Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nära Samtidig Laserscanning Confocal och Atomic Force Mikroskopi (Conpokal) på levande celler

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

Presenteras här är protokollet i Conpokal tekniken, som kombinerar confocal och atomkraft mikroskopi till ett enda instrument plattform. Conpokal ger samma cell, samma region, nära samtidig konfokal avbildning och mekanisk karakterisering av levande biologiska prover.

Abstract

Tekniker tillgängliga för mikro- och nanoskala mekanisk karakterisering har exploderat under de senaste decennierna. Från vidareutveckling av skannings- och transmissionselektronmikroskopet, till uppfinningen av atomkraftmikroskopi, och framsteg inom fluorescerande avbildning, har det skett stora vinster inom teknik som möjliggör studier av små material. Conpokal är ett portmanteau som kombinerar konfokalmikroskopi med atomkraftmikroskopi (AFM), där en sond "petar" ytan. Även om varje teknik är extremt effektiv för den kvalitativa och / eller kvantitativa bildsamling på egen hand, conpokal ger möjlighet att testa med blandade fluorescens imaging och mekanisk karakterisering. Conpokal är utformad för nära samtidig konfokal avbildning och atomkraftsutsonering och underlättar experiment på levande mikrobiologiska prover. Den tillsatta insikten från parad instrumentering ger samlokalisering av uppmätta mekaniska egenskaper (t.ex., elastisk modulus, vidhäftning, ytjämnhet) genom AFM med subcellulära komponenter eller aktivitet observerbar genom confocal mikroskopi. Detta arbete ger ett steg för steg protokoll för drift av laserscanning confocal och atomkraft mikroskopi, samtidigt, för att uppnå samma cell, samma region, konfokal avbildning, och mekanisk karakterisering.

Introduction

Mikro- eller nano-skala mekaniska utvärderingsverktyg används ofta för att avslöja deformationsegenskaperna på encells- eller mikroorganismnivå, medan separata högupplösta mikroskopiverktyg används för att visualisera subcellulära processer och strukturella egenskaper. Conpokal, är kombinationen av laserscanning confocal mikroskopi och atomkraft mikroskopi (AFM) till en enda instrumental plattform. Conpokal-tekniken implementerades först i ett icke-biologiskt polymersystem, där målet var att bestämma vidhäftningen, elasticiteten och ytspänningen hos hårda ytor i kontakt med mjuka ytor. Konfokala bilder gav en visuell återgivning av hur polymeren deformeras, följer och frigörs från den hårda sonden1,2. Från polymerer till biologiska prover, ger denna teknik möjlighet till nära samtidig levande cell eller mikroorganism confocal imaging och AFM.

Förändringar i cellelasticitet har varit inblandad i patogenesen vid många mänskliga sjukdomar3 inklusive vaskulära störningar4Malaria5,6, sicklecellanemi7Artrit8Astma9, och cancer6,10,11,12,13,14,15. Vanliga tekniker för att mäta mekaniken i celler inkluderar användningen av magnetiska pärlor16,17, optisk pincett18,19, mikropipette aspiration8,20,21,22, och AFM11,23,24,25,26. Sedan AFM-tillämpningen på levande celler har den lätt anpassats för att karakterisera celltopografi27,28 samt mekaniska egenskaper11,24,29,30,31 med precision i nanoskala. AFM har anpassats ytterligare för mikrorheologi32,33, frekvensmodulering34,35, och krypning25,36,37 experiment för att studera olika cellinjers viskoelastiska egenskaper. Användningen av en lämplig nanokontaktmodell är avgörande för utvinningen av kvantitativa elasticitetsvärden från AFM-producerade kraftindragsmätningar1,2. AFM-studier som undersöker cytoskeletala läkemedels påverkan på cellelasticiteten har visat att den elastiska modulusen är mycket påverkad38. Baserat på de elastiska modulusmätningarna har många forskare visat att cancerceller är mjukare än sina icke-transformerade motsvarigheter11,38,39. Ökad deformability spelar sannolikt en framträdande roll i förmågan hos cancerceller att metastasera och infiltrera vävnader40. Sådant beteende regleras genom modifieringar i cellernas cytoskeletal organisation38,41,42. Förutom cancer är en annan klass av mekaniska sjukdomar luftvägssjukdomar. Till exempel påverkar akut respiratoriskt stresssyndrom fler och fler människor varje år. Det har visat sig att när patienter sätts på mekanisk ventilation, med höga koncentrationer av syre, deras tillstånd kan förvärras43. I en serie studier observera alveolära epitelial makrofager med AFM, forskarna fann att tillsats av en syrerik miljö ökade styvheten i celler på grund av aktinbildning; ett utmärkt exempel på den inverkan som AFM har på vår detaljerade förståelse av atmosfärisk miljöpåverkan på andningsfunktionen på cellnivå och, i slutändan, människors läkning och hälsa44,45,46. Epitelcellsstelhet vid migration mot ett sår kan också bedömas via AFM och att en variation i elastisk modulus sker för att signalera framtida cellspridning47,48. Därför finns det ett praktiskt behov av att mäta cellmekanik kvantitativt för att förstå hur sjuka celler skiljer sig från, och interagera med, friska.

AFM används också för att studera självhäftande egenskaper och ytstruktur. Ett atomkraftmikroskop har en mängd olika lägen för att samla in information om ett prov med hjälp av kontaktmekanik. För levande biologiska prover är två av de primära målen att erhålla kvantitativa mekaniska egenskapsvärden (t.ex. Dessa lägen inkluderar tappningsläge (även kallat intermittent kontakt), som upprätthåller en konstant cantilever amplitud intermittent kontakta provytan och kontaktläge, som höjer eller sänker cantilever att upprätthålla en konstant avböjning49. Vidhäftningskartor kan samlas in med hjälp av kraftkartläggning på AFM-systemet. Cantilever indragen provet till en viss kraft och sedan dras tillbaka. Kraften motstå upprullning mäts av detektorn för att generera en kraft-förskjutning graf. Vidhäftningskraften är den maximala kraft som mäts vid upprullning. Surface morfologi ger en detaljerad bild av provet på mikro- eller nano-nivå. Den cantilever avslutar en raster scan över provet baserat på indrag och avböjning fångas av rörelsen av cantilever vid varje pixel, avslöjar mikro- och nano-stora funktioner. Med AFM, storleken på små funktioner såsom peptidoglykan struktur50, polymer kedja anpassning51, flagella52, lamellipodia53, och filipodia54 kan mätas. Medan AFM: s makt ligger i kraft-förskjutning kurvor och icke-optiska topologiska bilder, confocal mikroskopi erbjuder detaljerad bildbehandling av fluorescerande märkta prover.

Konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) är en dominerande teknik för avbildning levande celler, fasta celler, och vävnader55,56,57. CLSM har varit anställd för biologisk avbildning sedan1955 dvs , sedan starten58,59. Medan arbetsprincipen för konfokalmikroskop (dvs., förkastandet av out of focus ljus genom ett hål) har förblivit i stort sett densamma, har det tekniska genomförandet blivit mycketvarierande 56,57,58,60. Confocal imaging kan implementeras via multipunktsskanning, som i ett snurrande skivsystem61, punktskanning av en enda laserstråle, som i linjeskanning62, eller bildtagning av punktspridningsfunktionen med efterföljande pixelåterfördelsbyten via en flerelementdetektor57. Senaste framsteg som utökar nyttan av konfokal avbildning inkluderar laserskanning kapacitet, hög hastighet resonansskanning, och hög känslighetdetektorer 63,64,65. Fördelen som alla konfokala system har över widefieldmikroskop är förmågan att utföra optisk snittning i z-axeln med större detaljrikedom, särskilt i tjocka prover. Widefield mikroskop med hjälp av kamerabaserad detektion samla ljus som avges från fokalplanet och samtidigt ljus som avges från överallt i belysningsvägen. Genom att stänga tapphålet, till kostnaden för att minska signalen, kan både den axiella och laterala upplösningen ökas66. I CLSM byggs bilder upp pixel för pixel genom utsläppssignalsamling när en magnetiseringslaser skannas över ett x-y-synfält. Insamling av flera x-y-plan längs z-axeln i provet kan sedan användas för att rekonstruera den 3-dimensionellaarkitekturen av provet 57,67. Konfokalmikroskopi i samband med införandet av fluorescerande proteiner, har revolutionerat vår förståelse av cellbiologi68. Till exempel har det blivit ett viktigt verktyg i neurovetenskap69. CLSM används regelbundet för att observera rensad vävnad, och för att få omfattande bilder av immun färgade hjärnan och neuronal nätverksarkitektur70. Denna ansökan har resulterat i nya insikter i synaptiska kontakter och kommunikation bland nervceller och gliaceller i hjärnan71. Från hjärnceller till vesiklar, fluorescerande färgning protokoll stödja inspektion och avskiljning av cellfunktioner via confocal mikroskopi för framsteg i terapeutiska tekniker72,73.

Även om de är imponerande och mångsidiga verktyg individuellt, kombinationen av confocal och atomkraft mikroskopi (Conpokal) tillåter forskare att unikt korrelera topografiska och mikromekaniska cellulära / vävnad egenskaper med observation av olika cellulära organeller och deras respektive dynamik. Parat instrumentering tillåter användare att, i huvudsak, "se" vad de sonderar; en enorm fördel jämfört med en teknik på egen hand. Med Conpokal, kraft kartläggning genom AFM är överlagrad på confocal bilder att korrelera cellstelhet, vidhäftning, eller morfologi till cytoskeletal struktur inom provet, till exempel. Det övergripande målet med Conpokal-metoden är att tillhandahålla en plattform för forskare att studera levande prover på ett kortfattat, effektivt sätt, vilket ger både bild och materialmaterialmaterialdata i en enda plattform. I detta arbete visar vi driften av Conpokal inklusive korrekt urval och förberedelse av prov, instrumentinställning, cantilever kalibrering, och ge riktlinjer för att lyckas felsökning. Efter protokollet ger vi representativa resultat som inkluderar framgångsrika bakterier och cell AFM höjd kartläggning, bakterier och cell AFM modulus kartläggning och confocal bildbehandling av multi-märkta celler, genom samma-cell confocal och AFM. Vi avslutar med en diskussion om Conpokal proceduren kritiska steg, felsökning rekommendationer, teknik begränsningar, signifikans och framtida utsikterna för metoden.

Protocol

1. Beredning av instrument, kulturmedia, maträtter

  1. Slå på strömkällorna för både konfokalmikroskopet och atomkraftmikroskopet, liksom alla andra tillhörande instrument eller anordningar som utnyttjas under Conpokal. Låt tillräckligt med tid för instrumenten att termiskt ekvilo och stabilisera innan mätningarna påbörjas. Typiskt är 1 h tillräckligt.
  2. Förbered en ren, systemgodkänd, glasbottnad petriskål och fyll halvfull, men högst två tredjedelar full, med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), eller liknande klar vätska. Denna maträtt (kallad "kalibreringsfatet") är skild från provets rätter och kommer att användas för att lokalisera och kalibrera atomkraftmikroskopet (AFM) cantilever.
    OBS: Det är viktigt att vätskan är klar och har låg autofluorescens för att förhindra eventuella störningar i fluorescensspektra. PBS rekommenderas eftersom det härmar den biologiska miljön.
  3. Förbered experimentella provrätter så att den tillhörande vätskan har fyllt skålen minst halvfull. Om provet är fluorescerande, se till att det är täckt eller på en mörk plats tills det behövs. Rengör botten av alla glasrätter med hjälp av linsrengöringsmedel och linsservetter.
  4. Skapa datalagringsmappar för konfokal- och AFM-enheten på datorns/datorernas hårddisk(er).

2. Val av celler eller mikroorganismer

  1. För att skapa bakterier stamlösning, inokulera Streptococcus mutans bakterier, med hjälp av en inokulering slinga, i 15 mL av Todd Hewitt Jäst (THY) över natten (för exponentiell fas) i en 5% CO2 inkubator.
  2. 1 h innan inkubationen över natten är klar, päls experimentella prov rätter med 1 mL poly-l-lysinlösning eller tillräckligt för att täcka glasdelen av glasbottnad skålen och låt i biosäkerhet skåpet för 1 h. Efter inställning, aspirera poly-l-lysinlösning och skölj disken 3x med PBS.
  3. Efter 18 – 24 h bakterieinkubation, inokulera THY med 1 mL bakteriell suspension tills en optisk densitet på 0,6 – 0,7 uppnås (typiska värden för inokulering är 3 mL thy med 1 mL bakteriell suspension per fat). Tillsätt 1 mL ny bakterielösning till varje poly-l-lysinbelagd rätt och inkubera i 1 h. Under de senaste 10 min, tillsätt 1 mL grön fluorescerande membran fläck (koncentration av 1 μM) till varje maträtt.
  4. Skölj varje rätt 3x med PBS. Försiktigt fixera bakterierna med ca 1 mL av 4% paraformaldehydlösning i 15 min vid rumstemperatur inuti ett biosäkerhetsskåp. Skölj varje rätt 3x med PBS efter fixering.
  5. Förvara human embryonal njure (HEK) 293 celler i flytande kväve. Utför snabb upptining vid 37 °C vattenbad före plätering.
  6. Tillsätt 1 mL av källarmembranmatrislösning i cellodlingsmedia till varje cellprovsfat och inkubera (5% CO2) vid 37 °C i 1 h. Aspirera lösningen och diska med cellkulturmedia. Platta erforderligt antal AVRM 293 celler (t.ex., 100 000 celler per 35 mm maträtt) och tillsätt 2 mL cellodlingsmedia. Därefter, inkubera (5% CO2) cellerna vid 37 °C i 48 h.
  7. Efter 48 h, tillsätt 2 μL av ett fluorescerande mikrotubuli cytoskelettfärgämne (koncentration av 1x) till varje cellprovsfat och inkubera i 30 min. Aspirera lösningen som innehåller färgämnet, tvätta cellerna 3x med PBS, och tillsätt 2 mL cellodlingsmedia.
  8. Tillsätt 1 μL plasmamembranfärgämne (koncentration av 10 μM) till provmakarna och inkubera i 30 minuter. Tvätta lösningen som innehåller färgämnet 3x med PBS och tillsätt 2 mL cellodlingsmedia.
  9. Räknar ut kärnan genom att tillföra 1 μL av en nukleinsyrafärgämne (koncentration av 10 μM) lösning på provmakarna och inkubera i 30 min. Tvätta lösningen som innehåller färgämnet 3x med PBS och tillsätt 2 mL odlingsmedia.

3. AFM förfarande

  1. Öppna den atomic force mikroskop (AFM) operativsystem genom att klicka på programvaran ikonen på datorn.
  2. Rotera till eller sätt in ett mål för låg förstoringsluft (rekommenderat 10x eller 20x). Ett långt arbetsavstånd på 5 mm eller mer är fördelaktigt vid spetssänkning och kalibrering.
  3. Montera den valda cellprovsfasen om den inte redan installerats. För levande prover, använd en diskvärmare för att hålla provet vid önskad temperatur.
  4. Ladda den rena, systemgodkända Petriskålen fylld halvfull av PBS (beredd i steg 1.2) eller liknande klar vätska (kalibreringsfat). Om provsteg har inbyggda knäppen, använd dessa, annars, använd vakuumfett för att stabilisera provet.
  5. Välj en lämplig AFM cantilever för önskad datainsamling och installera den följer stegen nedan.
    1. Montera AFM-chipet i glasblocket genom att använda monteringssteget afm-chip, pincett och en liten skruvmejsel. Placera försiktigt AFM-chipet på glasblocket och orientera det så att det är centrerat. Den cantilever, plus en mycket liten del av AFM chip, bör vara i den synliga, icke-ogenomskinliga delen av monteringsblocket.
    2. Säkra chipet med skruvmejseln genom att dra åt skruven tills chippet är tätt mot glasblocket. Kontrollera att AFM cantilever är orienterad korrekt med hjälp av ett stereomikroskop eller en handhållen spyglass. Justera efter behov. När korrekt orienterade, placera glasblocket i AFM huvudet i rätt orientering och låsa den på plats.
      OBS: AFM-chippets orientering inom glasblocket är viktig så att systemlasrarna syftar till den kantilevers baksida och reflekterar på fotomaskinen på ett korrekt sätt. Var försiktig så att du inte spänner skruvarna för hårt under placeringen eftersom denna procedur skulle kunna göra att AFM-chippet, kantilever eller spets går sönder.
  6. Med hjälp av alternativet brightfield av konfokalmikroskopet, lokalisera botten av kalibreringsfatet genom att använda fokusratten. Ta del av denna z höjd som det värde där botten av skålen är belägen med avseende på mikroskopet objektiv.
  7. Med hjälp av AFM-systemets motorstyrpanel på datorn som driver stegmotorerna Z flyttar du AFM-cantilever bort från provet uppåt 2000 μm.
  8. Med båda händerna placerar du försiktigt AFM-huvudet med AFM-chippet på provsteget och ser till att var och en av de vertikala punkterna på AFM-huvudet är fast inställda i sina utsedda spår på AFM-scenen. När AFM huvudet är på plats, visuellt se hur nära cantilever innehavaren är att skålen. Om det verkar vara för nära, så att AFM-huvudet är i kontakt eller inom 1 mm från toppen av provskålen, backa ut den med hjälp av z stegmotorerna innan du sänker AFM-spetsen mot provet.
  9. Med hjälp av brightfield belysning, långsamt sänka AFM chip till botten av glas skålen med hjälp av z stegmotor kontrollpanelen på AFM programvara. Leta reda på de manuella mikrometrar som styr X-Y eller in-plane rörelse av AFM huvudet på instrumentplattformen. Justera placeringen av AFM cantilever inom synfältet genom att korrigera AFM huvudet som cantilever kommer i sikte.
    1. Eftersom placeringen med avseende på botten av skålen är okänd vid denna tidpunkt, lägre med steg på 100 – 200 μm för att undvika att krascha AFM-spetsen i Petri-skålen. Typiskt, spetsen måste sänkas 800 – 2000 μm. När spetsen sänks, titta på en skugga som ska visas på mikroskopet programvara visa, vilket indikerar AFM spets närmar sig botten av skålen.
    2. Minska steg till 20 – 50 μm. Var noga med att justera look up-tabeller (LUTs) av kamerabilden som spetsen sänker ner i skålen genom att använda LUTs panelen på konfokalprogramvara. Fortsätt att sänka AFM-spetsen med hjälp av små steg tills den för det mesta är i fokus.
    3. Se till att spetsen är tillräckligt mörk så att den allmänna formen på den kan ses och centreras i synfältet. Se också till att spetsen verkar suddig, vilket bekräftar att det inte har stött på botten av skålen, ännu.
  10. Justera mikroskopet fokus så att spetsen är nu i fokus, med tanke på arbetsavståndet för målet. Innan du flyttar till en högre förstoring mål, använd mikroskopet mätverktyget för att samla bredd och längd afm cantilever genom att komma åt panelen mätverktyg på konfokal programvara. Ta del av dessa mätningar.
    OBS: Det är viktigt att inte krascha målet i botten av provet skålen som också kan orsaka provet skålen att komma i kontakt med AFM spets, potentiellt skada den.
  11. Om det finns, ta bort laserljusfiltret, och se till att AFM-lasern är på, så att laserljuset blir synligt i optiken.
    1. Använd laserjusteringsratten flyttar du lasern in i synfältet och nära AFM-spetsen. När lasern är på denna plats, byt ut laserljusfiltret.
    2. Med hjälp av laserjusteringsratten placerar du lasern på baksidan av var AFM-spetsen sitter på den lättförstrviga. Vid denna punkt bör laserjusteringspanelen avläsa en summasignal som är större än 0,0 V. Om ingen summasignal erhålls, justera spegeln genom att använda det manuellt styrda spegelratten tills en summasignal som är större än 0,0 V läser på skärmen.
    3. Flytta lasern i små mängder i alla riktningar på AFM cantilever tills den maximala summan signal uppnås men läget är vid AFM spets. När laserpositionen är inställd nollställs den vertikala och laterala avböjningen genom att använda de manuellt styrda avböjningsratten.
    4. Observera laserjusteringspanelen på AFM-programvaran och genom att använda de vertikala och laterala avböjningsvredarna på AFM-huvudet, rikta detektorn så att målet är centrerat (röd punkt i mitten av hårkorset) och det inte finns någon vertikal eller lateral avböjning.
  12. Öppna kalibreringsfönstret i PROGRAMVARAN AFM. Mata in all experimentspecifik information. Innan du kalibrerar, stäng av den konfokalmikroskop ljuskällan och stäng AFM-höljet, om tillämpligt, för att dämpa eventuella ljud som kommer från rummet ljus eller rumsvibrationer. Tryck sedan på kalibreringsknappen för att automatiskt låta systemet kalibrera spetsen. Efter att kalibreringen är klar kommer styvheten hos den lättrövande (N/m) och dess känslighet (nm/V) att tillhandahållas inom kalibreringspanelen. Notera dessa för senare analys.
  13. Dra tillbaka AFM cantilever minst 2000 μm med stegmotorerna. Ta AFM-huvudet från scenen och ta bort kalibreringsfatet. Rotera till eller infoga det önskade målet. Dra tillbaka målet 10 % av arbetsavståndet om systemet är programmerat för att upprätthålla samma fokalplan mellan målen. Om detta är ett oljemål, placera en droppe nedsänkning olja på ögat av målet.
    OBS: Upprullningen av målet minskar sannolikheten för att målsättningen kontaktar provskålen under placeringen.
  14. För att hålla provfatet på plats på plats, använd en bomullspinne för att applicera små sandskädda av vakuumfett runt provringens kant inom provstadiet, eller använd provklämmor. Ladda försiktigt provfatet i provstadiet.
  15. När provet är placerat, rotera det några gånger för att säkerställa en god tätning av skålen till provhållaren via fettet. Höj målet till botten av skålen tills oljan bara vekar över ögat av målet.
  16. Med hjälp av mikroskopet, utan AFM huvudet på scenen, fokusera bildsystemet så att provet är i fokus. Notera denna z höjd för referens.
  17. Sätt försiktigt ut AFM-huvudet på plattformen.
  18. Använd stegmotorerna Z, sänk spetsen mot provet. När AFM-spetsen sänks justerar du look up-tabellerna (LUTs) i brightfield-bilden efter behov. Sänk spetsen tills den nästan är skarp. Använd de manuellt manövrerade AFM-spetspositionsmikrometererna, flytta AFM-huvudet så att AFM-spetsen är i mitten eller vänster centrerad i synfältet.
    OBS: Eftersom z-höjden på AFM noterades innan i steg 3.6, kan större åtgärder vidtas för att sänka AFM-spets, dock har fett lagts till botten av skålen och potentiellt olja till målet, så detta värde är bara som referens. Det rekommenderas att ta 50 – 100 μm steg och justera mindre när spetsen kommer i fokus
  19. Justera laserpositionen genom att använda de manuella mikrometrarna på AFM-huvudet. Om det behövs, nollställ de vertikala och laterala avböjningarna genom att justera respektive rattar och kalibrera om AFM-kantilever i provskålen.
    OBS: Om den cantilever var kalibrerad i ett medium som skiljer sig från provet, måste det kalibreras i skanningsmediet för att ta hänsyn till en potentiell förändring i brytningsindex. Dessutom kan lasern glida från baksidan av cantilever på grund av buller eller temperaturförändringar. Justera endast lasern och kalibrera om vid behov och i provfatet ovanför glassubstratet om du använder beröringsfri kalibrering. Om kontaktkalibreringen ska du använda omkalibrera insidan av kalibreringsfatet med hjälp av provmediet.
  20. För att uppnå högkvalitativa konfokalmikroskopbilder, byt ut det aktuella dämpande ljusfiltret mot filtret som blockerar allt AFM-laserljus. Detta ljusfilter säkerställer inga störningar från AFM-laserns starka ljus.
  21. Med hjälp av den automatiska knappen för inflygningskommando, som vanligtvis betecknas med en nedåtriktad pil, sänks spetsen till botten av provskålen. Ställ in storlek/område för skanningen, upplösningen, börsen, z-längden och pixeltiden (eller använd de kalibrerade/spridda värdena) på bildhanteringskontrollpanelen och påbörja skanningen.
  22. Efter att en skanning är klar lyfter du AFM-chipet 50 – 100 μm uppåt innan du navigerar till en ny mätposition i provfatet. När en ny plats har hittats, närma sig glaset och börja skanna igen efter stegen 3.21 och 3.22.
  23. Välj alternativet Spara automatiskt, eller spara varje genererad fil manuellt från varje enskild genomsökning genom att klicka på Spara.

4. Confocal förfarande

  1. Öppna den konfokala operativsystem. Se till att all tillhörande kringutrustning, ljuskällor och styrenheter är påkopplade och fungerar normalt.
  2. Rotera eller sätt in ett mål med låg förstoring (10x eller 20x) för att visa prov. Se till att målet är på ett säkert arbetsavstånd från där provskålen kommer att vara och vid behov, backa ut målet att undvika en eventuell kollision mellan målet med provet. Med hjälp av en bomullspinne, sandskädda vakuumfett runt kanten av provet skålen ringen. Om du använder ett oljemål, placera en enda droppe nedsänkning olja på den främre linsen av målet
  3. Placera önskat prov i provstadiet. Snurra provet runt några gånger för att säkerställa att vakuumfett har genererat en stram bindning till provstegsinsatsen eller använda provklämmor. Om du använder ett oljemål, höja målet till botten av skålen så oljan bara vekar över glaset botten. För att undvika överdriven blekning, minimera omgivande belysning.
  4. Använda brightfield eller epifluorescens lägen via kameran eller okular, lokalisera provet och använda fokus ratten, fokusera på ett område av intresse som innehåller flera celler eller en enda cell. Ofta kommer synfältet inom det optiska mikroskopet att vara större än x-y scanningfönstret på AFM-systemet (100 x 100 μm). Gör justeringar av AFM-positionen inom det konfokala synfältet genom att använda motorkontrollpanelen i AFM-programvaran så att AFM-skanningen och konfokaloptiken avbildar samma funktioner.
    OBS: Inom synfältet finns det typiskt sett bara några få celler, så det är lättare att avgöra vilken cell som önskas att avsonas. Som AFM utförs, cellen blir synlig på AFM programvara och därifrån kan användaren peka ut specifika regioner av intresse att sond.
  5. Om så önskas, ta bilder i bright-field eller epifluorescens med hjälp av en kamera eller CLSM lägen baserat på etiketten på provet, fokusrattar, och fånga knappar på mikroskopet programvara.
  6. Med hjälp av mikroskopprogramvaran väljer du alternativet eller öppnar panelen för att aktivera konfokala möjligheter (t.ex. Det här alternativet noteras vanligtvis av värdena för laserlinjens våglängd.
  7. Välj de laserlinjer som är lämpliga för de färgämnen som används för färgning av proverna. Aktivera en eller flera laserlinjer för att excitera och avbilda de funktionerna i exemplet.
  8. Ställ in vinsten på ett värde som optimerar proverna fluorescens men begränsar mängden brus. Ett typiskt startvärde är en vinst på 70.
  9. Justera lasereffekten för att undvika mättade pixlar men maximera det dynamiska omfånget. Ett typiskt utgångsområde för lasereffekten är 1 – 3 %.
  10. Ställ in tapphålsstorleken på 1 Luftig enhet för att maximera upplösningen för den optiska snittningen. Om provet är svagt och lasereffekten redan är hög öppnar du upp pinhålet för att öka signalen till kostnaden för att minska z-axelns upplösning.
  11. Ställ in pixeln uppehållstid (dvs., skanningshastigheten). Börja med en 2 μs uppehållstid och om det behövs, justera för att återspegla provljusstyrkan. Välj pixelstorlek/skanningsstorlek för det valda målet genom att låta instrumentet beräkna det via alternativknappen Nyquist och det valda antalet pixlar i bilden.
    OBS: Längre uppehållstider i tjockare prover kan leda till överdriven blekning när z staplar samlas in.
  12. Välj alternativet Skanna på instrumentets programvara och påbörja datainsamlingen.
    OBS: Om instrumentet har flera lasrar, kan var och en optimeras oberoende, och sedan kördes samtidigt för multi-fluorescerande bilder.
  13. Använd fokusratten för att zooma in och ut och leta reda på det optimala synfältet i provet.
  14. Ta bilder genom att använda systemets Capture-knapp och spara alla nödvändiga filformat av provet till en önskad plats/mapp på datorns hårddisk, eller lokal extern hårddisk.
  15. Fortsätt att justera förstärkning, lasereffekt, pinhole-storlek, samplingsfrekvens och andra värden därefter för att optimera bilden. Pixelmättnadsindexet kan aktiveras för att kontrollera om pixlarna är övermättade. Om denna övermättnad är närvarande, vinst och laserkraft kan justeras för att eliminera mättade pixlar. Använd LUTs som en guide för att göra specifika justeringar.
  16. Använd om möjligt systemets Nyquist-samplingsfrekvens, som visas i programvaran som panel eller knapp, för att säkerställa att bilder samlas in med den maximala möjliga upplösningen.
  17. Aktivera konfokalsystemets z-stack- eller bildvolymsamlingsverktyg. Med hjälp av ett nedifrån-till-topp-alternativ, med endast en laserlinje, särskilt laserlinjen som lyser upp en funktion i provet tydligast, ställ in start- och målplanen för den volym som ska mätas.
  18. Använd det föreslagna avståndet mellan plan i z-stacken, som beräknas för att uppfylla Nyquists samplingskriterier för bästa erhållbara axiella upplösning som ges av instrumentet och används laserlinje.
  19. När flera laserlinjer används använder du den kortaste våglängden för beräkning av avståndet. När anskaffningen är klar sparar du filen i lämplig mapp.
  20. Alternativt, om a priori kunskap om provets tjocklek finns, definiera volymen genom att välja mitten planet, den som visas den ljusaste och skarpast. I denna situation, ställ in den övre till halva provet tjocklek ovanför mitten planet och botten till halva tjockleken under mitten planet.
  21. När provsamlingen i det här synfältet är klar, eller provet har blekt, använder du den motoriserade eller manuellt styrda scenen för att hitta en annan plats av intresse på provet och upprepa stegen för bildinsamling.

5. Saneringsproceduren

  1. Se till att alla datafiler, både från CLSM och AFM, sparas på rätt platser.
  2. Dra tillbaka AFM-chippet med hjälp av z stegmotorerna minst 2000 μm eller avståndet som restes för att komma till provytan. Ta bort AFM-huvudet från scenen och placera det försiktigt på sin viloplats.
  3. Dra tillbaka mikroskopmålet så att det är långt borta från provet. Om ett oljemål användes bör målet dras in tillräckligt långt så att det inte längre finns kontakt mellan målet och provsubstratet.
  4. Använd handskar, ta bort provet och rensa bort fettet, och olja om tillämpligt, från botten av provet skålen. Förvärva en ny, ren, tom Petriskål och fyll den med 70% etanollösning en halv till tre fjärdedelar full. Placera den i provhållaren och sätt tillbaka AFM-huvudet så att AFM-chipet kan suga i etanollösningen i 5 min.
  5. Medan AFM-chipet är blötläggning rekommenderas det att börja kopiera experimentdata på en extern hårddisk. Efter nedsänkning av AFM-chipet i etanollösning i minst 5 minuter, avlägsna AFM-huvudet och lägg det på sitt viloplats.
  6. Använd handskar, ta bort AFM-spånhållaren och placera den i monteringsstationen. Ta försiktigt bort AFM-chipet med hjälp av pincett med gummigrepp. Placera den använda spetsen tillbaka till platsen för rutan den kom från orienterade off axeln att beteckna att den har använts. För framtida referens, notera vilket tips som användes i experimentet.
  7. Ta petriskålen fylld med etanollösningen ur systemet och kassera vätskan och skålen. Använda handskar, lins renare, och linsservetter, rengör försiktigt oljan från mikroskop objektivt efter standardprotokoll. Rengör provhållaren genom att ta bort eventuellt fett. Kassera allt avfallsmaterial enligt biosäkerhetsprotokoll och returnera verktyg till deras kända platser.
  8. Slutför datainsamlingen från datorn/datorerna och stäng av dem. Ström av alla instrument, tillbehör, kringutrustning eller andra enheter som utnyttjas för experimentet.

Representative Results

Conpokal-tekniken är schematiskt representerad i figur 1A och en bild av uppställningen visas i figur 1B. För att noggrant samlokalisera biologiska strukturer via konfokalmikroskopi med samma strukturer i AFM är inriktningen av de två systemen under installationen kritisk. Välj ansedda konfokala och AFM tillverkare som är bekanta med varandras rumsliga krav. Dessutom är ett framgångsrikt genomförande av tekniken beroende av bra färgning förfaranden, immobilisering av den biologiska strukturen, och lämpligt val av AFM spets. Höjden på levande celler utgör ofta en utmaning för AFM bildbehandling. En AFM scan över en levande HEK cell visas i figur 2A. Höjden för just denna HEK-cell var runt 10 μm, vilket demonstrerades genom linjeskanningen i grönt (Bild 2B). En AFM-spets med antingen nollförskjutning (spetsen är i själva änden av cantilever) eller spetshöjden större än cellhöjden (t.ex., spetshöjd ≥ 10 μm) kommer att ge en mycket löst bild av enskilda celler. Ett exempel på en dålig skanning på grund av felaktig AFM tips val ingår i figur 2C. I den här bilden dök svarta pixlar upp vid cellens spets som indikerar att AFM-piezoen ligger utanför intervallet på grund av en stor cellhöjd. Slutet av AFM cantilever dök upp i bilden (en rundad fyrkant) på grund av spetsförskjutning kombinerat med otillräcklig spetshöjd jämfört med cellhöjd. Dessa artefakter i AFM bilden indikerar en annan AFM spets bör väljas för att avbilda cellen.

Effektiv märkning i fluorescensfärgning tillsammans med rätt probe för livecellsavbildning krävs för denna metod. Vi utförde en tre-färgkonfokal bild som visas i figur 3A med en nukleär fläck (fluorescerande blå), en mikrotubuli fläck (fluorescerande grön), och en lipofila membran fläck (fluorescing röd). Dessa levande cell sonder valdes på grund av deras begränsade spektral överlappning och deras kompatibilitet med standard filter kuber. Vi har också tagit med den optiska brightfield-bilden i figur 3B.

Från AFM, analys av spetsen indrag tillsammans med en nanomekanisk modell, producerar en modulus karta över ytan. Ett exempel på en moduluskarta som konstruerats med hjälp av en Hertz-modellpassning och en parabolisk profil (radie på 8 nm) för spetsformen visas överlagrad på 3D-rekonstruktionen av cellformen i figur 4A (som är samma två celler som visas i figur 3). Motsvarande 3D-projektion av laserkonfokal z stacken visas i figur 4B.

Metoden är också lämplig för mindre biologiska strukturer, inklusive enstaka bakterier vars mikroskopiska och nanoskopiska funktioner är svåra att lösa med hjälp av ljusmikroskopi. En pågårstudie utnyttjar Conpokal tekniken för att utforska mekaniska mekanismer inom cellväggen som påverkar antibiotikaresistens i Streptococcus mutans.74 Manipulation av cellernas väggkomponenter resulterade i förändringar i morfologi och antibiotikaresistens. Conpokal underlättar levande, i-lösning, datainsamling (t.ex., yta morfologi, elastisk modulus, vidhäftning styrka, och ytjämnhet) på samma-cell prover att par mekaniska egenskaper med närvaro eller frånvaro av cellväggen komponenter. Figur 5A,B inkluderar en AFM-skanning och uppmätt moduluskarta över en Streptococcus mutans-bakterie. Bättre upplösning uppnåddes i denna skala med AFM än med traditionell konfokal mikroskopi.

Figur 6 innehåller en konfokal bild av en koloni av Enterococcus faecalis färgas med en grön fluorescerande cellstruktur fläck, som fäster vid cellväggen. Figur 5 och figur 6 visar conpokalteknikens tillämplighet på mikrober utöver eukaryota celler.

Figure 1
Bild 1: Conpokal-uppställningen.
(A) Schematisk av Conpokal teknik. (B) Bild av instrumentinställningen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Atomkraftsmikroskopi av levande celler.
(A) AFM bild av två HEK-celler. (B) Höjdprofil (grön linje i A) för en HEK-cell som anger cellhöjden är ganska stor vid 10 μm. (C) Dålig AFM bild av en astrocyte cell där AFM piezo är ute intervall vid spetsen av cellen och det finns bevis för omvänd avbildning av cantilever slutet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Konfokal och ljusfältsmikroskopi av levande celler.
(A) Laserscanning confocal mikroskopi av levande HEK celler färgas med en nukleär fläck (fluorescerande blå), en microtubule fläck (fluorescerande grön) och en lipofila membran fläcken (fluorescing röd). (B) Motsvarande brightfield optisk bild. Skala barer är 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Jämförelse av 3D-renderingar av AFM och konfokalmikroskopi av levande HEK-celler.
(A) Modulus karta konstruerad med hjälp av en Hertz-modellpassning och en parabolisk profil (radie på 8 nm) för spetsformen överlagrad på 3D-rekonstruktionen av cellen från AFM. (B) Den motsvarande 3D-projektionen av laserkonfokal z stacken med en nukleär fläck (fluorescerande blå), en mikrotubulifläck (fluorescerande grön) och en lipofila membranfläck (fluorescerande rött). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: AFM av bakterieprov.
(A) AFM scan och (B) uppmätt modulus karta över en Streptococcus mutans bakterie. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Konfokalmikroskopi av bakterieprov.
Konfokal bild av en koloni av Enterococcus faecalis med grön fluorescerande membran fläck. Skala bar är 5 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Conpokal är en avancerad, effektiv teknik för att samla in högkvalitativa bilder och in situ mekaniska egenskaper hos levande biomaterial i en flytande miljö. Möjligheten att samla exceptionella morfologi och topografi bilder i kombination med levande-prov mekaniska egenskaper sträcker sig förbi typiska elektron och ljus mikroskopi tekniker. Separat ger ett konfokalmikroskop brightfield, epifluorescens och laserscanning confocal kapacitet att uppnå högkvalitativa, detaljerade fluorescerande bilder av prover. En AFM ger mekanisk karakterisering, men utan hjälpoptik blir det svårt att navigera i provet. Med de två systemen kombinerade kan en användare samla både bilder och mekaniska egenskaper hos exakt samma cell under experimentet, vilket är en stor fördel jämfört med två separata instrument. Syftet med detta manuskript är att informera och vägleda användare om de omfattande funktionerna i det kombinerade Conpokal-systemet för framtiden för biologi, ingenjörsvetenskap och hälsa. Protokollet innebär beredning av instrument, kultur media, rätter, val av mikroorganismer, AFM förfarande, confocal förfarande, och städa upp. De mest kritiska stegen för en lyckad live, i-lösning, Conpokal session är prov immobilisering, omdömesgilla tips urval, och levande fläck utförande. Diskussionsdelen för detta manuskript kommer att utveckla kulturrekommendationer, felsökningstips och operativa riktlinjer samt framtida arbete för Conpokal-tekniken. Kulturrekommendationer kommer att omfatta vägledning om provkultur, immobilisering och färgning. AFM, confocal, och Conpokal tips och riktlinjer kommer att diskutera tips val och kalibrering, upplösning, begränsningar, och nära samtidig drift. Framtida arbete omfattar utsikterna och potentialen för blivande forskningsvägar.

Protokollet omfattar kultur, sondering och avbildning av både levande cell och fasta bakterieprover. En utmaning närvarande när de utför AFM i flytande stammar från cantilever rörelse obstruktion på grund av prov hinder och hydrodynamic dra. Om provet inte är väl vidhäftat med underlaget finns det potential för påväxt av cantilever genom sektioner av provet som flyter i vätskan. I så fall äventyras mätningar eftersom de är ett antagande av elastisk följsamhet och mikromekaniska egenskaper hos provet. HEK-cellerna behandlades inte med fixativ, men S. mutans och E. faecalis kräver ytterligare immobilisering, liknande andra prokaryota celler. De valda bakterierna visade aktiv rörelse som hindrade cell probing och imaging, därför var proverna försiktigt, kemiskt fast för att främja immobilisering. Det finns alternativ till kemisk fixering, såsom filtermembran som fysiskt fångar enskilda celler i porerna75.

Tipsval är också en kritisk komponent till inställning och drift av AFM. När mekaniska egenskaper baserade på deformation av biomaterialet eftersträvas, måste man överväga cantilever styvhet och material styvhet kompatibilitet, vilket är en icke-trivial uppgift. Det huvudsakliga målet är att bäst matcha materialets styvhet med styvheten hos den valda cantilever. Om cantilever är mycket mjukare än provet, kommer det att bli föremål för för mycket avböjning. Om cantilever är styvare än provet, då AFM detektorn kan vara oförmögen att fånga så små avböjningar. Det rekommenderas att när du väljer en lämplig AFM cantilever, att välja baserat på experimentell tillämpning. För att samla detaljerade bilder i intermittent kontaktläge, AFM tips inom ett intervall på 0,1 - 0,3 N / m för styvhet och spets radie inom 5 nm – 100 nm är effektiva för levande cell avbildning. Små koniska tips rekommenderas. Skarpa tips ger en liten kontaktyta och förmåga att indrag ytterligare medhjälp i att samla in små detaljer och funktioner i prov morfologi76. Men skarpa tips kan också vara problematiska eftersom de är benägna att punktera prover när inställningarna (t.ex. För att undvika hög-stam hastighet effekter, lokala stam härdning nära en skarp spets, eller helt enkelt att kontrollera kontaktområdet och tillvägagångssätt hastighet, många väljer att använda kraft spektroskopi med en kolloidal spets för att mäta en elastisk modulus.

AFM-spetsar inom ett intervall på 0,01 - 1,0 N/m för styvhet och spetsradie inom 1 – 5 μm rekommenderas för att mäta den elastiska moduli av levande celler. Stora spetsstorlekar, typiskt glaskolloider, ger ett känt kontaktområde och kommer sannolikt inte att punktera cellen när de är i kontakt. Rektangulära cantilevers är att föredra framför triangulära eftersom under kalibrering, kan kontaktfri metod användas för rektangulär geometri som jämfört med kontaktbaserad kalibrering för triangulära geometrier. Också, på grund av den känsliga karaktären av AFM tips, rekommenderas att operatören genomför pincett med gummispetsar för att minska risken för att skada den känsliga AFM chip eller montering block. Andra parametrar att tänka på är AFM-spetsens tillvägagångssättshastighet och indragets storlek i provet. En bra riktlinje är att hålla indrag till ca 10% av tjockleken (eller höjden) av provet och välja en hastighet som utesluter potentiella hydrodynamiska motstånd upplevs av den cantilever38.

Intrikata experimentella instrument levereras vanligtvis med vägspärrar som kräver felsökning i det instrument som ställts in, kalibrering och drift. Kraschar AFM spets eller cantilever i provet eller prov substrat är ett vanligt misstag för nya användare. För att undvika detta problem, föreslår protokollet att stödja cantilever ut 2000 μm. Detta steg säkerställer spetsen inte kommer i kontakt med botten av skålen om den tidigare användaren glömde att backa ut spetsen när du städar upp efter experiment. ΜM-sträckan på 2000 μm valdes dock för den valda maträtthållare som används i detta protokoll. Ett annat sortiment, större eller mindre, kan behöva väljas beroende på vilken maträtt innehavare stil som används. Under inriktningen av lasern och detektorn nämner protokollet justering av en spegelvrede för att maximera summasignalen. En spegeljusteringsratten kanske inte finns på alla AMM:er. Om närvarande, dock, ett sätt att manipulera instrumentet för att felsöka en låg summa signal är att justera spegeln ratten, används för att ta hänsyn till det medium där skanning kommer att ske; antingen flytande (t.ex., vatten, media, PBS) eller luft. På grund av skillnaden i index för refraktion för ljus genom luft och genom vätska kan spegelratten behöva justeras. Den maximala böjningskänsligheten hos AFM cantilever kommer att vara på platsen för AFM-spetsen, därför måste laserljuset, som returnerar böjningspositionen genom sin placering på en fotodiod, vara placerad vid platsen för AFM-spetsen. Beroende på vilken AFM-spets som valts kunde summans signalvärde variera från 0,3 – 3,0 V. En baksida beläggning på AFM cantilever såsom Cr-Au eller Al kommer att öka summan signal och känsligheten av mätningen.

Spetsgeometri är relevant när du slutför spetskalibrering under AFM-drift. God överenskommelse har iakttagits mellan beröringsfri och kontaktkalibrering. Om den valda AFM cantilever inte är rektangulär, kontaktkalibrering kommer att behöva utföras. Tänk på att det medium som spetsen är kalibrerad i måste vara samma som provmediet. Om dessa vätskor skiljer sig åt måste användaren kalibrera om. Vid användning av AFM-spetsarna i vätska bör frekvensen som mäts med systemet vara en fjärdedel till en tredjedel av den hos den naturliga resonansfrekvensen som tillverkaren betecknar. Ett bra sätt att kontrollera att systemet kalibrerat spetsen korrekt är att verifiera värden inom den termiska brusfilen som genereras. Se till att den här filen sparar till lämplig mapp. Om systemet har problem med att kalibrera eller icke-sannolika värden kommer ut, kalibrera om, eller justera laserpositionen något sedan kalibrera om.

En annan orsak till dålig summa signal kan bero på AFM cantilever anpassning. När AFM-chipet monteras i glasblocket är det väsentligt att spetsen på cantilever förblir inom det lilla laserfönstret (slät glasområde). Om chipet är för långt fram, vinkeln vid vilken cantilever naturligt vilar kan orsaka ett problem med reflektion av cantilever, saknas fotodetector och resulterar i dålig summa signal. Om chipet är för långt tillbaka, kommer lasern inte att kunna reflektera bort baksidan av cantilever, vilket orsakar dålig summa signal. Av dessa skäl kan det monterade AFM-chipet behöva justeras. Dessutom uppstår ett annat problem som kan påträffas med höjden på provet. AFM-instrumentet som används i detta protokoll har ett maximalt piezo z-intervall (höjd) på 15 μm. Om en användare finner att programvaran inte kan samla in höjddata och tvinga kartor i en viss pixel, kommer en svart ruta att visas som visar att systemet är utom räckhåll (Bild 2C). Ett sätt att besvära skjuta denna fråga är att ställa piezo höjd till ett lägre värde, såsom 2 eller 3 μm så de flesta av de 15 μm området har åtagit sig att kartlägga den förväntade höjden på cellen. Denna teknik bör, i de flesta cell- eller bakterierelaterade experiment, åtgärda problemet i samband med z-området.

Experimentalister som kräver ett utökat z-område för höga prover med höjder större än 10 – 15 μm kan behöva fullfölja ytterligare en modul på AFM. AFM tillverkare har detta alternativ tillgängligt till ytterligare kostnader för de flesta system. Genom att utöka z-sortimentet har experimentalisten tillgång att skanna prover som anses höga i mikroskalan med få problem för utom intervallet värden eller AFM piezo motor modifiering. Även om dessa moduler kostar extra, kan vissa, beroende på tillverkaren, erbjuda ytterligare höjd, upp till 100 μm i z-riktningen. Confocal är fortfarande möjligt med högre prover om användaren har en lång arbetsavstånd, hög förstoring mål eller är villig att använda en luft mål, kanske en 20x eller 40x. Genom att sänka mikroskop objektiv förstoring, arbetsavståndet ökar, få avstånd för att visa toppen av ett högre prov. Denna ändring till en lägre förstoring objektiv kommer att offra upplösning. I Conpokal setup som avses i detta manuskript, 60x TIRF (total intern reflektion fluorescens) mål har ett arbetsavstånd på nära 100 μm förbi täckskydd av glasbottnad prov skålen.

När det gäller det konfokalmikroskop som avses i detta manuskript diskuteras några viktiga bestämmelser. Det konfokala system som används för framställning av siffrorna i detta manuskript genomfört en 60x TIRF oljemål med en numerisk bländare på 1,49. Laserlinjer vid 405 nm, 488 nm och 561 nm excitationsvåglängder användes för levande cellprovavbildning, som visas i figur 3 och figur 4. Konfokalmikroskopets diffraktionsgräns kan fastställas genom att använda Abbe Resolution-ekvationen, Abbe Resolution(x,y) = λ/2NA, där λ är excitationsvåglängden för Alexa 488, vid 488 nm, och NA är den numeriska bländaren för konfokalkondensorn, som är 0,3. Därför bestäms en axiell upplösning på 272 nm. För epifluorescensavbildning anses två fall bestämma den upplösning där pinhole är inställd på en luftig enhet (AU) och 0,5 AU. I det senare fallet stängs pinhålet ner så att betydande ljusförlust uppstår, men upplösningen ökar. Konfokalprogramvaran beräknar laterala infödda och axiella infödda upplösningar vid 170 nm och 290 nm för pinhålet vid 0,5 AU, respektive 200 nm och 370 nm för pinhålet vid 1 AU. Sfäriska aberrationer som introduceras i systemet kan redovisas genom en deconvolution process för att öka kontrast och upplösning i mikroskop bilder. På grund av de diffraktionsbegränsningar som är inneboende med konfokalmikroskop saknar den konfokala bilden av bakteriekolonin i figur 6 den matchande upplösningen för den detalj som ses i AFM-skanningen av bakterier i figur 5. AFM ger tillgång till nanoskala funktioner och detaljer som är svåra att fånga med en confocal mikroskop. Beroende på den fluorescensupplösning som krävs visar dock figur 5 och figur 6 conpokal-teknikens tillämplighet på mikrober utöver eukaryota celler.

En fördel med att använda ett konfokalmikroskop gör det möjligt för operatören att samla in 3D-bilder av specifika regioner i ett prov med vässad detalj. Dessa bilder korrelerar med AFM genom att visa ytan som var probed via AFM bilden och en confocal skanning av samma region. Eftersom mikroskopet är inverterat, samlar en epifluorescensbild in ljusinformation från den motsatta sidan av provet som var sonderade. Pinhole inom confocal systemet hjälper begränsa till ett enda plan från ett visst avstånd samtidigt filtrera ut ljus som kommer från resten av provet eller ens rummet. I huvudsak hjälper pinhole isolera ljuset som kommer tillbaka från det enda planet av intresse i provet. Typiskt, detta plan av intresse måste innehålla starka fluorophore markörer eftersom, för inverterade confocal system, enda molekyl upptäckt skulle begränsas till högre upplösning confocal mikroskop. Epifluorescens belysning är mindre önskvärt på grund av det faktum att i epifluorescens imaging mode, alla ljus från provet som reflekteras in i målet samlas in och används för att generera bilden, därför omöjligt att isolera ett enda plan. Konfokala tekniker ger en mer isolerad enda plan bild av provet funktionen i fråga på grund av pinhole77. Om till exempel apex av en eukaryota cell är probed av AFM, samma yta kan isoleras med laserskanning confocal kapacitet mikroskopet, snarare än med epifluorescens imaging mode. Det rekommenderas att övervaka cellernas hälsa/form under datainhämtning via avbildning samtidigt i differensstörningskontrastläge med hjälp av den överförda ljusdetektorn och 488 nm laserlinjen. Vid fångning av en z-stack av provet, för det förfarande som beskrivs ovan, justeras endast detektorns vinst. Varje morfologisk förändring i cellerna under mätningen, som inte nödvändigtvis syns i de fluorescerande kanalerna, indikerar att artefakter införs i mätningen.

Idealiska avstånd mellan plan kan erhållas genom att följa programvarans rekommendation för den kortaste våglängd som används i avbildningstekniken. Den inhemska upplösningen och signalen till brus förhållandet i bilden volymerna kan effektivt förbättras genom att anställa deconvolution algoritmer som finns i bildbehandling modulen av förvärvet programvara. Men utför fluorescerande mikroskopi, urval av specifika fläckar och färgämnen är avgörande för att undvika tidig on-set blekning eller överhörning från överlappande excitation / utsläpp spektra. Ibland kan en användare uppleva ett fel i confocal ljus generation. Om en användare upplever brist på ljusemission eller felaktig laserlinjer, är ett sätt att felsöka att återställa systemet, vanligtvis gjort genom att starta om programvaran för drift. Om problemet kvarstår kan den överförda ljusdetektorn ha misslyckats med att flytta in i eller på sin plats inom ljusmikroskopets optiska väg. Återställa positionen för sändardetektorn kan bidra till att lindra ljusinsamling eller laseravbildningsproblem.

Conpokal-instrumentets fokus är att ge användarna möjlighet att samla in optisk och kraftbaserad information om levande biomaterial i en flytande miljö, samtidigt och på samma cell eller funktion. Detta arbete beskriver uttryckligen hur man utför dessa experiment i vätska, ett naturligt hem för många biomaterial, även om, torra experiment kan fortfarande utföras med hjälp av instrumenteringen. Med prover som tillagas i petriskålar är maträtthöjden en begränsning. På grund av konfigurationen av glasblocket som håller AFM cantilever, måste de sidoväggar av disken vara under 10 mm i höjd; om rätten är för hög kommer instrumentet inte att kunna sänka AFM-spetsen till provets eller substratets yta.

Även om det finns en begränsning för provstorlek, finns det ingen begränsning med instrumentet eller programvara kapacitet med avseende på en tidsfördröjning. Samtidig konfokal och AFM är möjligt med rätt faktorer på plats. Begränsningen som bidrar till dess nära samtidiga förmåga avser det buller som genereras när du utför vissa konfokala mikroskopifunktioner och atomkraftmikroskopifunktioner samtidigt. Vibrationerna från de motorer som flyttar mikroskopmålet under insamling av en z-stack kommer att läggas till signalen från AFM-sondspetsen under dess rörelse. Bullret kommer att förstärkas genom ett oljemål, eftersom motorerna rör sig upp och ner i z-riktningen för att belysa sekventiella plan i provet. Därför innehåller det rekommenderade protokollet sekventiell samling afm-skanningar och confocal z stack bilder. Samtidig CLSM och AFM skulle kräva stationär bildbehandling med confocal, men med den nuvarande tekniken, fördröjningstiden för de två instrumenten kan vara så kort som tiotals sekunder. Den faktiska tiden för att byta från AFM-drift till konfokal avbildning var runt 2 – 4 minuter för bilderna som samlats in i figur 2A och figur 4B. Detta värde bestämdes genom att subtrahera de två tidsperioderna för bildinsamling från den totala tiden på 33 minuter, vilket inkluderar tiden för att börja och slutföra AFM-skanningen, växelinstrumentlägen för att aktivera konfokal avbildning och börja och slutföra konfokalbilden z-stacken.

Framtiden för Conpokal syftar till att utforska nya struktur-funktion relationer förutom angelägen insikt i encelliga processer. Till exempel, experiment av in situ läkemedelsbehandlingar på cell-eller bakterieprover för att bestämma effekterna av cellelasticitet skulle vara ett framsteg till områdena biomaterial, biologi och biomekanik. Behandling terapi i provet skålen medan imaging och sondering skulle ge kunskap om hur provet svarar på therapeutics i en levande och noggrant kontrollerad miljö, över tiden. Att införliva en ny drog- eller miljöutmaning skulle bredda förståelsen för hur cytoskelettet eller organellens plats påverkar förflyttning, topologi, styvhet etc. En annan potentiell avancemang av Conpokal är möjligheten att ha fullständig miljökontroll av systemet. Den nuvarande Conpokal som nämns i detta protokoll är inrymt inuti en akustisk kapsling utformad för att minska buller från insidan av laboratoriet. Avancemang av detta hölje skulle ge möjlighet att testa inom, kanske, en eller en kombination av faktorer, inte begränsat till sådana som en steril miljö, temperaturkontrollerad, eller ens variabel-gravitation. Som det ser ut, conpokal metoden ger ett effektivt och användbart tillvägagångssätt för att karakterisera levande, i-flytande biomaterial, men framtiden för tekniken kommer bara att föra dessa möjligheter vidare.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner NIH COBRE finansiering under nummer P20GM130456. Vi tackar Storbritannien Light Microscopy Core, som stöds av Vice President for Research, för hjälp i detta arbete. Stammar av S. mutans och E. faecalis tillhandahölls av Dr Natalia Korotkova. Det första omnämnandet av play-on-words, Conpokal, för att beskriva kombinationen av konfokalmikroskopi och atomkraftmikroskopi tillskrivs Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, vid University of Kentucky, i diskussion med Dr. Martha Grady (motsvarande författare) i väntan på ankomsten av en seminarietalare Dr. Jonathan Pham, som gick med i fakulteten i kemi- och materialteknik vid University of Kentucky hösten 2017.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602 (2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102 (2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102 (2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809 (2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9 (2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101 (2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429 (2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564 (2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54 (2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011 (2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427 (1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236 (2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546 (2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Tags

Bioengineering confocal microscopy atomkraftmikroskopi AFM conpokal bakterier cellbiologi biomaterial levande cellavbildning mekanobiologi
Nära Samtidig Laserscanning Confocal och Atomic Force Mikroskopi (Conpokal) på levande celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter