨会演讲者乔纳森·帕姆博士的到来,他于2017年秋天加入肯塔基大学化学与材料工程系。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

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近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜(康波卡尔)
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Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

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