Summary
ここで提示されるConpokal技術のプロトコルは、共焦点と原子間力顕微鏡を単一の器械のプラットホームに結合する。コンポカルは、同じ細胞、同じ領域、近くの同時共焦点イメージングおよび生きた生物学的サンプルの機械的特性を提供する。
Abstract
マイクロスケールおよびナノスケールの機械的特徴付けに利用できる技術は、過去数十年で爆発的に増加しました。走査型透過型電子顕微鏡のさらなる発展から、原子間力顕微鏡の発明、蛍光イメージングの進歩、小材料の研究を可能にする技術が大きく向上しています。コンポカルは、共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡(AFM)を組み合わせたポートマントーで、プローブが表面を「突く」。各技術は、単独で定性的および/または定量的な画像収集に非常に効果的であるが、Conpokalは、ブレンドされた蛍光イメージングと機械的特性を使用してテストする機能を提供します。近くの同時共焦点のイメージ投射および原子間力の調査のために設計されていて、Conpokalは生きている微生物学的サンプルの実験を促進する。ペア計測から追加された洞察は、AFMによる測定された機械的特性(例えば、弾性率、接着性、表面粗さ)を細胞内成分または共焦点顕微鏡で観察可能な活動と共に局在化します。この研究は、レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡の動作のためのステップバイステッププロトコルを提供し、同時に、同じ細胞、同じ領域、共焦点イメージング、および機械的特性を達成する。
Introduction
マイクロスケールまたはナノスケールの機械的評価ツールは、単一細胞または微生物レベルの変形特性を明らかにするためにしばしば採用され、細胞内プロセスおよび構造特徴を可視化するために別々の高解像度顕微鏡ツールが採用されています。コンポカルは、レーザースキャン共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡(AFM)を単一の器械プラットフォームに組み合わせたものです。コンポカール技術は、最初に非生物学的ポリマーシステムで実施され、そこで目標は軟質表面に接触する硬質表面の接着、弾力性、および表面張力を決定することであった。共焦点画像は、ポリマーがハードプローブ1,2からどのように変形し、接着し、放出するかを視覚的にレンダリングする。ポリマーから生物学的サンプルまで、この技術は、ほぼ同時生細胞または微生物共焦点イメージングおよびAFMの機会を提供する。
細胞の弾力性の変化は、多くのヒト疾患の病因に関与している3 血管障害を含む4マラリア5,6、鎌状赤血球貧血7関節 炎8喘息9、および癌6,10,11,12,13,14,15.細胞の力学を測定するための一般的な技術は、磁気ビーズの使用を含みます16,17、光ピンセット18,19、マイクロピペット吸引8,20,21,22、および AFM11,23,24,25,26.AFMを生細胞に適用して以来、細胞の地形を特徴付けるために容易に適応された27,28 機械的特性と同様11,24,29,30,31 ナノスケールの精度で。AFMはマイクロレロジーに適応されています32,33、周波数変調34,35、クリープ25,36,37 様々な細胞株の粘弾性特性を研究する実験を行う。適切なナノコンタクトモデルの使用は、AFM生成力のインデンテーション測定からの定量的弾性値の抽出に重要である1,2.細胞弾性に対する細胞骨格系薬物の影響を調べるAFM研究は、弾性率が高い影響を受けることを示している38.弾性率の測定に基づいて、多くの研究者は、癌細胞が非形質の細胞よりも柔らかいことを示しています11,38,39.変形性の増加は、癌細胞が組織を転移し浸透させる能力において顕著な役割を果たす可能性が高い40.このような行動は細胞の細胞骨格組織における修飾によって調節される38,41,42.癌に加えて、機械的依存性疾患の別のクラスは呼吸器疾患である。例えば、急性呼吸ストレス症候群は、毎年ますます多くの人間に影響を与えます。患者が機械的換気を行い、高濃度の酸素を持つ場合、その状態が悪化することが示されている43.AFMを用いて肺胞上皮マクロファージを観察する一連の研究では、酸素が豊富な環境を加えて、アクチン形成による細胞の剛性が増加することを発見した。AFMが、細胞レベルの呼吸機能に対する大気環境への影響を詳細に理解し、最終的には人間の治癒と健康に与える影響の典型的な例44,45,46.創傷に向かう移行中の上皮細胞の剛性もAFMを介して評価することができ、弾性率の変動は将来の細胞広がりを知らせるために起こること47,48.したがって、病気の細胞が健康細胞とどのように異なり、相互作用するかを理解するために、細胞力学を定量的に測定する現実的な必要性があります。
AFMは、接着特性や表面構造の研究にも使用されます。原子間力顕微鏡には、接触力学を用いてサンプルに関する情報を収集するための様々なモードがあります。生きた生物サンプルの主な目的の2つは、定量的機械的特性値(例えば、弾性率、接着力)と、マップ面の高さを得ることです。これらのモードには、タッピングモード(断続的接触とも呼ばれる)が含まれ、試料表面と接触モードとを間欠的に接触させる一定の片持ち振幅を維持し、カンチレバーを上げたり下げたりして一定の偏向を維持する49。AFMシステム上のフォースマッピングを使用して、接着マップを収集することができます。片持ちはサンプルをある程度の力にインデントし、それから引き込まれる。退位に抵抗する力を検出器で測定し、力変位グラフを生成する。接着力は、引き込み時に測定される最大力です。表面形態はマイクロまたはナノレベルのサンプルの詳細なビューを提供する。片持ちは、各ピクセルでカンチレバーの動きによって捕捉されたインデントと偏向に基づいてサンプル全体のラスタースキャンを完了し、マイクロサイズとナノサイズの特徴を明らかにする。AFMを用いると、ペプチドグリカン構造50などの小さな特徴の大きさ、ポリマー鎖アライメント51、フラメラ52、ラメリポディア53、及びフィリポディア54が測定できる。AFMのパワーは力変位曲線と非光学的トポロジカル画像にありますが、共焦点顕微鏡は蛍光標識されたサンプルの詳細なイメージングを提供します。
共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、生細胞、固定細胞、および組織55、56、57をイメージングするための支配的な技術である。CLSMは、1955年から生物学的イメージングに採用されており、創業以来58,59年に入り込んできました。共焦点顕微鏡の動作原理(すなわち、ピンホールを通した焦点外光の拒絶)はほぼ同じままであるが、技術的な実装は非常に多様な56、57、58、60となっている。共焦点イメージングは、マルチポイント走査を介して、回転ディスクシステム61のように、単一のレーザー光の点走査、ライン走査62のように、または多要素検出器57を介して、その後のピクセル再割り当てで点広がり関数を撮像することができる。共焦点イメージングの有用性を拡大する最近の進歩には、レーザースキャン機能、高速共鳴スキャン、および高感度検出器63、64、65が含まれる。すべての共焦点システムが広視野顕微鏡に対して持っている利点は、特に厚いサンプルで、より詳細なz軸で光学断面を行う能力です。カメラベースの検出を用いたワイドフィールド顕微鏡は、焦点面から放出される光を収集し、同時に照明経路の至る所から放出される光を収集します。ピンホールを閉じることで、信号を低減する費用で、軸方向と横方向の両方の分解能を66に増加させることができる。CLSMでは、励起レーザーがx-y視野を横切ってスキャンされるため、画像は発光信号収集を通じてピクセル単位で構築されます。サンプルの z 軸に沿った複数の x-y 平面のコレクションを使用して、サンプル57,67の 3 次元アーキテクチャを再構築できます。共焦点顕微鏡は、蛍光タンパク質の導入と併せて、細胞生物学68の理解に革命を起こしました。例えば、神経科学69に欠かせないツールとなっている。CLSMは、クリアされた組織を観察し、免疫染色された脳および神経ネットワークアーキテクチャ70の包括的な画像を得るために定期的に使用される。このアプリケーションは、脳内のニューロンとグリア細胞間のシナプス接触とコミュニケーションに新たな洞察をもたらしました71.脳細胞から小胞まで、蛍光染色プロトコルは、治療技術72,73の進歩のための共焦点顕微鏡による細胞機能の検査および捕捉をサポートする。
これらは個別に印象的で多用途なツールですが、共焦点と原子間力顕微鏡(Conpokal)の組み合わせは、研究者が様々な細胞小器官およびそれぞれのダイナミクスの観察と地形およびマイクロ機械的細胞/組織特性をユニークに相関させることができます。ペアドインストルメンテーションを使用すると、ユーザーは本質的に、調査中の内容を「見る」ことができます。1つのテクニックよりも大きな利点があります。Conpokal を使用すると、AFM を介したフォース マッピングが共焦点画像上に重ね合わされ、例えば、細胞の剛性、接着性、または形態をサンプル内の細胞骨格構造に関連付けます。Conpokal法の全体的な目標は、研究者が単一のプラットフォームで画像と物質特性データの両方を提供し、簡潔で効果的な方法で生きたサンプルを研究するためのプラットフォームを提供することです。この研究では、サンプルの適切な選択と準備、計器のセットアップ、片持ち器のキャリブレーションを含むConpokalの動作を実証し、トラブルシューティングを成功させるためのガイドラインを提供します。プロトコルの後、同じ細胞共焦点およびAFMを通じて、成功した細菌および細胞AFM高さマッピング、細菌および細胞AFM率マッピング、および多重標識細胞の共焦点イメージングを含む代表的な結果を提供する。最後に、Conpokalの手順の重要なステップ、トラブルシューティングの推奨事項、技術の制限、意義、および将来の方法の見通しについて説明します。
Protocol
1. 楽器、文化メディア、食器類の準備
- コンフォーカル顕微鏡と原子間力顕微鏡の両方の電源と、コンポカルの間に使用される他の関連機器やデバイスの電源をオンにします。測定を開始する前に、測定器が熱的に平衡化し、安定するのに十分な時間を与えます。典型的には、1時間で十分である。
- 1つのクリーンな、システム承認のガラス底のペトリ皿を準備し、半分いっぱいに充填しますが、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または同様の透明な液体で、3分の2以下がいっぱいです。この皿(「キャリブレーション皿」と呼ばれる)は、サンプル皿とは別に、原子間力顕微鏡(AFM)の片持ち体を見つけて較正するために使用されます。
注:液体が透明で、蛍光スペクトルとの干渉を防ぐために、低い自己蛍光を有することが重要です。PBSは生物学的環境を模倣するので推奨されます。 - 関連する液体が少なくとも半分いっぱいの皿を満たすような実験的なサンプル料理を準備する。サンプルが蛍光灯の場合は、必要になるまで覆われたり暗い場所に置かれていることを確認してください。レンズクリーナーとレンズワイプを使用して、すべてのガラス皿の底部をきれいにします。
- コンピュータのハード ドライブ上に、コンフォーカルおよび AFM 用のデータストレージ フォルダを作成します。
2. 細胞または微生物の選択
- 細菌ストック溶液を作成するために、接種レンサ球菌変異体細菌を接種ループを用いて、トッド・ヒューイット酵母(THY)の15 mLで一晩(指数相の場合)5%CO2インキュベーターに。
- 1時間前に一晩のインキュベーションが完了し、ポリl-リジン溶液の1 mLまたはガラス底皿のガラス部分をカバーし、1時間のバイオセーフティキャビネットに残すのに十分な実験的なサンプル皿をコーティングします。設定後、ポリl-リジン溶液を吸引し、PBSで3倍の食器を洗いすす。
- 細菌インキュベーションの18 - 24時間後、0.6 -0.7の光学密度が達成されるまで細菌懸濁液の1 mLでTHYを接種する(接種のための典型的な値は、皿あたりの細菌懸濁液の1 mLでTHYの3 mLである)。各ポリl-リジンコーティング皿に新しい細菌溶液1 mLを加え、1時間インキュベートします。最後の10分の間に、各皿に1mLの緑色蛍光膜染色(1μMの濃度)を加えます。
- 各皿を3倍にPBSで洗いすします。バイオセーフティキャビネット内の室温で15分間、4%パラホルムアルデヒド溶液の約1mLで細菌を静かに固定します。各皿3倍を固定後にPBSで洗いす。
- ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞を液体窒素に保存する。めっきする前に37°Cの水浴で速い解凍を行います。
- 細胞培養液中の基膜マトリックス溶液1 mLを各細胞サンプル皿に加え、37°Cで1時間インキュベート(5%CO2)します。溶液を吸引し、細胞培養培地で洗う。必要な数のHEK 293細胞(例えば、35mm皿あたり10万個の細胞)をプレートし、2mLの細胞培養培地を加えます。その後、細胞を37°Cで48時間インキュベートする(5%CO2)。
- 48時間後、各細胞サンプル皿に蛍光微小管細胞骨格色素(濃度1x)を2μL加え、30分間インキュベートします。色素を含む溶液を吸引し、細胞3xをPBSで洗浄し、2mLの細胞培養培地を添加した。
- サンプルディッシュに1μLのプラズマ膜色素(濃度10μM)を加え、30分間インキュベートします。色素3xを含む溶液をPBSで洗浄し、2mLの細胞培養培地を加える。
- サンプルディッシュに1μLの核酸色素(濃度10μM)溶液を加えて核核に対抗し、30分間インキュベートします。3xの染料を含む溶液をPBSで洗浄し、2mLの培養培地を加える。
3. AFM手順
- コンピュータ上のソフトウェアアイコンをクリックして、原子間力顕微鏡(AFM)動作ソフトウェアを開きます。
- 低倍率の空気の目的(推奨 10x または 20x)に回転または挿入します。5 mm 以上の長時間の作業距離は、チップの低下とキャリブレーションの際に有益です。
- 選択したセル・サンプル・ステージをまだインストールしていない場合は、マウントします。ライブサンプルの場合は、皿ヒーターを使用してサンプルを希望の温度に保ちます。
- PBS(ステップ1.2で調製)または同様の透明な液体(キャリブレーション皿)の半分充填されたクリーンな、システム承認ペトリ皿をロードします。サンプルステージにクラスプが内蔵されている場合は、これらを使用し、それ以外の場合は真空グリースを使用してサンプルを安定させ、
- 目的のデータ収集に適した AFM 片持ちレバーを選択し、以下の手順に従ってインストールします。
- 手袋を使用して、AFMチップ取り付けステージ、ピンセット、および小さなドライバーを使用して、AFMチップをガラスブロックに取り付けます。慎重にガラスブロックにAFMチップを配置し、それが中央になるようにそれを向けます。片持ちは、AFMチップの非常に小さな部分を加えて、取り付けブロックの可視、非不透明な部分にする必要があります。
- チップがガラスブロックにぴったりとぴったりになるまでネジを締めて、スクリュードライバーでチップを固定します。ステレオ顕微鏡またはハンドヘルドスパイグラスを使用して、AFM片持ちレバーの向きが正しいことを確認します。必要に応じて調整します。適切に向けた後、適切な方向でガラスブロックをAFMヘッドに配置し、所定の位置にロックします。
注:ガラスブロック内のAFMチップの向きは、システムレーザーがカンチレバーの裏側を目指し、光検出器に正しく反射するように重要です。この手順では、AFMチップ、片持ちレバー、またはチップが破損する可能性がありますので、配置中にネジを締め過ぎないように注意してください。
- 共焦点顕微鏡の明視野オプションを使用して、フォーカスノブを使用してキャリブレーション皿の底部を見つけます。この z 高さを顕微鏡の目的に対して皿の底が位置する値として注意してください。
- Zステッパーモーターを作動させるコンピュータ上のAFMシステムのモーターコントロールパネルを使用して、AFM片持ちレバーをサンプルから2000μm上方に移動します。
- 両手を使用して、AFMチップを搭載したAFMヘッドをサンプルステージにそっと置き、AFMヘッドの垂直ポイントのそれぞれがAFMステージの指定された溝にしっかりと設定されていることを確認します。AFMヘッドが所定の位置に置かれたら、片持ちホルダーが皿にどれだけ近いかを視覚的に見ます。AFMヘッドが接触しているか、サンプル皿の上部から1mm以内にあるように近すぎると思われる場合は、サンプルに向かってAFMチップを下げる前にzステッパーモーターを使用して戻します。
- 明視野照明を使用して、AFMソフトウェアのzステッパーモーターコントロールパネルを使用して、ガラス皿の底部にAFMチップをゆっくりと下げます。計器プラットフォーム上のAFMヘッドのx-yまたは面内の動きを制御するマニュアルマイクロメータを見つけます。カンチレバーが見えてくるとAFMヘッドを補正することで、視野内のAFM片持ち面の位置を調整します。
- この時点では皿の底に関する位置は不明なので、ペトリ皿にAFMチップをクラッシュさせないように100〜200 μmのステップで低くします。通常、チップは800〜2000 μm下げる必要があります。先端が下がるにつれて、AFM先端が皿の底に近づいているのを示す顕微鏡ソフトウェアビューに影が現れるのを見てください。
- 20 ~50 μm に増分を減らします。カメライメージの参照テーブル(LUT)は、先端が皿の中に下がるように、コンフォーカルソフトウェアの[LUT]パネルを使用して調整してください。小さなステップを使用して AFM チップを下げて、ほとんどがフォーカスされるまで引き続き下げます。
- 先端が十分に暗く、一般的な形状が視野に見えて中央に表示されるようにします。また、チップがぼやけて表示され、まだ皿の底に遭遇していないことを確認します。
- 先端が焦点を合わせ、目的の作業距離を念頭に置いて顕微鏡の焦点を調整します。より高い倍率の目的に移動する前に、顕微鏡測定ツールを使用して、共焦点ソフトウェアの測定ツールパネルにアクセスしてAFM片持ち器の幅と長さを収集します。これらの測定値に注意してください。
注:サンプル皿がAFMチップに接触し、潜在的に損傷を与える可能性のあるサンプル皿の底に目的をクラッシュさせないようにすることが重要です。 - レーザー光フィルターが存在する場合は、レーザー光フィルタを取り外し、AFMレーザーがオンになっていることを確認して、光学でレーザー光が見えるようにします。
- レーザーアライメントダイヤルを使用して、レーザーを視野に移動し、AFMチップの近くに移動します。レーザーがこの位置に入ったら、レーザー光フィルターを交換してください。
- レーザーアライメントダイヤルを使用して、AFMチップがカンチレバーにある場所の裏側にレーザーを置きます。この時点で、レーザー位置合わせパネルは、0.0 V より大きい合計信号を読み取る必要があります。合計信号が得られない場合は、手動で制御されたミラーノブを使用して、0.0 Vより大きい信号が画面で読み取られるまでミラーを調整します。
- 最大合計信号が達成されるまで、AFM片持ち面のすべての方向に少量のレーザーを動かしますが、位置はAFM先端にあります。レーザー位置を設定したら、手動で制御されたたわみダイヤルを使用して、垂直および横方向の偏向をゼロにします。
- AFMソフトウェアのレーザーアライメントパネルを観察し、AFMヘッドの垂直および横方向の偏向ノブを使用して、ターゲットが中央(十字線の中心に赤い点)になり、垂直または横方向の偏向がないように検出器を位置合わせします。
- AFMソフトウェアでキャリブレーションウィンドウを開きます。すべての実験固有の情報を入力します。キャリブレーションを行う前に、コンフォーカル顕微鏡の光源をオフにし、該当する場合はAFMエンクロージャを閉じて、部屋の光や部屋の振動から発生する潜在的なノイズを減衰させます。次に、キャリブレーションボタンを押して、システムが自動的にチップをキャリブレーションできるようにします。キャリブレーションが完了すると、カンチレバー(N/m)の剛性と感度(nm/V)がキャリブレーションパネル内に表示されます。後で分析するために、これらをメモします。
- ステッパーモーターで少なくとも2000 μmのAFM片持ちレバーを引き込みます。AFMヘッドをステージから外し、キャリブレーション皿を取り外します。目的の目標に回転または挿入します。システムが目標間で同じ焦点面を維持するようにプログラムされている場合は、作業距離の目標10%を撤回します。これが油の目的である場合は、目的の目に浸漬油の1滴を置きます。
注: 目的の取り消しは、配置中にサンプル皿に接触する客観的な可能性を低減します。 - サンプル皿を所定の位置に固定するには、綿棒を使用してサンプルステージ内のサンプルリングの端に真空グリースの小さなダブを塗布するか、サンプルクリップを使用します。サンプル皿を慎重にサンプルステージに積み込みます。
- サンプルを入れたら、それを数回回転させて、グリスを介してサンプルホルダーに皿の良好なシールを確保します。油が目的の目の上にウィックするまで、皿の底に目的を上げます。
- 顕微鏡を用いて、ステージ上にAFMヘッドを置かずに、サンプルが焦点を合わせるようにイメージングシステムをフォーカスする。参照用にこの z 高さに注意してください。
- AFMヘッドを慎重にプラットフォームに交換してください。
- zステッパーモーターを使用して、サンプルに向かって先端を下げます。AFM チップが下がった場合は、必要に応じて、明視野の画像でテーブル (LUT) を検索します。先端をほぼ鋭くなるまで下げます。手動で操作されたAFMチップ位置マイクロメータを使用して、AFM先端が中央または左の視野中央に置かるようにAFMヘッドを動かします。
注:AFMのz高さはステップ3.6で前に指摘されていたので、AFM先端を下げるためにより大きなステップが取られるかもしれませんが、グリースは皿の底に加え、潜在的に目的に油を加えられたので、この値は参照のためだけです。50 ~ 100 μm のステップをとり、チップが焦点を合わせると調整を小さくすることをお勧めします。 - AFMヘッドの手動マイクロメーターを使用して、レーザー位置を調整します。必要に応じて、それぞれのノブを調整して垂直および横方向の偏向をゼロにし、サンプル皿のAFM片持ち体を再調整します。
注: カンチレバーがサンプルとは異なる媒体で較正された場合、屈折率の潜在的な変化を考慮して、スキャン媒体で再較正する必要があります。さらに、レーザーは騒音や温度変化のためにカンチレバーの裏側からドリフトする可能性があります。レーザーを再調整し、必要に応じて再較正し、非接触キャリブレーションを使用する場合はガラス基板上のサンプル皿に再キャリブレーションします。接触キャリブレーションを使用する場合は、サンプル媒体を使用してキャリブレーション皿の内部を再調整します。 - 高品質の共焦点顕微鏡画像を実現するには、電流減衰光フィルタを、すべてのAFMレーザー光を遮断するフィルタに交換してください。このライトフィルターはAFMレーザーの明るい光からの干渉を保障しない。
- 一般的に下向きの矢印で示される自動アプローチコマンドボタンを使用して、サンプル皿の底部に先端を下げます。スキャンのサイズ/エリア、解像度、設定ポイント、z の長さ、ピクセル時間(またはキャリブレーション/伝播された値を使用)をイメージングコントロールパネルで設定し、スキャンを開始します。
- スキャンが完了したら、サンプル皿の新しい測定位置に移動する前にAFMチップ50–100 μmを持ち上げます。新しい場所が見つかったら、ガラスに近づき、手順3.21と3.22に従って再スキャンを開始します。
- [ 自動保存 ] オプションを選択するか、[保存] をクリックして、個々のスキャンから生成された各ファイルを手動で 保存します。
4. 共焦点手順
- コンフォーカル動作ソフトウェアを開きます。関連するすべての周辺機器、光源、およびコントローラの電源が入っており、正常に機能していることを確認します。
- サンプルを表示するには、低倍率(10xまたは20x)の目的を回転または挿入します。目的がサンプル皿の場所から安全な作業距離にあることを確認し、必要に応じて、目的とサンプルの潜在的な衝突を避けるために目的をバックアウトします。綿棒を使用して、サンプル皿リングの端の周りに真空グリースをダブ。油の目的を使用する場合は、目的のフロントレンズに浸漬油の一滴を置きます
- 目的のサンプルをサンプルステージに配置します。サンプルを数回回転して、真空グリースがサンプルステージの挿入部に密着した結合を生成しているか、サンプルクリップを使用していることを確認します。油の目的を使用する場合は、油がちょうどガラスの底の上にウィックするように皿の底に目的を上げます。過度の漂白を避けるために、周囲の照明を最小限に抑えます。
- カメラまたは接眼レンズを介して明視野または蛍光モードを使用して、サンプルを見つけ、フォーカスノブを使用して、複数の細胞または単一の細胞を含む対象領域に焦点を当てます。光学顕微鏡内の視野は、AFMシステムのx-y走査ウィンドウ(100 x 100 μm)よりも大きくなることがよくあります。AFMスキャンと共焦点光学が同じ機能をイメージングするように、AFMソフトウェアのモーターコントロールパネルを使用して、共焦点分野内のAFM位置を調整します。
注: 視野内では、通常はセルが数個しかないので、どのセルを探す必要があるかを簡単に判断できます。AFMが実施されると、セルはAFMソフトウェア上で見えるようになり、そこから、ユーザーはプローブに関心のある特定の領域を特定することができます。 - 必要に応じて、サンプルのラベル、フォーカスノブ、および顕微鏡ソフトウェアのキャプチャボタンに基づいて、カメラまたはCLSMモードを使用して明視野または蛍光の画像をキャプチャします。
- 顕微鏡ソフトウェアを使用して、オプションを選択するか、パネルを開いて共焦点機能(例えば、レーザーとその後のパラメータ)を有効にします。このオプションは、通常、レーザー線の波長値によって示されます。
- サンプルの染色に使用する染料に適したレーザーラインを選択します。1 つまたは複数のレーザー ラインをオンにして、サンプル内のフィーチャを励起してイメージします。
- ゲインを、サンプルの蛍光を最適化する値に設定しますが、ノイズの量を制限します。一般的な開始値はゲイン 70 です。
- 飽和ピクセルを避けるが、ダイナミックレンジを最大化するためにレーザーパワーを調整します。レーザーパワーの一般的な開始範囲は1~3%です。
- ピンホールのサイズを 1 Airy ユニットに設定して、光断面の解像度を最大化します。サンプルが薄暗く、レーザーパワーがすでに高い場合は、ピンホールを開けて、z軸の分解能を下げる費用で信号を増やします。
- ピクセルのドウェル時間(すなわち、スキャン速度)を設定します。2 μs のドウェル時間から始めて、必要に応じてサンプルの明るさを反映するように調整します。ナイキストオプションボタンと画像内の選択したピクセル数を使用して計測器に計算させることで、選択した目的のピクセルサイズ/スキャンサイズを選択します。
注: 厚いサンプルの長いドウェル時間は、z スタックが収集される際に過度の漂白につながる可能性があります。 - 計測器のソフトウェアで[スキャン ]オプションを選択し、データ収集を開始します。
メモ:機器に複数のレーザーがある場合、それぞれを個別に最適化し、マルチ蛍光画像に対して同時に実行することができます。 - フォーカスノブを使用してズームインとズームアウトを行い、サンプル内の最適な視野を見つけます。
- システムの キャプチャ ボタンを使用してイメージをキャプチャし、コンピューターのハード ドライブまたはローカルの外付けハード ドライブ上の目的の場所/フォルダーにサンプルのすべての必要なファイル形式を保存します。
- ゲイン、レーザーパワー、ピンホールサイズ、サンプリングレートなどの値を調整し続けて、画像を最適化します。ピクセルの彩度インデックスをアクティブにして、ピクセルが飽和状態になっているかどうかを確認できます。この過飽和が存在する場合、ゲインとレーザーパワーを再調整して飽和ピクセルを排除できます。特定の調整を行うガイドとして、この LU を使用します。
- 可能であれば、ソフトウェアに表示されるシステムのナイキストサンプリングレートをパネルまたはボタンとして使用して、画像が最大解像度で収集されるようにします。
- 共焦点システムの z スタックまたはイメージボリューム収集ツールをアクティブにします。ボトムツートップオプションを使用して、レーザーラインを1本のみ、特にサンプルのフィーチャを最も鮮明に照らすレーザーラインを使用して、測定するボリュームの開始面と終了平面を設定します。
- Z スタック内の平面間の推奨間隔を使用して、計測器および使用したレーザーラインで得られる最適なアキシャル解像度のナイキストサンプリング基準を満たすために計算されます。
- 複数のレーザラインを使用する場合は、最短波長を使用して間隔を計算します。取得が完了したら、ファイルを適切なフォルダに保存します。
- または、サンプルの厚さに 関する予備知識 がある場合は、最も明るくシャープに見える中央平面を選択して、体積を定義します。この場合、上部を中央平面の上のサンプル厚さの半分に、下部を中央平面の下の厚さの半分に設定します。
- この視野でのサンプル収集が完了した後、またはサンプルが漂白された後、電動または手動で制御されたステージを使用してサンプル上の別の対象場所を見つけ、画像収集の手順を繰り返します。
5. クリーンアップ手順
- CLSM と AFM の両方からのすべてのデータ・ファイルが適切な場所に保存されていることを確認します。
- Zステッパーモーターを少なくとも2000 μm、またはサンプル表面に到達するために移動した距離を使用してAFMチップを引き込みます。AFMヘッドをステージから取り外し、慎重に休憩場所に置きます。
- 顕微鏡の目的を引き込み、サンプルから遠く離れる。油の目的が使用された場合、目的とサンプル基板との間に接触がなくなるように、目的を十分に引き込む必要があります。
- 手袋を使用して、サンプルを取り出し、サンプル皿の底からグリースと油をきれいにします。新しい、清潔で空のペトリ皿を取得し、70%エタノール溶液1分の1〜4分の3でそれを満たします。サンプルホルダーに入れ、AFMヘッドを交換して、AFMチップをエタノール溶液に5分間浸します。
- AFMチップが浸漬している間、実験データを外付けハードドライブにコピーすることをお勧めします。AFMチップをエタノール溶液に5分以上浸漬した後、AFMヘッドを取り外し、その安静所に置きます。
- 手袋を使用して、AFMチップホルダーを取り外し、取り付けステーションに設置します。ゴムグリップ付きピンセットを使用して慎重にAFMチップを取り外します。使用した先端を、軸外の向きから来たボックスの位置に戻して、使用されたことを示します。今後の参考のために、実験で使用されたチップをメモしておきます。
- エタノール溶液を充填したペトリ皿をシステムから取り出し、液体と皿を処分します。手袋、レンズクリーナー、レンズワイプを使用して、標準的なプロトコルに従って顕微鏡の目的から油を静かに洗浄します。グリスを取り除いてサンプルホルダーを清掃します。バイオセーフティプロトコルに従ってすべての廃棄物を廃棄し、既知の場所に工具を返却します。
- コンピュータからのデータ収集を終了し、シャットダウンします。実験に使用するすべての機器、アクセサリ、周辺機器、またはその他のデバイスの電源を切ります。
Representative Results
コンポカル手法は 図 1A で概略的に表現され、セットアップのイメージを 図 1Bに示します。AFMの同じ構造を用いた共焦点顕微鏡を介して生物学的構造を正確に併発させるためには、設置時の2つのシステムのアライメントが重要です。互いの空間要件に精通している評判の良いコンフォーカルおよびAFMメーカーを選択します。さらに、この技術の成功した実装は、良好な染色手順、生物学的構造の固定化、およびAFM先端の適切な選択に依存しています。生細胞の高さは、多くの場合、AFMイメージングのための課題を提示します。生きている HEK セルの AFM スキャンを 図 2Aに示します。この特定のHEKセルの高さは約10μmで、ラインスキャンを緑色で示した(図2B)。オフセットがゼロ(チップは片持ちの端)または先端の高さがセルの高さより大きい(例えば、先端の高 ≥さ10μm)のAFM先端は、個々の細胞の高度に分解された画像を生成します。AFMチップの選択が不適切なためのスキャンが不十分な例が 図2Cに含まれています。この画像では、AFMピエゾが大きなセルの高さのために範囲外であることを示すセルの頂点に黒いピクセルが現れました。AFM片持ち体の端部は、セルの高さと比較してチップの高さが不十分と組み合わされた先端オフセットのために画像(丸い正方形)に現れました。AFM 画像内のこれらのアーティファクトは、セルを画像化するために異なる AFM ヒントを選択する必要があることを示します。
この方法では、生細胞イメージングのための正しいプローブと共に蛍光染色における効率的な標識が必要です。 図3A に示す3色の共焦点像を、核染色(蛍光青)、微小管染色(蛍光緑)、脂溶性膜染色(蛍光赤色)で行った。これらのライブセルプローブは、スペクトルの重複が限られており、標準フィルタキューブとの互換性があるために選択されました。 また、図3Bには明視野光学画像も含まれています。
AFMから、ナノメカニカルモデルと共に先端の凹みを解析し、表面の弾性率マップを生成する。先端形状に対してヘルツモデルの適合度と放物線プロファイル(半径8nm)を用いて構築されたモジュラスマップの例は 、図4A のセル形状の3D再構成に重ね合わせて示されている( これは図3に示されている2つのセルと同じである)。レーザー共焦点zスタックの対応する3D投影を 図4Bに示します。
この方法は、光顕微鏡を使用して解決することが困難なマイクロおよびナノスコピック特徴を有する単一細菌を含む、より小さな生物学的構造にも適している。現在の研究では、コンポカル技術を用いて、 レンサ球菌ミュータンs.74 細胞壁成分の操作が形態および抗生物質耐性の変化をもたらした抗生物質耐性に影響を与える細胞壁内の機械的メカニズムを探求する。Conpokalは、同じ細胞サンプル上で生きた、インソリューション、データ収集(例えば、表面形態、弾性率、接着強度、表面粗さ)を容易にし、細胞壁成分の有無と機械的特性を結合する。 図5A,B は 、ストレプトコッカス・ミュータンス 菌のAFMスキャンおよび測定されたモジュラスマップを含む。従来の共焦点顕微鏡よりもAFMを用いたこの尺度での解像度の向上が達成されました。
図6 は、細胞壁に付着する緑色の蛍光細胞構造染色で染色された エンテロコッカス・フェカリス のコロニーの共焦点像を含む。 図5 および 図6 は、真核細胞に加えて、コンポカル法の微生物への適用性を示す。
図1:コンポカルのセットアップ。
(A) コンポカル技術の概略図。(B)機器のセットアップのイメージ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2 生細胞の原子間力顕微鏡
(A) 2つのHEK細胞のAFM画像。(B)セルの高さが10μmでかなり大きいであることを示すHEKセルの高さプロファイル(Aの緑色の線)。(C)AFMピエゾが細胞の頂点で範囲を外れ、カンチレバー末端の逆イメージングの証拠があるアストロサイト細胞の貧弱なAFM画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生細胞の共焦点顕微鏡と明視野顕微鏡
(A)核染色(蛍光ブルー)、微小管染色(蛍光緑)及び親油性膜染色(蛍光赤)で染色された生きたHEK細胞のレーザー走査共焦点顕微鏡。(B)対応する明視野光学画像。スケールバーは10 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:生きたHEK細胞のAFMと共焦点顕微鏡の3Dレンダリングの比較
(A) AFM からセルの 3D 再構成に重ね合わされた先端形状のヘルツモデルフィットと放物線プロファイル(半径 8 nm)を使用して構築されたモジュラス マップ。(B)核染色(蛍光ブルー)、微小管染色(蛍光緑)及び親油性膜染色(蛍光赤色)を有するレーザー共焦点zスタックの対応する3D突起。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:細菌サンプルのAFM。
(A ) AFM スキャンおよび (B)レンサ球菌ミュータンス菌のモジュラスマップを測定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:細菌サンプルの共焦点顕微鏡
緑色の蛍光膜染色を伴う エンテロコッカス・フェカリス のコロニーの共焦点像。スケールバーは5μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
コンポカルは、液体環境での生体材料の高品質な画像や 現場で の機械的特性を収集するための高度かつ効果的な技術です。生きたサンプルの機械的特性と組み合わせて例外的な形態および地形画像を収集する能力は、典型的な電子および光顕微鏡技術を超えて広がる。これとは別に、共焦点顕微鏡は、明視野、蛍光、レーザースキャン共焦点機能を提供し、サンプルの高品質で詳細な蛍光画像を実現します。AFM は機械的特性を提供しますが、補助光学系を使用しない場合、サンプルをナビゲートすることは困難になります。2つのシステムを組み合わせることで、実験中に全く同じセルの画像と機械的特性の両方を収集することができ、これは2つの別々の機器よりも大きな利点です。この原稿の目的は、生物学、工学、健康の将来のための複合コンポカルシステムの広範な能力をユーザーに知らせ、導くものです。プロトコルは、機器、培養メディア、食器、微生物の選択、AFM手順、共焦点手順、およびクリーンアップの調製を含みます。ライブ、インソリューション、コンポカルセッションを成功させるための最も重要なステップは、サンプルの固定化、慎重なチップ選択、およびライブ染色実行です。この原稿の討論セクションでは、文化の推奨事項、トラブルシューティングのヒントと運用ガイドライン、およびConpokal技術の今後の作業について詳しく説明します。文化に関する推奨事項は、サンプルの文化、固定化、および染色に関するガイダンスをカバーします。AFM、コンフォーカル、コンポカルのヒントとガイドラインでは、チップの選択とキャリブレーション、解像度、制限、およびほぼ同時操作について説明します。今後の作業には、将来の研究経路の見通しと可能性が含まれます。
このプロトコルは、生細胞と固定細菌サンプルの両方の培養、プローブ、イメージングをカバーしています。AFMを液体中で導くときの課題は、サンプルの障害および流体力学的抗力によるカンチレバー運動閉塞に由来する。試料が基板に十分に付着していない場合、液体中に浮遊するサンプルの切片によるカンチレバーの汚れが生じ得る可能性がある。その場合、測定はサンプルの弾性付着およびマイクロメカニカル特性の仮定であるため、危険にさらされます。HEK細胞は固定性で処理されなかったが 、S.ミュータンス および E.フェカリス は、他の原核細胞と同様に、追加の固定化を必要とする。選択された細菌は、細胞の探究およびイメージングを妨げる活性運動を示し、したがって、試料を穏やかに、固定化を促進するために化学的に固定した。個々の細胞を物理的に細孔75に捕捉するフィルター膜のような化学的固定に代わるものがある。
ヒントの選択は、AFM の設定と操作に重要なコンポーネントでもあります。生体材料の変形に基づく機械的特性が求められるとき、片持ち剛性と材料剛性の両立性を考慮する必要があり、これは、簡単な作業です。主な目標は、選択した片持ちの剛性に材料の剛性を最もよく一致させる方法です。カンチレバーがサンプルよりはるかに柔らかい場合、それはあまりにも多くのたわみの対象となります。片持ち体がサンプルよりも硬い場合、AFM検出器はそのような小さな偏向を捕捉できない可能性があります。適当なAFM片持ちレバーを選択する場合は、実験用途に基づいて選択することが推奨される。断続的な接触モードで詳細な画像を収集するために、AFMのヒントは、5 nm以内の剛性および先端半径の0.1-0.3 N/mの範囲内で、生細胞イメージングに有効です。小さな円錐のヒントをお勧めします。シャープなヒントは、小さな接触領域とサンプル形態76の小さな詳細と機能を収集するのを助ける機能を提供します。しかし、設定(設定点、ピクセル時間、アプローチ速度)がインデントを必要としすぎたり、インデントが速すぎたりすると、鋭いヒントがサンプルを穿刺しやすくなったりするので、問題になる可能性もあります。高ひずみ速度の影響を避けるために、鋭い先端の近くで局所的な歪みを硬化させる、または単に接触領域とアプローチ速度を制御するために、多くの人が弾性率を測定するためにコロイドチップで力分光法を使用することを選択します。
1 ~5 μm 以内の剛性および先端半径の範囲内の AFM チップは、生細胞の弾性係数を測定することをお勧めします。大きな先端サイズ(典型的にはガラスコロイド)は、既知の接触領域を提供し、接触している間に細胞を穿刺する可能性は低い。矩形の片持ち面は、キャリブレーション中に三角形の形状の接触ベースのキャリブレーションと比較して接接触のない方法を使用できるため、三角形よりも好ましい。また、AFMチップの繊細な性質のために、オペレータは繊細なAFMチップや取り付けブロックを損傷する可能性を低減するために、ゴムチップ付きのピンセットを実装することをお勧めします。その他のパラメーターには、AFM チップのアプローチ速度とサンプルへのインデントの量が含まれます。良いガイドラインは、サンプルの厚さ(または高さ)の約10%にインデントを維持し、カンチレバー38によって経験される潜在的な流体力学的抵抗を妨げる速度を選択することです。
複雑な実験機器には、通常、機器のセットアップ、キャリブレーション、操作のトラブルシューティングが必要なロードブロッキングが付属しています。サンプルまたはサンプル基板にAFMチップまたはカンチレバーをクラッシュさせることは、新しいユーザーにとってよくある間違いです。この問題を回避するために、プロトコルはカンチレバーを2000 μmのバッキングすることを提案します。このステップは、前のユーザーが実験後にクリーンアップするときにチップをバックアウトするのを忘れた場合に、チップが皿の底に接触しないことを保証します。しかし、このプロトコルで使用される選択された皿のホールダーのために2000 μmの間隔が選ばれた。大きいか小さい別の範囲は、使用される皿ホルダーのスタイルに応じて選択する必要があります。レーザーと検出器のアライメント中に、プロトコルは、合計信号を最大化するためにミラーノブの調整に言及しています。ミラー調整ノブがすべてのAFMに存在しない場合があります。しかし、もしあるなら、低和信号を解決するために器械を操作する1つの方法は、スキャンが行われる媒体を考慮するために使用されるミラーノブを調節することです。液体(例えば、水、培地、PBS)または空気のいずれか。空気と液体を通して光の屈折率の差が原因で、ミラーノブを調整する必要があります。AFMカンチレバーの最大曲げ感度はAFM先端の位置にあるため、フォトダイオード上の位置を通して曲げ位置を返すレーザー光は、AFM先端の位置に配置する必要があります。選択した AFM チップに応じて、合計信号値は 0.3 ~ 3.0 V から変化します。Cr-AuやAlなどのAFM片持ち面の裏面コーティングは、合計信号と測定の感度を増加させます。
先端ジオメトリは、AFM操作中にチップキャリブレーションを完了する際に関連します。非接触と接触の較正の間で良好な一致が観察された。選択したAFM片持ちレバーが長方形でない場合は、接触キャリブレーションを行う必要があります。チップが校正される培地は、サンプル媒体と同じでなければならないことを覚えておいてください。これらの流体が異なる場合、ユーザは再調整する必要があります。液体でAFMチップを使用する場合、システムによって測定される周波数は、製造業者が示す自然共振周波数の4分の1から3分の1でなければなりません。システムがチップを正しく校正していることを確認する良い方法は、生成された熱ノイズファイル内の値を確認することです。このファイルが適切なフォルダに保存されていることを確認します。システムの校正に問題がある場合や、推定値が出ない場合は、レーザー位置を再調整または調整してから再調整します。
また、サム信号不良の原因としては、AFMカンチレバーアライメントが原因である可能性があります。AFMチップをガラスブロックに取り付ける場合、カンチレバーの先端が小さなレーザー窓(滑らかなガラス領域)内に残ることが不可欠です。チップが前方に遠すぎる場合、カンチレバーが自然に休む角度は、カンチレバーからの反射に問題を引き起こし、光検出器を欠き、結果として総和信号が悪くなる可能性があります。チップが戻り過ぎると、レーザーはカンチレバーの背面を反射できず、総和信号が悪くなります。これらの理由から、搭載されたAFMチップを調整する必要があるかもしれません。さらに、サンプルの高さで発生する可能性のある別の問題が発生します。このプロトコルで使用されるAFM装置は15 μmの最大ピエゾz範囲(高さ)を有する。ソフトウェアが特定のピクセルの高さデータとフォース マップを収集できないことをユーザーが検出すると、システムが範囲外であることを示すブラック ボックスが表示されます (図 2C)。この問題を解決する方法の 1 つは、2 または 3 μm などの低い値に圧電の高さを設定して、15 μm の範囲の大部分が予測されるセルの高さをマッピングすることにコミットすることです。この手法は、ほとんどの細胞または細菌関連の実験において、z範囲に関連する問題を修正すべきである。
高さが 10 ~ 15 μm を超える高さのサンプルに対して拡張 z 範囲を必要とする実験者は、AFM 上で追加のモジュールを追求する必要があります。AFM メーカーは、ほとんどのシステムで追加コストでこのオプションを利用できます。実験者はz範囲を拡張することで、範囲外の値やAFMピエゾモータの変更に関する問題をほとんど持たずに、マイクロスケールで高いと考えられるサンプルをスキャンすることができます。これらのモジュールは余分な費用がかかりますが、メーカーによっては、z方向に最大100 μmの高さを提供できるものもあります。ユーザーが長い作業距離、高倍率の目的を持っているか、おそらく20xまたは40倍の空気目標を使用する意思がある場合は、より高いサンプルでコンフォーカルはまだ可能です。顕微鏡の目的倍率を下げることにより、作業距離が長くなり、より高いサンプルの頂点を見る距離が得られる。低倍率の目的にこの変更は、解像度を犠牲にします。この原稿で言及されているコンポカルのセットアップでは、60x TIRF(全内部反射蛍光)の目的はガラス底のサンプル皿のカバースリップを過ぎて100 μm近くの作動距離を有する。
本稿で言及されている共焦点顕微鏡に関しては、いくつかの重要な規定が議論されている。この原稿の数字の生産に使用される共焦点システムは、1.49の数値開口で60倍のTIRF油目的を実施した。405 nm、488 nmおよび561 nmの励起波長のレーザー線を、生細胞サンプルイメージングに使用した、図3および図4に示す。共焦点顕微鏡の回折限界は、アッベ解像方程式、アッベ解像度(x,y)=λ/2NA、λはAlexa 488の励起波長、488nm、NAは共焦点凝縮器の数値開口である、0.3を用いて決定することができる。したがって、272 nmの軸方向分解能が決定される。蛍光イメージングの場合、ピンホールが1つの風通しの良いユニット(AU)と0.5 AUに設定されている解像度を決定するために2つのケースが考えられます。後者の場合、ピンホールは、著しい光損失が発生するが、解像度が増加するような閉鎖されます。共焦点ソフトウェアは、0.5 AUのピンホールの場合は170 nmおよび290 nmの横ネイティブおよび軸ネイティブ解像度をそれぞれ計算し、1 AUでピンホールの場合は200 nmおよび370 nmを計算します。システムに導入された球面収差は、顕微鏡画像のコントラストと解像度を高めるためにデコンボリューションプロセスを通じて説明することができます。共焦点顕微鏡に固有の回折限界のために、図6の細菌コロニーの共焦点像は、図5の細菌のAFMスキャンで見られる詳細に対する一致する解像度を欠いている。AFMは、共焦点顕微鏡で捕獲することが困難なナノスケールの特徴と詳細へのアクセスを提供します。しかし、必要な蛍光分解能に応じて、図5および図6は、真核細胞に加えて、コンポカル法の微生物への適用性を示している。
共焦点顕微鏡を使用する利点は、オペレータが鋭くした細部のサンプルの特定の領域の3D画像を収集することを可能にする。これらの画像は、AFM画像と同領域の共焦点スキャンを介して探査された表面を見ることによってAFMと相関する。顕微鏡が反転しているため、蛍光画像は、プローブされた試料の反対側から光情報を収集する。コンフォーカルシステム内のピンホールは、サンプルの残りの部分や部屋から来る光をフィルタリングしながら、一定の距離から単一の平面に制限するのに役立ちます。基本的に、ピンホールは、サンプル内の関心のある単一平面から戻ってくる光を分離するのに役立ちます。一般に、この関心のある平面は、反転共焦点系の場合、単一分子検出がより高解像共焦点顕微鏡に限定されるため、強力な蛍光色素マーカーを含んでいる必要があります。蛍光発光照明は、起蛍光イメージングモードにおいて、目的に反射される試料からの光が収集され、画像を生成するために使用されるため、単一の平面を単一の平面に分離することができないという事実のために、あまり望ましくない。共焦点技術は、ピンホール77のために問題のサンプル特徴のより孤立した単一平面イメージを提供する。例えば、真核細胞の頂点がAFMによってプローブされる場合、同じ表面を、蛍光イメージングモードではなく顕微鏡のレーザー走査共焦点能力で単離することができる。データ取得時に、透過光検出器と488nmレーザーラインの助けを借りて、差動干渉コントラストモードで同時にデータ取得中に細胞の健康状態/形状を監視することをお勧めします。サンプルのzスタックを取り込む場合、上記の手順については、検出器のゲインのみが調整される。測定中の細胞の形態変化は、必ずしも蛍光チャネルに見えるとは限らないが、アーチファクトが測定に導入されることを示している。
平面間の理想的な間隔は、撮像技術で使用される最短波長に対するソフトウェア勧告に従うことによって得ることができる。画像ボリュームのネイティブ解像度と信号対ノイズ比は、取得ソフトウェアの画像処理モジュールで利用可能なデコンボリューションアルゴリズムを採用することで効果的に改善することができます。しかし、蛍光顕微鏡検査を行う場合、励起/発光スペクトルの重複から早期に設定された漂白やクロストークを避けるために、特定の染色剤と染料の選択が不可欠です。場合によっては、ユーザーが共焦点光生成の誤動作を経験することがあります。ユーザーに光の放出が不足しているか、レーザーラインが誤動作している場合、トラブルシューティングの 1 つの方法は、通常はオペレーティング ソフトウェアを再起動してシステムをリセットすることです。問題が解決しない場合、透過光検出器は、光顕微鏡の光路内での移動や場外移動に失敗した可能性があります。送信機検出器の位置をリセットすると、光収集やレーザーイメージングの問題を軽減するのに役立ちます。
Conpokal装置の焦点は、同時に、同じ細胞または特徴上の液体環境で、生きた生体材料に関する光学的および力ベースの情報を収集する機能をユーザーに提供することです。この研究は、多くの生体材料の自然な家庭である液体でこれらの実験を行う方法を明示的に記述しているが、それでも装置を使用して乾燥実験を行うことができる。ペトリ皿で調製されたサンプルで、皿の高さは限界である。AFMカンチレバーを保持するガラスブロックの構成のために、皿の側壁は高さが10ミリメートル以下でなければなりません。皿が高すぎると、装置はサンプルまたは基材の表面にAFM先端を下げることができなくなります。
サンプルサイズには制限がありますが、時間遅延に関する計測器やソフトウェアの機能に制限はありません。同時共焦点およびAFMは適切な要因で可能である。近接同時能力に寄与する制限とは、ある共焦点顕微鏡機能と原子間力顕微鏡機能を同時に実行する際に発生するノイズを指します。zスタックの収集中に顕微鏡の目的を移動させるモーターからの振動は、その動きの間にAFMプローブ先端からの信号に加えられる。モーターがz方向に上下に移動してサンプル内のシーケンシャルな面を照らすので、ノイズは油の目的によって強化されます。したがって、推奨されるプロトコルには、AFM スキャンと共焦点 z スタック・イメージの順次収集が含まれます。CLSMとAFMの同時処理では、共焦点との静止イメージングが必要になりますが、現在の技術では、2つの機器の遅延時間は数十秒と短くなる可能性があります。AFM動作から共焦点イメージングに切り替える実際の時間は 、図2A と 図4Bで収集された画像に対して約2〜4分でした。この値は、AFMスキャンの開始と完了の時間、コンフォーカルイメージングを有効にする計測器モードの切り替え、共焦点イメージzスタックの開始と完了を含む、合計33分の時間から2つの画像収集時間を差し引いて決定された。
コンポカルの未来は、単一細胞プロセスの鋭い洞察に加えて、新しい構造機能関係を探求することを目指しています。例えば、細胞や細菌のサンプル に 対する細胞や細菌のサンプルに対する実験を行い、生体材料、生物学、バイオメカニクスの分野への進歩です。イメージングとプローブ中のサンプル皿への治療は、時間の経過とともに、生きて慎重に制御された環境でサンプルが治療にどのように反応するかについての知識を提供します。新しい薬剤や環境問題を取り入れることで、細胞骨格やオルガネラの位置が移動、トポロジ、剛性などに及ぼす影響についての理解が深まります。コンポカルのもう一つの潜在的な進歩は、システムの完全な環境制御を持つ能力です。このプロトコルで言及されている現在のConpokalは実験室の内部からの騒音を減らすために設計されている音響エンクロージャの内部に収容される。このハウジングの進歩は、滅菌環境、温度制御、あるいは可変重力などの要因に限定されず、おそらく1つまたは組み合わせの要因内でテストする能力を提供するであろう。現状では、Conpokal法は、生きた液体中の生体材料を特徴付けるための効果的で有用なアプローチを提供しますが、技術の将来はこれらの機能をさらに進めるだけです。
Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
我々は、番号P20GM130456の下でNIH COBREの資金調達を認める。我々は、研究担当副社長が支援する英国の光顕微鏡コアに、この研究に対する支援に感謝する。S.ミュータンとE.フェカリスの株はナタリア・コロトコワ博士によって提供されました。共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡の組み合わせを説明するプレイ・オン・ワードの最初の言及は、ケンタッキー大学のブラッド・ベロン博士(化学・材料工学)に起因し、2017年にケンタッキー州のケンタッキー大学で化学材料工学の教員に加わったセミナースピーカーのジョナサン・ファム博士(対応著者)と話し合いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acoustic Enclosure | JPK-Bruker | Acoustic Enclosure | Chamber used to mitigate noise |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Millipore Sigma | SCT142 | Used to label microtubules in mammalian cells |
| CP-qp-CONT-BSG AFM tips | NanoAndMore | CP-qp-CONT-BSG-B | Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | ThermoFischer Scientific | D282 | Used to label plasma membrane of mammalian cells |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | VWR | VWRL0100-0500 | Component of cell culture media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285601 | Used to simulate biological environment |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 45000-736 | Component of cell culture media |
| Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fischer Scientific | BP1422-500 | Component of bacterial culture medium |
| FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments (WPI) | FD35-100 | Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM |
| Hoechst 33342 nucleic acid stain | ThermoFischer Scientific | 62249 | Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC Global Bioresource Center | CRL-1573 | Mammalian cells used in protocol |
| Matrigel | VWR | 47743-716 | Coating in cell culture dish |
| Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips | Bruker | PFQNM-LC-A-CAL | AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells) |
| NanoWizard 4a | JPK-Bruker | NanoWizard 4a | AFM |
| Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | A1 HD25 | Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging |
| PENICILLIN/STREPTOMYCIN | VWR | 16777-164 | Component of cell culture media |
| PetriDishHeater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Maintains desired Petri dish sample temperature |
| qp-BioAC-Cl AFM tips | Nanosensors | qp-BioAC-Cl-10 | Three different AFM cantilevers of varying stiffness |
| Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers | Ted Pella Inc. | 5051 | Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block |
| Todd Hewitt Broth Bacto | BD DIFCO Bacterius Ltd | Bacto-249240 | Component of bacterial culture medium |
| Vancomycin, BODIPY FL Conjugate | Thermo Fisher Scientific | V34850 | Used to fluorescently label bacterial cell wall |
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